CC BY
48
© Коллектив авторов, 2020
Гурьянова С.В.1 2, Гапонов А.М.3' 4, Писарев В.М.3 4,
Якушенко Е.В.3, Тутельян А.В.5, Александров И.А.3,
Цыпандина Е.В.4, Козлов И.Г.3, 6
Глюкозаминилмурамилдипептид-кислота (ГМДП-А) модулирует внутриклеточные сигнальные пути натуральных киллерных клеток
1 Федеральное государственное бюджетное учреждение науки «Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова» Российской академии наук, Министерство науки и высшего образованиия Российской Федерации, 117997, г. Москва, Российская Федерация
2 Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования «Российский университет дружбы народов» Министерства науки и высшего образования Российской Федерации, Медицинский институт, 117198, г. Москва, Российская Федерация
3 Федеральное государственное бюджетное учреждение Национальный медицинский исследовательский центр детской гематологии, онкологии и иммунологии им. Д. Рогачева Министерства здравоохранения Российской Федерации, 117198, г. Москва, Российская Федерация
4 Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Федеральный научно-клинический центр реаниматологии и реабилитологии» Министерства здравохранения Российской Федерации, 141534, г. Москва, Российская Федерация
5 Федеральное государственное бюджетное учреждение науки «Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, 111123, г. Москва, Российская Федерация
6 Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования «Балтийский федеральный университет им. Э. Канта» Министерства науки и высшего образования Российской Федерации, 236041, г. Калининград, Российская Федерация
Резюме
Введение. Лекарственные препараты на основе производных мурамилпептидов на протяжении нескольких десятилетий являются объектом экспериментальных и клинических исследований. Внутриклеточный МОБ2-рецептор, ответственный за связывание мурамилдипептида и его производных, остается привлекательной молекулярной мишенью для разработки новых лекарственных средств с известным механизмом действия. Одним из лигандов NOD2 является глюкозаминилмурамилдипептид-кислота (ГМДП-А). В работе впервые исследованы сигнальные механизмы, инициированные в НК-клетках с помощью ГМДП-А.
Материал и методы. Изолированные с помощью магнитной сепарации НК-клетки, выделенные из периферической крови здоровых доноров, инкубировали с 10 мкг/мл ГМДП-А в течение 6 и 16 ч. Уровень экспрессии генов определяли, используя набор Illumina HumanHT-12v4 Expression BeadChip на приборе «Ilumina iScan (Illumina, США). Данные статистически обрабатывали с помощью пакета прикладных программ (v 2011.1, Illumina).
Результаты. Обнаружено, что ГМДП-А усиливает транскрипцию ряда генов, продукты которых участвуют в трансдукции сигналов с рецепторов, тем самым обеспечивая поддержание функциональной активности НК-клеток. ГМДП-А индуцирует синтез транскриптов МАРК-сигнального пути, сигнальных медиаторов VAV2, сигнального адаптера CRKL, усиливает синтез транскриптов генов регуляторной субъединицы 3(у) фосфоинозитид-3-киназы и фосфолипазы С В1, контролирующих обмен фосфолипи-дов, активирует клетки организма при дефектах клеточного звена иммунитета. ГМДП-А значительно повышает уровень экспрессии следующих ключевых генов, связанных с контролем механизмов прямой и антителоопосредованной цитотоксической активности НК-клеток: CRKL, VAV2, ZAP70, RAP1A, PLCB1, FCGR3A, семейство MAPK, IFNA1, TNFRSF9, TNFSF14.
Заключение. Экспериментальные данные позволяют заключить, что ГМДП-А может быть эффективным средством противодействия ранним этапам онкогенной и вирусной трансформации НК-клетками, ключевыми клетками врожденного иммунитета.
Для корреспонденции
Гурьянова Светлана Владимировна -кандидат биологических наук, научный сотрудник ИБХ РАН, Москва, Российская Федерация E-mail: svgur@mail.ru https://orcid.org/0000-0001-6186-2462
Ii/-
Ключевые слова: натуральные киллерные клетки; глюкозаминилмурамилдипептид-кислота; транскриптом; МАРК-сигнальный путь; интерферон; противоинфекционный иммунитет; противоопухолевый иммунитет
Статья поступила 05.03.2020. Принята в печать 16.04.2020.
Для цитирования: Гурьянова С.В., Гапонов А.М., Писарев В.М., Якушенко Е.В., Тутельян А.В., Александров И.А., Цыпандина Е.В., Козлов И.Г. Глюкозаминилмурамилдипептид-кислота (ГМДП-А) модулирует внутриклеточные сигнальные пути натуральных киллерных клеток. Иммунология. 2020; 41 (3): 235-248. DOI: 10.33029/0206-4952-2020-41-3-235-248
Финансирование. Исследование не имело спонсорской поддержки. Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Guryanova S.V.1' 2, Gaponov A.M.3' 4, Pisarev V.M.3' 4, Yakushenko Е.V.3,
Tutelyan A.V.5, Alexandrov I.A.3, Tsipandina E.V.4, Kozlov I.G.3' 6
Glucosaminylmuramyl dipeptide acid (GMDP-A) modulates intracellular signaling pathways in natural killer cells
1 Shemyakin-Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry of Russian Academy of Sciences, Ministry of Science and High Education of Russian Federation, 117997, Moscow, Russian Federation
2 Peoples' Friendship University of Russia (RUDN University), Medical Institute, Ministry of Science and High Education of Russian Federation, 117198, Moscow, Russian Federation
3 Dmitry Rogachev National Medical Scientific Center of Pediatric Hematology, Oncology and Immunology, Ministry of Healthcare of Russian Federation, 117198, Moscow, Russian Federation
4 Federal Scientific and Clinical Center of Intensive Care Medicine and Rehabilitation, Ministry of Healthcare of Russian Federation, 141534, Moscow, Russian Federation
5 Central Research Institute of Epidemiology, Federal Service for Surveillance on Consumer Rights Protection and Human Wellbeing (Rospotrebnadzor), 111123, Moscow, Russian Federation
6 Immanuel Kant Baltic Federal University, Ministry of Science and High Education of Russian Federation, 236041, Kaliningrad, Russian Federation
Abstract
Introduction. Medicines developed as derivatives of muramyl peptides have been the subject of experimental and clinical studies for several decades. The intracellular NOD2- receptor responsible for the binding of muramyl dipeptide and its derivatives remains an attractive molecular target for the development of new drugs with a known mechanism of action. GMDP-A belongs to one of the NOD2-receptor ligands. In this study signaling mechanisms initiated by GMDP-A were characterized for the first time in natural killer (NK) cells.
Material and methods. NK cells isolated by magnetic separation from peripheral blood of healthy donors were incubated with 10 ^g/ml GMDP-A for 6 hours and 16 hours. The levels of genes expression were determined using the Illumina HumanHT-12v4 Expression BeadChip kit and Illumina iScan instrument (Illumina, USA). The data were statistically processed using an application software package (v 2011.1, Illumina).
Results. It was found that GMDP-A enhanced the transcription of a number of genes associated with transduction of signals from receptors, thereby ensuring the maintenance of the functional activity of NK cells. GMDP-A induced the synthesis of transcripts of the MAPK signaling pathway, VAV2 signal mediators, the CRKL signal adapter, enhanced the synthesis of transcripts of the regulatory subunit 3 (y) phosphoinositide-3-kinase and phospholipase C B1 genes that control phospholipid metabolism, activated the cells with defects in the cellular immunity link. GMDP-A significantly increases the expression level of the following key genes associated with the control of the mechanisms of direct and antibody-mediated cytotoxic activity of NK cells: CRKL, VAV2, ZAP70, RAP1A, PLCB1, FCGR3A, the MAPKfamily, IFNA1, TNFRSF9, TNFSF14.
Conclusion. Experimental data justify the high potential of the GMDP-A to counteract altered recognition of the early stages of oncogenic and viral transformation by key cells of the innate immunity, the NK cells.
Keywords: natural killer cells; glucosaminyl muramyl dipeptide acid; transcriptome; MAPK signaling pathway; interferon; anti-infection immunity; anti-tumor immunity
Received 05.03.2020. Accepted 16.04.2020.
For citation: Guryanova S.V., Gaponov A.M., Pisarev V.M., Yakushenko E.V., Tutelyan A.V., Aleksandrov I.A., Tsipan-dina E.V., Kozlov I.G. Glucosaminylmuramyl dipeptide acid (GMDP-A) modulates the intracellular signaling pathways of natural killer cells. Immunologiya. 2020; 41 (3): 235-48. DOI: 10.33029/0206-4952-2020-41-3-235-248 (in Russian)
Funding. The study had no sponsor support.
Conflict of interests. The authors declare no conflict of interests.
For correspondence
Svetlana V. Guryanova -PhD, Research Scientist, Shemyakin-Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry of Russian Academy of Sciences, Moscow, Russian Federation E-mail: svgur@mail.ru https://orcid.org/0000-0001-6186-2462
Введение
Одно из мировых направлений разработок лекарственных средств с противоопухолевой активностью -препараты на основе производных мурамилпептидов (МП), обладающих целым рядом преимуществ: известным механизмом действия и наличием специфического рецептора; относительно небольшим размером молекул (менее 1 кДа), которые могут быть получены синтетическим путем; малой токсичностью и отсутствием тяжелых побочных эффектов; относительно невысокой стоимостью производства субстанции и конечного продукта. МП являются минимальными структурными компонентами пептидогликана клеточной стенки всех известных бактерий, реализующих свою биологическую активность посредством связывания со специфическими NOD-рецепторами, локализованными внутри клеток. NOD-рецепторы относятся к NLR (NOD-like receptor) - семейству рецепторов врожденного иммунитета. Их связывание с МП приводит к активации NF-kB-сигнального пути и, как следствие, к синтезу цитокинов, которые активируют функции клеток противоинфекци-онной и противоопухолевой защиты, а также гемопоэз. Белки NOD экспрессируются главным образом иммунными клетками, в том числе макрофагами, гранулоци-тами, дендритными клетками и натуральными киллер-ными (НК)-клетками, а также и различными типами неиммунных клеток.
Глюкозаминилмурамилдипептид-кислота (ГМДП-А) -модифицированный аналог ГМДП, который является субстанцией лекарственного средства Ликопид® (АО «Пептек», Российская Федерация) и более 25 лет используется в качестве лекарственного средства для коррекции иммунодефицитных состояний [1-3]. ГМДП-А имеет ряд преимуществ в сравнении с ГМДП - менее выраженная пирогенность, широкий диапазон активных концентраций [4] и увеличенный период полувыведения, что расширяет его терапевтические возможности и позволяет использовать в виде инъекционной лекарственной формы. Научный и практический интерес представляет исследование влияния ГМДП-А на функционирование НК-клеток для определения дальнейших стратегий и способов применения ГМДП-А в качестве лекарственного средства.
НК-клетки - одни из ключевых клеток иммунной системы, они имеют решающее значение в иммунном ответе на возбудителей инфекции и злокачественные опухоли. НК-клетки дифференцируются из общего для Т- и В-клеток лимфоидного предшественника, но в отличие от последних, высвобождают цитотоксические эффекторные молекулы непосредственно при встрече с инфицированной или трансформированной клеточной мишенью. НК-клетки, обнаруженные более 40 лет назад, являются крупными гранулярными лимфоцитами, способными убивать клетки-мишени без предварительной сенсибилизации, не затрагивая при этом здоровые аутологичные клетки. НК-клетки относят к системе врожденного иммунитета, поскольку при их созревании не происходит перестройки генов рецепторного аппа-
рата. НК-клетки распознают своими рецепторами молекулы MHC I класса, в норме представленные на всех ядросодержащих клетках. В инфицированных и опухолевых клетках молекулы MHC I класса отсутствуют или трансформированы, что является необходимым, но недостаточным сигналом для цитотоксического действия НК. Для уничтожения собственных измененных клеток организма, кроме отсутствия молекул MHC I класса, необходимо дополнительное распознавание НК-клетками молекул, индуцируемых клеточным стрессом, появляющихся в процессе малигнизации или инфицирования [5]. Распознавание НК-клетками молекул MHC I класса на аутологичных нормальных клетках происходит с помощью нескольких типов рецепторов: так называемых ингибиторных Ig-подобных рецепторов (KIR), Ig-подобных рецепторов лейкоцитов подсемейства B1 (LILRB1) и лектиновых рецепторов типа С - гетеро-димерного комплекса CD94-NKG2A. Взаимодействие этих рецепторов с нормальными молекулами MHC I приводит к генерации ингибирующих сигналов, предотвращающих уничтожение аутологичных здоровых клеток. Инфицированные и опухолевые клетки часто подавляют экспрессию молекул MHC I класса, чтобы избежать узнавания цитотоксическими Т-лимфоцитами (ЦТЛ), но это приводит к их уязвимости перед НК-клетками. В этом случае НК-клетки взаимодействуют с клетками-мишенями с недостаточной экспрессией молекул МНС I класса, а их специфические ингибиру-ющие рецепторы не могут распознавать свои лиганды, следствием чего является активация НК-клеток через их активирующие рецепторы с последующим уничтожением клеток-мишеней. Таким образом, НК-клетки могут эффективно уничтожать опухолевые и инфицированные клетки, которые перестали экспрессировать молекулы МНС I класса [6]. Активирующими рецепторами являются рецепторы цитотоксичности (NKp46, NKp44), лектиновые рецепторы типа С (NKG2D, CD94-NKG2C) и Ig-подобные рецепторы (2В4). Каждая НК-клетка обычно экспрессирует от двух до четырех инги-бирующих рецепторов в дополнение к многочисленным рецепторам активации. Популяция НК-клеток в значительной степени гетерогенна, поскольку НК-клетки экспрессируют различные комбинации ингибирующих или активирующих рецепторов. Многообразие таких комбинаций определяет способность НК-клеток реагировать на различные стимулы и участвовать в иммунных ответах при различных патологических процессах. Кроме ингибирующих и активирующих рецепторов, НК-клетки несут на поверхности рецепторы цитоки-нов, гормонов и нейромедиаторов. Такой широкий набор рецепторов позволяет НК-клеткам первыми воспринимать сигналы об инфицировании вирусами или опухолевой трансформации клетки на ранних стадиях и уничтожать пораженную клетку, предотвращая тем самым дальнейшее развитие патологического процесса или распространение патогена.
НК-клетки классифицируют на две подгруппы в зависимости от их фенотипа и функций: CD56dim и CD56blight.
CD56dim составляют 90 % общей популяции НК-клеток в периферической крови и экспрессируют низкоаффинный рецептор Fc-фрагмента IgG - FcRIIIa/CD16a. Функционально CD56dim обладают высокой цитоток-сичностью. Примерно 10 % НК-клеток принадлежат к CD56bгight-клеткам, преимущественно участвующим в продукции цитокинов. НК-клетки вторичной лимфо-идной ткани (миндалины, лимфатические узлы и селезенка) отличаются от НК-клеток в периферической крови, так как они активируются дендритными клетками и секретируют цитокины, например, интерферон (ИФН), который стимулирует ЦТЛ-ответ [7].
Лизис клеток-мишеней НК-клетками преимущественно обеспечивается перфорином, гранулизином и гранзимами - белками, которые хранятся в так называемых литических гранулах, а при взаимодействии НК-клетки с клеткой-мишенью выбрасываются в результате дегрануляции. Гранзимы, попав при помощи перфорина в цитозоль клетки-мишени, индуцируют ее апоптоз. Меньший вклад в киллерную функцию НК-клеток вносят поверхностные молекулы семейства фактора некроза опухолей (ФНО), например FasL/CD178 и TRAIL/CD253, которые вызывают рецептор-зависимый апоптоз мишеней. Мишенями НК-клеток могут являться не только эукариотические клетки. Показано, что секретируемые НК-клетками гранзимы способны индуцировать микроптоз - процесс, подобный апопотиче-ской гибели, - в бактериальных клетках (E. coli), паразитах (Trypanosoma cruzi, Toxoplasma gondii, L. major), тогда как гранулизин, нарушая мембрану микроба, способствует его некрозоподобной гибели [8]. 90 % НК-клеток экспрессируют рецепторы практически для всех цитокинов. Наиболее значимыми для активации НК-клеток являются рецепторы ИФН-а и интерлейкинов (ИЛ)-12, ИЛ-15 и ИЛ-18. Во время дифференцировки НК-клеток экспрессия некоторых цитокиновых рецепторов может уменьшаться. В то же время дифференци-ровка НК-клеток не влияет на стабильную экспрессию ими ИФН-у.
Функциональная классификация биологических процессов и анализ генной онтологии (GO) показали, что гены, связанные с реализацией иммунных функций НК-клеток, составляют около 7 %, в то время как гены, связанные с клеточными и метаболическими процессами жизнеобеспечения, составляют большинство дифференциально экспрессируемых генов - 31 %. В связи с этим представляет интерес исследование экспрессии генов не только рецепторных структур и секретируемых цитокинов, но и генов белков метаболических путей, изменяющихся при действии МП.
Цитозольные Crk и Crk-подобные (CrkL - Crk-like) факторы являются членами семейства, связывающими тирозин-фосфорилированные белки с широко экспрес-сируемыми адаптерами, которые взаимодействуют с различными белками для выполнения ключевых ролей в путях сигнальной трансдукции, запускаемых активацией рецепторных и нерецепторных тирозинкиназ. Фактор Crk рекрутирует к цитоплазматической мем-
бране белки, участвующие в передаче сигнала, CrkL активирует сигнальные пути Ras- и Jun-киназ, является субстратом тирозинкиназы BCR-ABL и контролирует функцию НК-клеток посредством регуляции накопления активирующих рецепторов и фосфорилированных молекул Vav-1 в иммунологических синапсах [9]. Таким образом, Crk и CrkL играют критическую роль в клеточной структуре и подвижности, поддерживают целостность цитоскелета, регулируют цитотоксические функции, а также синтез цитокинов, в частности - ИФН-у.
Тирозинкиназа Fyn семейства Src участвует в регуляции клеточного роста и в перфорин-зависимом уничтожении инфицированных клеток НК-клетками [10]. Нерецепторные тирозинкиназы Syk и Zap-70 являются членами семейства тирозинкиназ SYK. Эти цитоплазма-тические тирозинкиназы имеют общий двойной домен SH2, разделенный линкерным доменом. Активация Syk в меньшей степени зависит от фосфорилирования кина-зами семейства Src, чем ZAP-70. Syk и Zap-70 передают сигналы от поверхностных рецепторов, включая CD74, Fc-рецептор и интегрины. Активация Syk происходит посредством связывания двух доменов SH2 с ITAM (Im-munoreceptor tyrosine-based activation motif), остатки тирозина фосфорилируются киназами семейства Src. Связывание с фосфорилированным ITAM освобождает Syk от внутримолекулярного аутоингибирования и запускает его ассоциацию с рецепторными сигнальными молекулами, опосредованную ITAM-содержащим адаптером.
Малая ГТФаза RAC1 участвует в разнообразных динамических клеточных биологических процессах, включая пролиферацию клеток, выживание клеток, межклеточные контакты, эпителиально-мезенхималь-ный переход (EMT), подвижность клеток и инвазив-ность. Эти процессы организуются посредством тонкой настройки активности RAC1 с помощью рецепторов и эффекторов клеточной поверхности, которые регулируют циклический переход RAC1-GDP (в выключенном состоянии)/RAC1-GTP (во включенном состоянии). RAC1 инициирует серию сигнальных сетей, включая регуляторный комплекс ремоделирования актинового цитоскелета, активацию протеинкиназ (PAKs, MAPKs) и факторов транскрипции (NF-kB, Wnt/p-catenin/TCF, STAT3, Snail), продукцию реактивного кислорода (NADPH-оксидазы, митохондриальные АФК). Таким образом, эта ГТФаза может проявлять воздействие на разных стадиях прогрессирования опухоли от диспла-зии до метастатического каскада [11].
RAP-белки (RAP1, RAP2A, B, C) являются низкомолекулярными ГТФазами семейства RAS. Через различные сигнальные пути они опосредуют клеточную адгезию, пролиферацию, активацию генов и другие клеточные события. Активация RAP-сигнала жестко регулируется несколькими специфическими регуля-торными белками, включая факторы обмена гуани-новых нуклеотидов и белки, активирующие ГТФазы. В иммунной и гемопоэтической системах RAP-сигнал играет решающую роль в развитии и функционирова-
нии практически всех линий лимфоцитов и гемопоэти-ческих клеток. Важно отметить, что, нарушение регуляции RAP-сигнала может приводить к патологическим состояниям, в том числе лейкозам и аутоиммунным реакциям. Транслокация в ядро активных ГТФ-форм этих белков обнаружена при различных онкологических заболеваниях, в том числе при плоскоклеточном раке. Регуляция RAP-сигналов предоставляет потенциальную возможность контроля заболеваний человека, в том числе злокачественных [12].
Белки семейства Vav являются факторами обмена гуаниновых нуклеотидов для семейства Rho/Rac малых ГТФ-связывающих белков. Кроме того, они имеют домены, которые опосредуют белок-белковые взаимодействия, включая один Sffi-домен и два Sffi-домена. Vavl, Vav2 и Vav3 играют решающую роль в регуляции изоформ фосфолипазы Cy (PLC gamma) с помощью рецепторов, связанных с ITAM, который активирует пути, ведущие к связанной с белком актином цитоскелетной перестройке и транскрипционным изменениям [13].
Ген PLCB1 кодирует 1-фосфатидилинозитол-4,5-бисфосфат-фосфодиэстеразу b-1 - фермент, который катализирует образование инозитол-1,4,5-трифосфата и диацилглицерина из фосфатидилинозитол-4,5-бис-фосфата. Эта реакция использует кальций в качестве кофактора и играет важную роль во внутриклеточной трансдукции многих внеклеточных сигналов.
Фосфоинозитид-3-киназы PI3K осуществляют обмен фосфата в инозитол-фосфолипидах в составе плазматической мембраны и координирует выживание, пролиферацию и миграцию НК-клеток [14]. PIK3R1 и PIK3R3 являются изоформами регуляторных субъединиц фосфоинозитид-3-киназы PI3K3 класса I, регулирующих каталитическую субъединицу PI3K3-комплекса в клетках, включая трансформированные НК-клетки. Другая субьединица - PIK3C2G - фосфатидилинозитол-4-фосфат-3-киназа, каталитическая субъединица типа 2у, входящая в состав комплекса PI3K3 класса II, в отличие от широко представленных в различных тканях белков PI3K3 класса I и других белков класса II экс-прессируется преимущественно в ограниченных ком-партментах - печени, поджелудочной железе, молочной железе, тонком кишечнике, предстательной железе. Известно об этой форме мало, однако единичные данные показали, что PIK3C2G экспрессируется в эндосомах и участвует в контроле клеточного метаболизма [15]. Данных об экспрессии этой формы белков PI3K3 в НК-клетках нет.
Продукты генов FCGR принадлежат к трем группам рецепторов: рецептор с высоким сродством (FCGR1) и две группы рецепторов с низким сродством (FCGR2 и FCGR3). У человека ген FCGR3A кодирует Fc-рецептор IIIa с низкой аффинностью (CD 16a), являющийся частью кластера дифференцировки - молекулярного комплекса клеточной поверхности. Молекула CD16 является одним из наиболее мощных активацион-ных рецепторов НК-клеток и представляет собой трансмембранный белок суперсемейства иммуноглобулинов.
У человека CD16 является низкоаффинным рецептором Fc-фрагментов антител субклассов IgG1 и IgG3. Существуют две изоформы этого антигена - CD16a (FCGR3A) и CD 16b (FCGR3B), причем НК-клетки экспресси-руют только первую из них. Антитела субклассов IgG1 и IgG3 играют роль опсонинов, своими Fab-фрагментами взаимодействуя с поверхностными антигенами клеток-мишеней, а Fc-фрагментами - с CD 16, что индуцирует литическую атаку НК-клеток против мишеней, покрытых антителами, в реакции антитело-зависимой клеточно-опосредованной цитотоксичности (АЗКЦ). Активационный сигнал от CD 16 передается через Src-киназы, которые фосфорилируют ITAM-мотивы адапторных белков CD3Z, и FcsRy, которые, в свою очередь, привлекают и активируют тирозинки-назы Syk и Zap-70. Мутации гена FCGR3A вызывают дефицит НК-клеток и ассоциированы с онкогенными вирусными инфекциями, которые могут способствовать развитию рака [16]. Генетический полиморфизм FC-GR3A ассоциируется с чувствительностью к блокаторам ФНО при спондилоартрите, псориазе и болезни Крона [17]. Оценка экспрессии данного гена в НК-клетках имеет большое значение в диагностике, а также в профилактике и терапии аутоиммунных и онкологических заболеваний.
Фосфатидилинозитол-специфические ферменты фос-фолипазы С (ß и у) катализируют гидролиз фосфолипи-дов. Они активируются рецепторными и нерецептор-ными тирозинкиназами и являются наиболее известными фосфолипазами по их роли в передаче сигналов липидов и пролиферации клеток.
ИФН представляют собой семейство цитокинов с мощными противовирусными, антипролифератив-ными и иммуномодулирующими свойствами. На основании их взаимодействия с конкретным рецептором клеточной поверхности различают три основных типа ИФН: I, II и III. У человека существует 13 различных генов, кодирующих ИФН-а, обозначаемых как IFNA1, IFNA2, IFNA4, IFNA5, IFNA6, IFNA7, IFNA8, IFNA10, IFNA13, IFNA14, IFNA16, IFNA17 и IFNA21 [18].
Члены семейства белков передачи сигналов и активаторов транскрипции STAT участвуют в регуляции транскрипции и способны значительно изменять процессы пролиферации, апоптоза и дифференцировки клеток. В основном они активируются мембранными рецептор-ассоциированными киназами Janus (JAK). Нарушение этого пути часто наблюдается в первичных опухолях и приводит к усилению ангиогенеза, что повышает выживаемость опухолей и иммуносупрессию. Исследования с использованием нокаута генов доказали, что белки STAT участвуют в развитии и функционировании иммунной системы и играют роль в поддержании иммунной толерантности [19].
Еще одна группа участников сигнальных механизмов пострецепторного этапа передачи - это митоген-активируемые протеинкиназы (МАРК), первоначально называемые ERK, которые представляет собой цепочку регуляторных белков в клетке. По этой цепочке пере-
дается сигнал от рецептора на поверхности мембраны клетки в ядро с последующей активацией транскрипции. Белки сигнального пути регулируют активность друг друга путем присоединения фосфатных групп к соседнему белку (фосфорилирование белка), «включая» или «выключая» его таким образом. Мутация одного из белков МАРК-пути разрушает правильное прохождение сигнала от рецептора и провоцирует развитие многих видов рака [20].
Семейство ФНО объединяет целый ряд различных трансмембранных белков с гомологичным доменом ФНО. Основная роль ФНО заключается в регуляции иммунных клеток, влиянии на липидный метаболизм и коагуляцию, устойчивость к инсулину, функционирование эндотелия, стимуляцию провоспалительных цитокинов, ИФН-у. Молекулы семейства ФНО и их рецепторы относят к важнейшим факторам врожденного иммунитета, защищающим от внутриклеточных паразитов, вирусов и трансформированных клеток [21]. Имеются данные о том, что один из механизмов противоопухолевого дейстия НК-клеток связан с эффектами их мем-браноассоциированных или секретируемых молекул ФНО и ИФН-у, обеспечивающих ремоделирование микроокружения опухоли и дифференцирование клеток рака [22].
Эффекторные функции НК-клеток во многом зависят от активации/деактивации многочисленных внутриклеточных протеинкиназ путем их фосфорилирования/ дефосфорилирования, трансдукции сигнала от рецепторов через цитозольные белки в ядро при участии тиро-зинкиназ, фосфолипаз, адаптерных белков [9, 10]. Поэтому исследования, направленные на выяснение того, какие именно сигнальные механизмы активируются при действии ГМДП-А на НК-клетки, помогут оценить потенциал препарата как регулятора дифференцировки и созревания НК-клеток, их цитотоксической и секреторной активности.
Материал и методы
Мурамилпептид. М-ацетил-В-глюкозаминил-(Ь1 ^4)-М-ацетилмурамил-Ь-аланил-Б-изоглютаминовая кислота (ГМДП-А) был синтезирован в компании АО «Пеп-тек» (Российская Федерация) согласно разработанным ранее методам [23, 24].
Выделение моноцитов периферической крови здоровых доноров. Мононуклеарные клетки (МНК) получали из периферической крови условно здоровых добровольцев мужского пола в возрасте от 24 до 35 лет. Образцы крови были получены из отделения транс-фузиологии НМИЦ «ДГОИ им. Дмитрия Рогачева» Минздрава России (Москва) после предварительного тестирования в соответствии с протоколом заготовки препаратов донорской крови.
Венозную кровь, стабилизированную К3ЭДТА, смешивали с равным объемом фосфатного буфера, наслаивали на градиент плотности фиколла-верографина (1,077) и центрифугировали 25 мин при 1000g при комнатной температуре. После окончания центрифугирова-
ния клетки, собранные на границе градиента плотности, ресуспендировали в среде RPMI-1640 без сыворотки и центрифугировали 8 мин при 200g. Процедуру повторяли еще дважды. Выделенные и отмытые МНК ресуспендировали в среде RPMI-1640, содержащей 2 мМ L-глутамина, 10 % эмбриональной телячьей сыворотки (Hyclone Laboratories, Inc., США) и 40 мкг/мл гентами-цина (полная среда), после чего подсчитывали в камере Горяева.
Выделение НК-клеток из МНК методом магнитной сепарации. Фракцию НК-клеток выделяли из МНК с помощью магнитной сепарации, используя МНК и наборы NK Cell Isolation Kit, Human (Miltenyi Biotec, Германия) согласно инструкции производителя. Выделенные клетки осаждали центрифугированием при 200g в течение 8 мин. Осадок клеток ресуспендиро-вали в полной среде RPMI-1640, подсчитывали и вносили в лунки 24-луночного планшета в концентрации 5*105 клеток на 1 мл полной среды. С помощью проточной цитофлуориметрии установили, что чистота выделенной популяции НК-клеток (CD3CD19CD56+) составляла 95 %.
ГМДП-А вносили в объеме не более 1 % от общего объема среды культивирования в концентрации 10 мкг/мл. В контрольные лунки вносили эквивалентный объем полной среды. После внесения препарата клетки инкубировали при 37 °С в атмосфере, содержащей 5 % СО2, в течение 6 и 16 ч.
Выделение РНК и реакция обратной траскрип-ции. По окончании культивирования из лунок осторожно удаляли 0,4 мл среды культивирования и добавляли 0,8 мл Trizol Reagent (Invitrogen, США). Далее следовали протоколу производителя. Сразу после выделения суммарной РНК проводили реакцию обратной транскрипции с использованием набора Ambion Total-Prep cRNA Amplification Kit (Invitrogen, США) согласно прилагаемого к набору протокола.
Исследование экспрессии генов. Уровень экспрессии генов исследовали с использованием набора Illumina HumanHT-12v4 Expression BeadChip на приборе Illumina iScan (Illumina, США) согласно протоколу производителя. Статистическую обработку данных проводили с помощью пакета прикладных программ Genome Studio software (v 2011.1, Illumina, США). Гены и их условные обозначения представлены в табл. 1.
Результаты
Исследована экспрессия 48 генов, ответственных за синтез цитокинов, мембранных рецепторов, адап-терных белков, регулирующих клеточный метаболизм в НК-клетках, изолированных из МНК 5 доноров. Результаты сравнения уровней экспрессии генов в образцах НК-клеток человека, подвергшихся в течение 6 и 16 ч (экспериментальная группа) и не подвергшихся (контрольная группа) воздействию ГМДП-А, представлены в табл. 2.
Как видно на рис. 1, экспрессия гена CRKL под действием ГМДП-А достоверно повышается на 48-70 %
Таблица 1. Описание исследованных генов
Ген Описание кодируемого продукта
CRK Член семейства белков, связывающих тирозинфосфорилированные белки
CRKL Crk-подобный белок - субстрат тирозинкиназы BCR-ABL
FYN Тирозинкиназа семейства Src
SYK Нерецепторная тирозинкиназа
ZAP70 Ассоциированная с Z-цепью (TCR) протеинкиназа 70 кДа
RAC3 Малый ГТФ-связывающий белок семейства Rho
RAC2 Малый ГТФ-связывающий белок семейства Rho
RAC1 Малый ГТФ-связывающий белок семейства Rho
RAP1A Член семейства Ras малых ГТФ-связывающих белков
RAPGEF1 Фактор обмена Rapan-гуаниновых нуклеотидов (GEF) 1
RAP2A RAP2A, член семейства онкогенов РАН
VAV1 Vav-1 - фактор обмена гуаниновых нуклеотидов
VAV2 Vav-2 - фактор обмена гуаниновых нуклеотидов
VAV3 Vav-3 - фактор обмена гуаниновых нуклеотидов
PLCB1 Фосфолипаза С, pi (фосфоинозитид-специфичная)
FCGR3A FcRIIIa, рецептор Fc-фрагмента IgG, низкое сродство (CD16a)
PLCG1 Фосфолипаза С, у 1
PLCG2 Фосфолипаза С, у 2
PIK3R3 Фосфоинозитид-3-киназа, регуляторная субъединица 3 (у)
PIK3R1 Фосфоинозитид-3-киназа, регуляторная субъединица 1 (а)
PIK3C2G Фосфатидилинозитол-4-фосфат-3-киназа, каталитическая субъединица типа 2у
IFNA1 ИФН-а1
IFNA6 ИФН-а6
IFNAR1 Рецептор ИФН (а, p и ш) 1
IFNA21 ИФН-а21
STAT2 Преобразователь сигнала и активатор транскрипции 2, 113 кДа
STAT5A Преобразователь сигнала и активатор транскрипции 5А
STAT6 Преобразователь сигнала и активатор транскрипции 6, индуцированный ИЛ-4
MAPK8IP1 MAPK 8, взаимодействующий белок 1
MAP2K7 MAPK-киназа 7
MAP4K2 MAPK-киназа 2
MAP3K6 MAPK-киназа 6
MAPKAPK5 MAPK 5
MAPK8 MAPK 8
MAP3K14 MAPK-киназа 14
MAPKAPK3 MAPK 3
MAPK13 MAPK 13
MAP3K10 MAPK-киназа 10
MAPK10 MAPK 10
MAP2K2 MAPK-киназа 2
MAP4K3 MAPK-киназа 3
TNFRSF9 Суперсемейство рецепторов ФНО, член 9
TNFRSF10B Суперсемейство рецепторов ФНО, член 10
TNFRSF13C Суперсемейство рецепторов ФНО, член 13
TNFRSF14 Суперсемейство рецепторов ФНО, член 14
TNFSF18 Суперсемейство ФНО (лиганд), член 18
TNFAIP6 ФНОа-индуцированный белок 6
в первые 6 ч и сохраняет повышенные значения на протяжении 16 ч, при этом экспрессия гена CRK остается без изменений.
Данные табл. 2 показывают, что уровень экспрессии гена FYN, кодирующего тирозинкиназу семейства 8гс, которая участвует в регуляции клеточного роста
и в перфорин-зависимом уничтожении инфицированных НК-клеток, не изменялся под действием ГМДП-А. Экспрессия гена SYK, кодирующего другую тирозинкиназу, которая участвует в передаче сигнала от нескольких мембранных рецепторов, под влиянием ГМДП-А уменьшалась почти в два раза. Этот эффект был непро-
Таблица 2. Экспрессия генов в НК-клетках под влиянием ГМДП-А (10 мкг/мл)
Ген Образец 1 Образец 2 Образец 3 Образец 4 Образец 5
время инкубации с ГМДП-А (10 мкг/мл), ч
6 16 6 16 6 16 6 16 6 16
СЯКЬ 1,67* 1,41* 1,56* 1,26 1,72* 1,41* 1,70* 1,48* 1,47* 1,37
СЯК 1,06 1,19 1,06 1,12 1,11 1,13 1,23 1,20 1,06 0,95
ПЫ 1,05 1,21 0,93 1,17 0,98 1,19 1,16 1,28 0,87 1,08
БУК 0,47* 0,87 0,45* 0,71 0,61* 0,82 0,50* 0,98 0,49* 0,84
ZAP70 0,82 1,56* 0,82 1,44* 0,94 1,61* 1,04 1,67* 0,83 1,45*
ЯАС3 1,26 1,63* 0,98 1,58* 1,10 1,62* 1,28 1,82* 0,93 1,39
ЯАС2 1,21 1,06 1,11 1,06 1,13 1,14 1,34 1,07 1,17 1,03
ЯАС1 0,78 0,79 0,69 0,60 0,74 0,65 0,93 0,91 0,72 0,74
ЯАР1А 1,19 1,68* 1,05 1,62* 1,31 1,67* 1,40 1,79* 1,22 1,68*
КАРОЕП 1,21 1,46* 1,16 1,37 1,34 1,47* 1,28 1,47* 1,01 1,15
ЯАР2А 1,48* 1,41 1,29 1,33 1,30 1,44* 1,72* 1,42* 1,41* 1,34
УАУ3 0,84 1,91* 0,81 1,89* 0,84 1,97* 0,99 1,98* 0,72 1,91*
УАУ2 1,31 1,56* 1,29 1,51* 1,31 1,78* 1,32 1,58* 1,27 1,38
УАУ1 0,54* 0,59* 0,47* 0,37* 0,58* 0,43* 0,55* 0,67 0,36* 0,46*
РЬСБ1 1,07 2,38* 0,95 2,21* 0,99 2,44* 1,11 2,43* 0,91 2,14*
РСОК3А 1,13 2,02* 0,98 1,82* 1,02 1,94* 1,18 2,11* 0,97 1,77*
РЬС01 0,82 1,29 0,78 1,14 0,98 1,17 0,95 1,30 0,84 1,14
РЬС02 0,55* 0,39* 0,46* 0,37* 0,46* 0,41* 0,55* 0,44* 0,41* 0,20*
Р1К3Я3 1,92* 2,07* 1,79* 2,04* 1,85* 2,09* 1,94* 2,09* 1,75* 2,04*
Р1К3Я1 1,06 1,66* 1,03 1,54* 1,11 1,55* 1,21 1,66* 1,04 1,57*
Р1К3С20 1,46* 1,37 1,34 1,24 1,44* 1,29 1,67* 1,40 1,47 1,21
ШЫА1 1,45* 2,34* 1,26 2,23* 1,26 2,28* 1,48* 2,36* 1,32 2,25*
ШЫАб 1,52* 2,02* 1,47* 1,99* 1,55* 2,18* 1,54* 2,13* 1,47* 2,04*
ШЫАК1 1,24 1,83* 1,21 1,72* 1,43* 2,00* 1,43* 1,85* 1,19 1,78*
ШЫА21 0,65 1,70* 0,45* 1,69* 0,60 1,76* 0,67 1,74* 0,52* 1,72*
БТАТб 1,04 2,33* 0,81 2,30* 0,91 2,32* 1,10 2,41* 0,93 2,31*
БТАТ5А 1,29 1,64* 1,00 1,49* 1,00 1,72* 1,42* 1,74* 1,18 1,52*
БТАТ2 0,92 1,47* 0,92 1,44* 1,08 1,52* 1,08 1,50* 0,97 1,43*
МАРК81Р1 1,10 2,74* 0,87 2,55* 0,96 2,65* 1,15 2,76* 0,90 2,51*
МАР2К7 2,32* 2,37* 2,21* 2,26* 2,26* 2,51* 2,41* 2,42* 2,22* 2,23*
МАР4К2 1,22 2,16* 1,20 2,15* 1,25 2,40* 1,28 2,18* 1,23 1,95*
МАР3К6 1,79* 2,13* 1,76* 2,10* 1,84* 2,13* 1,92* 2,19* 1,82* 2,14*
МАРКАРК5 0,59 2,03* 0,54 2,01* 0,57 2,01* 0,72 2,10* 0,43* 1,95*
МАРК8 0,66 1,84* 0,45* 1,74* 0,61 1,77* 0,78 1,86* 0,48* 1,75*
МАР3К14 0,76 1,84* 0,71 1,75* 0,94 1,82* 1,03 1,88* 0,74 1,83*
МАРКАРК3 1,38 1,80* 1,37 1,76* 1,38 1,81* 1,39 1,88* 1,38 1,71*
МАРК13 1,51* 1,79* 1,49* 1,74* 1,57* 1,81* 1,60* 1,81* 1,51* 1,77*
МАР3К10 0,89 1,59* 0,75 1,52* 0,79 1,52* 0,91 1,66* 0,78 1,54*
МАРК10 1,08 1,53* 0,95 1,36* 1,12 1,36* 1,11 1,61* 0,79 1,34*
МАР2К2 0,84 1,46* 0,84 1,37* 1,04 1,45* 0,96 1,48* 0,91 1,22*
МАР4К3 1,19 1,41* 1,09 1,32* 1,11 1,36* 1,34 1,53* 1,06 1,34*
ТШЯБР9 0,80 3,32* 0,56* 3,30* 0,58* 3,37* 0,92 3,32* 0,58 3,23*
ТШЯБР14 1,61* 2,29* 1,53* 2,23* 1,55* 2,25* 1,65* 2,46* 1,44* 2,28*
ТШБР18 2,11* 1,63* 2,11* 1,58* 2,12* 1,65* 2,20* 1,79* 2,11* 1,66*
ТМРА1Р6 0,74 1,61* 0,63 1,55* 0,64 1,69* 0,80 1,66* 0,69 1,62*
ТЫРЯБР13С 0,80 1,59* 0,54 1,57* 0,55* 1,81* 0,82 1,86* 0,59 1,56*
ТШЯБР10Б 1,00 1,54* 0,82 1,53* 1,04 1,63* 1,18 1,54* 0,85 1,53*
Примечание. Здесь и на рис. 1-4 представлены значения отношения 1пА/1пК, где 1пА - натуральный логарифм нормализованного значения сигнала в опытной пробе А (инкубация с ГМДП-А); 1пК - то же, но для контрольной пробы К (инкубация клеток в отсутствие ГМДП-А). * - р < 0,05 - достоверность различий в опытной пробе (А) по сравнению с контрольной пробой (К).
2 1,8 1,6 -1,4 -1,2 -1 -0,8 -0,6 -0,4 -0,2 -0
СЯК1 6 ч СЯК1 16 ч СЯК 6 ч СЯК 16 ч В Образец II Образец 2 В Образец 3 □ Образец 4 0 Образец 5
Рис. 1. Экспрессия генов CRKL и CRK в НК-клетках под действием ГМДП-А в течение 6 и 16 ч
1,8 -,
1,6 -
1,4 -
1,2 —
0,8 -0,6 -0,4 -0,2 -0
8УК 6 ч 8УК 16 ч 1АР70 6 ч 1АР70 16 ч
В Образец 1 В Образец 2 □ Образец 3 □ Образец 4 0 Образец 5
Рис. 2. Экспрессия генов SYK и ZAP70 в НК-клетках под действием ГМДП-А в течение 6 и 16 ч
должительным и наблюдался только в первые 6 ч воздействия препарата (рис. 2).
Обнаружено, что экспрессия гена ZAP70 под действием ГМДП-А не изменялась через 6 ч и значительно, на 50 %, увеличивалась через 16 ч. Экспрессия генов RAPGEF1 и RAP2A в НК-клетках под действием ГМДП-А существенно не изменяется; только экспрессия гена RAP1A достоверно увеличивалась во всех образцах НК-клетках через 16 ч. ГМДП-А в значительной степени влияет и на экспрессию генов семейства УЛУ, продукты которых являются сигнальными медиаторами для семейства малых ГТФ-связывающих белков КИо/ Яае, опосредующих обмен гуаниновых нуклеотидов. Экспрессия гена УЖУ1 достоверно уменьшалась через 6 ч во всех образцах НК-клеток в 2-2,5 раза, и это уменьшение сохранялось в течение всего 16-часового периода наблюдения. В противоположность этому под воздействием ГМДП-А экспрессия генов УAУ2 и ШУБ увеличивалась практически во всех образцах НК-клеток, но только через 16 ч. ГМДП-А через 16 ч достоверно увеличивал экспрессию гена PLCB1 более чем 2 раза во всех образцах культивируемых НК-клеток (см. табл. 2).
Полученные результаты указывают на выраженную ГМДП-А-индуцированную экспрессию генов PIK3R1 и PIK3R3, кодирующих изоформы регулятор-ных субъединиц фосфоинозитид-3-киназы Р13К класса I в НК-клетках, и в особенности Р1К3Я3, транскрипция которой была усилена под воздействием препарата более чем в 2 раза. Транскрипция другой субьединицы -Р1К3С2в, относящейся к ферментам Р13К класса II, характеризовалась лишь слегка повышенным уровнем в некоторых культурах НК-клеток, стимулированных ГМДП-А. Через 16 ч воздействия ГМДП-А в НК-клетках наблюдалось увеличение на 77-110 % экспрессии гена FCGR3A, кодирующего низкоаффинный рецептор Ге-фрагмента (СБ16а).
При исследовании экспрессии генов PLСG1 и PLСG2 в НК-клетках человека обнаружено, что, в отличие от гена PLCB1, экспрессия гена PLСG2 под воздействием
ГМДП-А во всех пяти образцах НК-клеток более чем двукратно уменьшалась через 6 ч и в еще более значительной степени - через 16 ч (p < 0,05). Выраженные изменения транскрипционной активности аналогичного по функции гена PLCG1 практически отсутствовали (p > 0,05) (рис. 3).
ГМДП-А стимулировал экспрессию генов ИФН 1-го типа и их рецептора, причем содержание транскриптов генов IFNA1 и IFNA6 повышалось в значительной степени уже через 6 ч, а через 16 ч их экспрессия увеличивалась более чем вдвое. При этом уровень экспрессии гена IFNA21 через 6 ч понижался почти в 2 раза и троекратно возрастал по отношению к первоначальному падению к 16 ч инкубации с препаратом. Повышенная экспрессия гена рецептора ИФН-а - IFNAR1 -наблюдалась уже в первые 6 ч и еще через 10 ч экспрессия гена продолжала увеличиваться. Под воздействием ГМДП-А в течение 16 ч экспрессия генов STAT, продукты которых участвуют в передаче сигналов
1,4 -,
Р1С01 6 ч Р1С01 16 ч РЬСС2 6 ч РЬСС2 16 ч В Образец 1 В Образец 2 В Образец 3 □ Образец 4 □ Образец 5
Рис. 3. Экспрессия генов фосфатидилинозитол-специфиче-ской фосфолипазы Су-1 (PLCG1) и фосфатидилинозитол-специфической фосфолипазы Су-2 (PLCG2) в НК-клетках под действием ГМДП-А в течение 6 и 16 ч
MAP2K7 6 ч MAP2K7 16 ч MAP3K6 6 ч MAP3K6 16 ч
■ Образец 1 ■ Образец 2 ■ Образец 3 □ Образец 4 И Образец 5
Рис. 4. Экспрессия генов MAP2K7 и MAP3K6 в НК-клетках под действием ГМДП-А в течение 6 и 16 ч
и активации транскрипции, стабильно увеличивалась во всех образцах. Наблюдалось более чем двукратное усиление экспрессии гена TNFSF18 уже через 6 ч инкубации НК-клеток с ГМДП-А, полуторакратное увеличение экспрессии генов TNFAIP6, TNFRSF13C, TNFRSF10B и двукратное увеличение экспрессии генов TNFRSF9, TNFRSF14, TNFSF18 в НК-клетках через 16 ч (см. табл. 2).
Активация экспрессии генов, кодирующих белки МАРК-пути, наблюдалась в отношении всех изученных участников сигнального пути МАРК уже через 6 ч воздействия ГМДП-А. Экспрессия двух из них - MAP3K6 и MAP2K7 - возрастала более чем вдвое через 16 ч после добавления препарата в культуру клеток (рис. 4).
Обсуждение
Как видно из табл. 2, ГМДП-А воздействует на различные этапы фосфорилирования МАРК, гидролиз фосфолипидов, экспрессию адаптерных белков и рецепторов, ответственных за связывание с иммуноглобулинами и цитокинами. Известно, что сигнальные адаптеры СгкЬ и Сгк, интегрируя внешние и внутренние клеточные сигналы, координируют динамическую активацию клеточных сигнальных путей, обеспечивающих регуляцию альтернативного сплайсинга молекул РНК - процесса, критически значимого для онкогенеза. Сгк, начиная с эмбриогенеза, регулирует различные внутриклеточные события, которые требуют организованной динамики цитоскелета. Его постоянное наличие является важным условием для поддержания нормального функционирования клетки. Нокдаун как CRK, так и CRKL в фибробластах приводил к уменьшению площади клеточной поверхности и образованию округлого клеточного фенотипа. Эти морфологические изменения сопровождались уменьшением участков адгезии, снижением количества примембранных актиновых микро-филаментов и разрушением микротрубочек. Кроме того, снижалась спонтанная подвижность клеток, в том числе - в тесте заживления «раневого» повреждения
in vitro. Дальнейшие исследования сигнальной транс-дукции в цитотоксическом иммунологическом синапсе НК-клеток показали, что нокдаун гена CRKL значительно уменьшал конъюгацию, дегрануляцию и цито-токсичность НК-клеток, накопление как F-актина, так и фосфорилированного Vav-1 в цитотоксическом иммунологическом синапсе. При этом нарушалась поляризация центра организации микротрубочек у рецептора NKG2D, необходимого для проявления цитотоксич-ности НК-клеток. Кроме того, нокдаун CRKL приводил к снижению накопления лигандов CD16 и NKG2D на мембране НК-клеток [25]. В других экспериментах была продемонстрирована существенная роль белков Crk и CrkL в контроле активации и ингибирования НК-клеток, в том числе в активации рецептора CD16 и фосфорилированного Vav-1 [26]. Поэтому представляло интерес исследовать эффект ГМДП-А на экспрессию CRKL в НК-клетках человека. Обнаруженное в данном исследовании значительное увеличение экспрессии гена CRKL под действием ГМДП-А может лежать в основе возрастания цитотоксичности НК-клеток под влиянием препарата, обнаруженной ранее [27].
Известно, что Syk опосредует разнообразные биологические функции, включая клеточную адгезию, ангиогенез. Syk активируется лектинами С-типа и интегринами и запускает CARD9/CARMA1-BCL10-MALTl-путь и NLRPS-зависимое воспаление. Syk играет существенную роль в аллергических и аутоиммунных заболеваниях, а также в развитии гематологических злокачественных новообразований, таких как В-клеточные лимфомы. Новый ингибитор Syk оказывал выраженные клинически благоприятные эффекты при ревматоидном артрите человека, В-клеточных лимфо-мах, тромбоцитопении [28].
В отличие от эволюционно более древней Syk-киназы, представленной у дрозофилы и во всех гемопо-этических клетках млекопитающих, Zap-70 преимущественно экспрессируется в НК-клетках и Т-лимфоцитах. Нокдаун генов SYK и ZAP70 предотвращает реакции FcyR-опосредованной антителозависимой клеточно-опосредованной цитотоксичности [29]. Данные табл. 2 указывают на то, что в отличие от ингибирующего эффекта на экспрессию гена SYK, ГМДП-А через 16 ч на 50 % увеличивал уровень экспрессии гена ZAP70. Возможно, что именно Zap-70-зависимые процессы необходимы для активации препаратом ГМДП-А цитотоксичес-кого механизма НК-клеток, тогда как снижение уровня Syk-киназы под действием ГМДП-А может иметь значение для запуска других сигнальных путей, что объясняет положительный эффект ГМДП-А в модели септического шока [30], а также клинический эффект ГМДП, прототипа ГМДП-А при лечении аллергических заболеваний [31], псориаза [32], тромбо- и цитопений [33].
Компоненты сигнального пути RAP1 - низкомолекулярные ГТФазы семейства RAS. Белки RAP контролируют формирование иммунологического синапса в иммунокомпетентных клетках, их миграцию и адгезию к клеткам-мишеням, играя значительную роль
в поддержании функциональной активности НК-клеток. Интересно, что в НК-клетках человека именно продукт гена ЯАР1А опосредует КК02Б-стимулированную активацию СгкЬ-регулируемого цитотоксического механизма, опосредованного адгезией НК-клеток, поляризацией цитотоксических гранул и их экзоцитозом [34]. Поэтому обнаруженные в нашем исследовании стимулирующие эффекты ГМДП-А на экспрессию обоих генов - СЕКТ и ЯАР1А - указывают на общность сигнальных механизмов, инициируемых ГМДП-А и запускаемых в естественных условиях через активацию рецептора ККв2Б.
Усиление активности НК-клеток человека опосредуется сигнальными механизмами, в которых участвуют и Уау-1, и Уау-2. Однако воздействие ГМДП-А приводило к усилению экспрессии только гена УАУ2, что, возможно, может отличать сигнальные механизмы, запускаемые ГМДП-А и ККв2Б: в последнем случае вовлечение именно сигнального медиатора Уау-1 с участием трансмембраного адаптора БЛР-10 является основным механизмом, приводящим к запуску эффек-торных элементов цитотоксичности НК-клеток.
Ген Р1СБ1 кодирует фосфолипазу СЬ(РЬСБ)-1, которая катализирует образование инозитол-1,4,5-трифосфата и диацилглицерина из фос фатидилинозитол-4,5-дифосфата. Ген Р1СБ1 играет решающую роль в запуске программы, ответственной за дифференцировку миобластов и остеогенез у мыши. Продукт гена РЬСБ1 -изоформа Р1-РЬСБ1 - определяет внутриядерный фос-фоинозитидный цикл, при котором активация ядерного Р1-РЬС приводит к генерации диацилглицерина внутри ядра. Метаболизм фосфоинозитида в ядре, открытый еще в 1987 г. Ь. Соссо [35], связан с контролем пролиферации и дифференцировки различных клеток, в том числе НК-клеток. Было показано, что, несмотря на существование двух других изоформ РЬСЬ, только РЬСБ1 характеризовалась исключительной локализацией в ядре, где она контролирует фосфотидилинозитид-связанные сигнальные процессы в НК-клетках, стимулированных ИЛ-2. При этом активацию Р1-РЬСБ1 в ядре путем фосфорилирования осуществляла трансло-цированная в ядро МАР-киназа, распознающая последовательности аминокислот 980-983 (Рго-8ег-8ег-Рго) в структуре РЬСБ1. Интересно, что подобная активация Р1-РЬСБ1 и обусловленные ею фосфоинозитид-связанные процессы в ядре, приводящие к выраженной цитотоксической активности клеток, были обнаружены и при генерации цитотоксических НК-клеток с помощью других провоспалительных цитокинов - ИЛ-12 и ИЛ-15 [36]. Следует полагать, что ГМДП-А, вызвавший усиление экспрессии гена РЬСБ1, имитирует сигнальные процессы, общие для ключевых цитокинов иммунной системы - ИЛ-2, ИЛ-12 и ИЛ-15 и приводящие к тому же результату - усилению цитотоксической активности НК-клеток.
Рецептор РсКШа/СБ16а участвует в опосредованных НК-клетками реакциях АЗКЦ. Достоверное увеличение экспрессии гена РСОЯ3А объясняет способ-
ность ГМДП-А повышать цитотоксическую активность НК-клеток.
Другой фосфатидилинозитол-специфический фермент - фосфолипаза Су (PLCG), катализирующий гидролиз фосфолипидов, также контролирует процессы пролиферации и миграции клеток. Ферменты PLCG1 и PLCG2 локализуются в цитоплазме клеток и являются частью сигнального комплекса, передающего активирующие сигналы в пределах цитоплазмы НК-клеток. Фосфорилированные молекулы PLCG1 и PLCG2 инициируют запуск катионами Са2+ дегрануляции цитотоксических клеток [37].
Данные, полученные по уровню экспрессии генов РЬС01 и РЬС02, свидетельствуют в пользу того, что ГМДП-А противоположным образом модулирует экспрессию генов, кодирующих фосфолипазы СЬ и Су. Возможно, такая высокодифференцированная лекарственно индуцированная модуляция генной экспрессии и определяет специфику индукции ГМДП-А различных сигнальных механизмов, контролирующих цитотокси-ческие реакции НК-клеток.
ГМДП-А стимулирует экспрессию генов ИФН 1-го типа и их рецептора. Ранее было показано, что ИФН-а необходим для проявления активности НК-клеток [38]. Более того, наличие ИФН-а в микроокружении опухоли оказалось необходимым для терапевтической антиметастатической активности НК-клеток у мышей [39]. Можно полагать, что вызванное ГМДП-А увеличение экспрессии генов ИФН 1-го типа и его рецептора, выявленное в нашей работе, усиливает функциональную активность НК-клеток.
Транскрипция генов STAT имеет непосредственное отношение к усилению продукции медиаторов иммунитета, созреванию и выживанию НК-клеток. Так, STAT6 определяет продукцию ТЬ2-цитокинов ИЛ-4, ИЛ-5 и ИЛ-13 с антивоспалительной активностью, STAT5A контролирует процессы созревания НК-клеток и противодействует их гибели, а STAT2 входит в тример-ный комплекс ISGF3, способствующий выживанию НК-клеток при вирусной инфекции. Таким образом, ГМДП-А способен усиливать потенциалы выживаемости и противовоспалительной активности НК-клеток человека, что особенно важно при длительном воздействии цитоплазматического стресса и окислительного стресса, которым подвергаются НК-клетки, особенно в период развития таких патологических процессов в организме, как рак, бактериальные, вирусные и паразитарные инфекции, хронические критические состояния.
MAP2K7 и MAP2K4 являются единственными известными киназами, которые непосредственно активируют стресс-активируемые протеинкиназы c-Jun (N-концевые киназы MAPK8/JNK1, MAPK9/JNK2 и MAPK10/JNK3). Киназа MAP2K7 специфически активирует JNK, которые, в свою очередь, активируют субстраты, в том числе факторы транскрипции или про-апоптотические белки. MAP2K7 необходим для активации JNK, осуществляемой двойным фосфорилирова-
нием МК по ТЬг183 и Туг185 (Р-МК). Обнаруженное стойкое увеличение экспрессии изученных генов сигнального пути МАРК при воздействии ГМДП-А свидетельствует о том, что препарат способен поддерживать МАРК-зависимый сигнальный путь, необходимый для генерации НК-клеток, включая поляризацию цитоток-сических гранул, для проявления функциональной активности НК-клеток [40].
Секретируемые и мембраноассоциированные белки, принадлежащие к семействам ФНО и их рецепторам, участвуют в активации клеток врожденного иммунитета, в том числе НК-клеток. Интересно, что повышенная экспрессия генов TNFRSF9 и TNFRSF14 была отмечена в НК-клетках пациентов, перенесших трансплантацию почки, после активации низкоаффинных Бе-рецепторов (СБ 16а) донор-специфическими анти-ИЬА-антителами [41]. Обнаруженное в нашем исследовании усиление экспрессии этих генов указывает на общность сигнальных путей, инициированных антителами через СБ16, и процессов, запускаемых ГМДП-А.
Полученные результаты по изучению эффекта ГМДП-А на транскриптом НК-клеток человека свидетельствует о способности иммуномодулирующего препарата значительно изменять экспрессию многих генов, контролирующих сигнальные пути активации НК-клеток. Совокупность экспериментальных данных позволяет заключить, что ГМДП-А может быть эффективным средством противодействия ранним этапам
онкогенной и вирусной трансформации для пациентов с дефектами клеточного звена иммунитета.
Выводы
1. Инкубация выделенных НК-клеток человека с ГМДП-А in vitro приводит к 1,5-2,5-кратному увеличению уровня транскриптов следующих генов, ассоциированных с процессами трансдукции сигналов от рецепторов НК-клеток (в скобках указаны контролируемые генами параметры функционирования клеток):
1) STAT5A, STAT2 (связаны с выживанием НК-клеток);
2) PLCB1, PIK3R1 и PIK3R3 (связаны с метаболизмом фосфолипидов);
3) STAT6 (связаны с продукцией противовоспалительных цитокинов);
4) CRKL, VAV-2, ZAP70, RAP1A, PLCB1, FCGR3A, семейство MAPK, IFNA1, TNFRSF9, TNFSF14 (связаны с цитотоксическими реакциями НК-клеток).
2. Изменения экспрессии генов PLCB1 и CRKL/ RAP1A, индуцированные ГМДП-А в НК-клетках, имитируют эффекты, наблюдаемые при активации НК-клеток цитокинами ИЛ-2, ИЛ-12, ИЛ-15 или лигандами рецептора NKG2D, соответственно.
3. Профиль сигнальных путей, определяемый по изменению транскриптома НК-клеток под воздействием ГМДП-А, помогает объяснить обнаруженный ранее противоопухолевый эффект препарата [42].
■ Литература
1. Гурьянова С.В., Хаитов Р.М. Глюкозаминилмурамилдипеп-тид - ГМДП: воздействие на мукозальный иммунитет (к вопросу иммунотерапии и иммунопрофилактики). Иммунология. 2020; 41 (2): 174-83.
2. Abramashvili Yu.G., Kolesnikova N.V., Borisova O.Yu., Gu-ryanova S.V. Low molecular weight bioregulator of bacterial origin in condylomatosis therapy optimization. RUDN Journal of Medicine. 2020; 24 (2): 163-7. DOI: 10.22363/2313-0245-2020-24-2-163167.
3. Гурьянова С.В., Борисова О.Ю., Колесникова Н.В., Лежа-ва Н.Л., Козлов И.Г., Гудима Г.О. Влияние мурамилпептида на микробный состав микрофлоры ротовой полости. Иммунология. 2019; 40 (6): 34-40. DOI: 10.24411/ 0206-4952-2019-16005.
4. Мещерякова E.A., Гурьянова С.В., Макаров E.A., Андронова T.M., Иванов В.Т. Структурно-функциональное исследование глюкозаминилмурамоилпептидов. Влияние химической модификации ^ацетилглюкозаминил-Ы-ацетилмурамоилдипептида на его иммуномодулирующие свойства in vivo и in vitro. Бжюрганическая химия. 1991; 17: 1157-65.
5. Moretta A., Bottino C., Vitale M., Pende D. et al. Activating receptors and coreceptors involved in human natural killer cell-mediated cytolysis. Annu. Rev. 2001; 19: 197-223.
6. Pesce S., Greppi M., Grossi F., Del Zotto G. et al. PD/1-PD-Ls checkpoint: insight on the potential role of NK cells. Front. Immunol. 2019; 10: 1242.
7. Vitale M., Della Chiesa M., Carlomagno S., Romagnani C. et al. The small subset of CD56brightCD16-natural killer cells is selectively responsible for both cell proliferation and interferon-gamma production upon interaction with dendritic cells. Eur. J. Immunol. 2004; 34 (6): 1715-22.
8. Dotiwala F., Lieberman J. Granulysin: killer lymphocyte safeguard against microbes. Curr. Opin. Immunol. 2019; 60: 19-29.
9. Zheng P., Hanson C., Liu D. Adaptor protein Crk-like (CrkL) controls natural killer cell function via regulating the accumulation of activating receptors and phosphorylated Vav-1 molecules at immu-
nological synapses (INM2P.433). J. Immunol. 2014; 192 (1 Suppl.): 56.16.
10. Pugh J.L., Nemat-Gorgani N., Norman P.J., Guethlein L.A. et al. Human natural killer cells downregulate Zap70 and syk in response to prolonged activation or DNA damage. J. Immunol. 2018; 200 (3): 1146-58. DOI: 10.4049/jimmunol.1700542.
11. Kotelevets L., Chastre E. Rac1 signaling: from intestinal homeostasis to colorectal cancer metastasis. Cancers (Basel). 2020; 12 (3). pii: E665. DOI: 10.3390/cancers12030665.
12. Minato N. Rap G protein signal in normal and disordered lymphohematopoiesis. Exp. Cell. Res. 2013; 319 (15): 2323-8. DOI: 10.1016/j.yexcr.2013.04.009.
13. Pearce A.C., Senis Y.A., Billadeau D.D., Turner M. et al. Vav1 and vav3 have critical but redundant roles in mediating platelet activation by collagen. J. Biol. Chem. 2004; 279 (52): 53 955-62.
14. Kerr W.G., Colucci F. Inositol phospholipid signaling and the biology of natural killer cells. J. Innate Immun. 2011; 3: 249-57.
15. Gulluni F., De Santis M.C., Margaria J.P., Martini M. et al. Class II PI3K functions in cell biology and disease. Trends Cell Biol. 2019; 29 (4): 339-59. DOI: 10.1016/j.tcb.2019.01.001.
16. Moon W.Y., Powis S.J. Does natural killer cell deficiency (NKD) increase the risk of cancer? NKD may increase the risk of some virus induced cancer. Front. Immunol. 2019; 10: 1703. DOI: 10.3389/ fimmu.2019.01703.
17. Lee Y.H., Choi S.J., Ji J.D., Song G.G. Associations between functional FCGR2A R131H and FCGR3A F158V polymorphisms and responsiveness to TNF blockers in spondyloarthropathy, psoriasis and Crohn's disease: a meta-analysis. Pharmacogenomics. 2016; 13: 1465-77. DOI: 10.2217/pgs.16.27.
18. Osterlund P.I., Pietilä T.E., Veckman V., Kotenko S.V. et al. IFN regulatory factor family members differentially regulate the expression of type III IFN (IFN-lambda) genes. J. Immunol. 2007; 179 (6): 3434-42. DOI: 10.4049/jimmunol.179.6.3434.
19. Rogovskii V.S. The linkage between inflammation and immune tolerance: interfering with inflammation in cancer. Curr. Cancer
Drug Targets. 2017; 17 (4): 325-32. DOI: 10.2174/15680096176661 70109110816.
20. Orton R.J., Sturm O.E., Vyshemirsky V., Calder M. et al. Computational modelling of the receptor-tyrosine-kinase-activated MAPK pathway. Biochem. J. 2005; 392 (2): 249-61. DOI: 10.1042/ BJ20050908.
21. Wallach D. The TNF cytokine family: one track in a road paved by many. Cytokine. 2013; 63 (3): 225-9. DOI: 10.1016/ j.cyto.2013.05.027.
22. Jewett A., Kos J., Fong Y., Ko M.W. et al. NK cells shape pancreatic and oral tumor microenvironments; role in inhibition of tumor growth and metastasis. Semin. Cancer Biol. 2018; 53: 178-88. DOI: 10.1016/j.semcancer.2018.08.001.
23. Rostovtseva L.I., Andronova T.M., Malkova V.P., Soro-kina I.B., Ivanov V.T. Synthesis and antitumor activity of glycopep-tides containing N-acetylglucosaminyl-(1^4)-N-acetylmuramyl di-saccharide unit. Bioorg. Khim. 1981; 7: 1843-58.
24. Курсаков С.В., Кузнецова Е.Г., Курылева О.М., Салома-тина Л.А., Гурьянова С.В., Борисова О.Ю., Гудима Г.О., Севастьянов В.И. Разработка и валидация методики определения глюко-заминилмурамилдипептида в водных растворах методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Иммунология. 2020; 41 (1): 74-82. DOI: 10.33029/0206-4952-2020-41-1-74-82.
25. Liu D. The adaptor protein Crk in immune response. Immunol. Cell Biol. 2014; 92: 80-9.
26. Liu D., Peterson M.E., Long E.O. The adaptor protein Crk controls activation and inhibition of natural killer cells. Immunity. 2012; 36: 600-11.
27. Гапонов А.М., Якушенко Е.В., Тутельян А.В., Писарев В.М., Александров И.А., Андронова Т.М., Козлов И.Г. Производное мурамилдипептида (ГМДП-А) стимулирует цитоток-сичность, экспрессию генов перфорина и рецептора ИЛ-18 НК-клеток. Иммунология. 2019; 40 (5): 44-51.
28. Connell N.T., Berliner N. Fostamatinib for the treatment of chronic immune thrombocytopenia. Blood. 2019; 133 (19): 202730. DOI: 10.1182/blood-2018-11-852491.
29. Colucci F., Schweighoffer E., Tomasello E., Turner M. et al. Natural cytotoxicity uncoupled from the Syk and ZAP-70 intracellular kinases. Nat. Immunol. 2002; 3: 288-94.
30. Meshcheryakova E., Guryanova S., Makarov E., Alekse-eva L. et al. Prevention of experimental septic shock by pretreatment of mice with muramyl peptides. Int. Immunopharmacol. 2001; 1 (910): 1857-65.
31. Колесникова Н.В., Козлов И.Г., Гурьянова С.В., Коков Е.А., Андронова Т.М. Клинико-иммунологическая эффективность и перспективы использования мурамилдипептидов в лече-
нии атопических заболеваний. Медицинская иммунология. 2016; 18 (1): 15-20.
32. Guryanova S., Udzhukhu V., Kubylinsky A. Pathogenetic therapy of psoriasis by muramyl peptide. Front. Immunol. 2019; 10: 1275. DOI: 10.3389/fimmu.2019.01275.
33. Манапова Э.Р., Фазылов В.Х., Гурьянова С.В. Цитопении и их коррекция при противовирусной терапии хронического гепатита С у пациентов с генотипом 1. Вопросы вирусологии. 2017; 629 (4): 174-8.
34. Segovis C.M., Schoon R.A., Dick C.J., Nacusi L.P., Leib-son P.J., Billadeau D.D. PI3K links NKG2D signaling to a CrkL pathway involved in natural killer cell adhesion, polarity, and granule secretion. J. Immunol. 2009; 182 (11): 6933-42. DOI: 10.4049/jimmu-nol.0803840.
35. Cocco L., Gilmour R.S., Ognibene A., Manzoli F.A., Irvine R.F. Synthesis of polyphosphoinositides in nuclei of Friend cells. Evidence for phosphoinositide metabolism inside the nucleus which changes with cell differentiation. Biochem. J. 1987; 248: 765-70.
36. Ponti C., Falconi M., Billi A.M., Faenza I. et al. IL-12 and IL-15 induce activation of nuclear PLCbeta in human natural killer cells. Int. J. Oncol. 2002; 20 (1): 149-53.
37. Matalon O., Fried S., Ben-Shmuel A., Pauker M.H., Joseph N., Keizer D. et al. Dephosphorylation of the adaptor LAT and phospholipase C-g by SHP-1 inhibits natural killer cell cytotoxicity. Sci. Signal. 2016; 9: ra54.
38. Comet N.R., Aguiló J.I., Rathoré M.G., Catalán E. et al. IFNa signaling through PKC-9 is essential for antitumor NK cell function. Oncoimmunology. 2014; 3 (8): e948705. DOI: 10.4161/21624011.2014.948705.
39. Takehara T., Uemura A., Tatsumi T., Suzuki T., Kimura R., Shiotani A., Ohkawa K., Kanto T., Hiramatsu N., Hayashi N. Natural killer cell-mediated ablation of metastatic liver tumors by hydro-dynamic injection of IFNalpha gene to mice. Int. J. Cancer. 2007; 120 (6): 1252-60. DOI: 10.1002/ijc.22152.
40. Li C., Ge B., Nicotra M., Stern J.N.H. et al. JNK MAP kinase activation is required for MTOC and granule polarization in NKG2D-mediated NK cell cytotoxicity. Proc. Natl Acad. Sci. USA. 2008; 105 (8): 3017-22. DOI: 10.1073/pnas.0712310105.
41. Parkes M.D., Halloran P.F., Hidalgo L.G. Evidence for CD16a-mediated NK cell stimulation in antibody-mediated kidney transplant rejection. Transplantation. 2017; 101 (4): e102-11. DOI: 10.1097/TP.0000000000001586.
42. Гапонов А.М., Якушенко Е.В., Тутельян А.В., Козлов И.Г. Влияние производного мурамилдипептида (ГМДП-А) на линии опухолевых клеток, экспрессирующих NOD-2. Российский иммунологический журнал. 2018; 12 (21): 128-40.
■ References
1. Guryanova S.V., Khaitov R.M. Glucosaminylmuramyldipep-tide - GMDP: mucosal immunotherapy and immunoprophylaxis. Im-munologiya. 2020; 41 (2): 174-83. (in Russian)
2. Abramashvili Yu.G., Kolesnikova N.V., Borisova O.Yu., Guryanova S.V. Low molecular weight bioregulator of bacterial origin in condylomatosis therapy optimization. RUDN Journal of Medicine. 2020; 24 (2): 163-7. DOI: 10.22363/2313-0245-2020-24-2-163167.
3. Guryanova S.V., Borisova O.Yu., Kolesnikova N.V., Lezhava N.L., Kozlov I.G., Gudima G.O. Effect of muramyl peptide on the microbial landscape of the oral cavity. Immunologiya. 2019; 40 (6): 34-40. DOI: 10.24411/ 0206-4952-2019-16005. (in Russian)
4. Meshcheryakova E.A., Guryanova S.V., Makarov E.A., Andronova T.M., Ivanov V.T. Structure-function investigation of glucosamu-ramylpeptides. Influence of chemical modification of N-acetylglucos-aminyl-N-acetylmuramyl dipeptide (GMDP) on its immunomodulatory properties in vivo and in vitro. Bioorganicheskaya khimiya. 1991; 17 (9): 1157-65.
5. Moretta A., Bottino C., Vitale M., Pende D., et al. Activating receptors and coreceptors involved in human natural killer cell-mediated cytolysis. Annu. Rev. 2001; 19: 197-223.
6. Pesce S., Greppi M., Grossi F., Del Zotto G., et al. PD/1-PD-Ls checkpoint: insight on the potential role of NK cells. Front. Immunol. 2019; 10: 1242.
7. Vitale M., Della Chiesa M., Carlomagno S., Romagnani C., et al. The small subset of CD56brightCD16-natural killer cells is selectively responsible for both cell proliferation and interferon-gamma
production upon interaction with dendritic cells. Eur. J. Immunol. 2004; 34 (6): 1715-22.
8. Dotiwala F., Lieberman J. Granulysin: killer lymphocyte safeguard against microbes. Curr. Opin. Immunol. 2019; 60: 19-29.
9. Zheng P., Hanson C., Liu D. Adaptor protein Crk-like (CrkL) controls natural killer cell function via regulating the accumulation of activating receptors and phosphorylated Vav-1 molecules at immunological synapses (INM2P.433). J. Immunol. 2014; 192 (1 Suppl): 56.16.
10. Pugh J.L., Nemat-Gorgani N., Norman P.J., Guethlein L.A., et al. Human natural killer cells downregulate Zap70 and syk in response to prolonged activation or DNA damage. J. Immunol. 2018; 200 (3): 1146-58. DOI: 10.4049/jimmunol.1700542.
11. Kotelevets L., Chastre E. Rac1 signaling: from intestinal homeostasis to colorectal cancer metastasis. Cancers (Basel). 2020; 12 (3). pii: E665. DOI: 10.3390/cancers12030665.
12. Minato N. Rap G protein signal in normal and disordered lymphohematopoiesis. Exp. Cell. Res. 2013; 319 (15): 2323-8. DOI: 10.1016/j.yexcr.2013.04.009.
13. Pearce A.C., Senis Y.A., Billadeau D.D., Turner M., et al. Vav1 and vav3 have critical but redundant roles in mediating platelet activation by collagen. J. Biol. Chem. 2004; 279 (52): 53 955-62.
14. Kerr W.G., Colucci F. Inositol phospholipid signaling and the biology of natural killer cells. J. Innate Immun. 2011; 3: 249-57.
15. Gulluni F., De Santis M.C., Margaria J.P., Martini M., et al. Class II PI3K functions in cell biology and disease. Trends Cell Biol. 2019; 29 (4): 339-59. DOI: 10.1016/j.tcb.2019.01.001.
16. Moon W.Y., Powis S.J. Does natural killer cell deficiency (NKD) increase the risk of cancer? NKD may increase the risk of some virus induced cancer. Front. Immunol. 2019; 10: 1703. DOI: 10.3389/ fimmu.2019.01703.
17. Lee Y.H., Choi S.J., Ji J.D., Song G.G. Associations between functional FCGR2A R131H and FCGR3A F158V polymorphisms and responsiveness to TNF blockers in spondyloarthropathy, psoriasis and Crohn's disease: a meta-analysis. Pharmacogenomics. 2016; 13: 1465-77. DOI: 10.2217/pgs.16.27.
18. Osterlund P.I., Pietilä T.E., Veckman V., Kotenko S.V., et al. IFN regulatory factor family members differentially regulate the expression of type III IFN (IFN-lambda) genes. J. Immunol. 2007; 179 (6): 3434-42. DOI: 10.4049/jimmunol.179.6.3434.
19. Rogovskii V.S. The linkage between inflammation and immune tolerance: interfering with inflammation in cancer. Curr. Cancer Drug Targets. 2017; 17 (4): 325-32. DOI: 10.2174/15680096176661 70109110816.
20. Orton R.J., Sturm O.E., Vyshemirsky V., Calder M., et al. Computational modelling of the receptor-tyrosine-kinase-activated MAPK pathway. Biochem. J. 2005; 392 (2): 249-61. DOI: 10.1042/ BJ20050908.
21. Wallach D. The TNF cytokine family: one track in a road paved by many. Cytokine. 2013; 63 (3): 225-9. DOI: 10.1016/j. cyto.2013.05.027.
22. Jewett A., Kos J., Fong Y., Ko M.W., et al. NK cells shape pancreatic and oral tumor microenvironments; role in inhibition of tumor growth and metastasis. Semin. Cancer Biol. 2018; 53: 178-88. DOI: 10.1016/j.semcancer.2018.08.001.
23. Rostovtseva L.I., Andronova T.M., Malkova V.P., Sorokina I.B., Ivanov V.T. Synthesis and antitumor activity of glycopeptides containing N-acetylglucosaminyl-(1^4)-N-acetylmuramyl disaccha-ride unit. Bioorganicheskaya khimiya. 1981; 7: 1843-58.
24. Kursakov S.V., Kuznetsova E.G., Kuryleva O.M., Saloma-tina L.A., Guryanova S.V., Borisova O.Yu., Gudima G.O., Sevastya-nov V.I. Development and validation of a method for glucosaminyl muramyl dipeptide determining in aqueous solutions by high performance liquid chromatography. Immunologiya. 2020; 41 (1): 74-82. DOI: 10.33029/0206-4952-2020-41-1-74-82. (in Russian)
25. Liu D. The adaptor protein Crk in immune response. Immunol. Cell Biol. 2014; 92: 80-9.
26. Liu D., Peterson M.E., Long E.O. The adaptor protein Crk controls activation and inhibition of natural killer cells. Immunity. 2012; 36: 600-11.
27. Gaponov A.M., Yakushenko E.V., Tutelyan A.V., Pisarev V.M., et al. Muramyl dipeptide derivative (GMDP-A) stimulates NK-cell cytoticity, expression of perforin and receptor IL-18. Immunologiya. 2019; 40 (5): 44-51. DOI: 10.24411/0206-4952-2019-15005. (in Russian)
28. Connell N.T., Berliner N. Fostamatinib for the treatment of chronic immune thrombocytopenia. Blood. 2019; 133 (19): 202730. DOI: 10.1182/blood-2018-11-852491.
29. Colucci F., Schweighoffer E., Tomasello E., Turner M., et al. Natural cytotoxicity uncoupled from the Syk and ZAP-70 intracellular kinases. Nat. Immunol. 2002; 3: 288-94.
30. Meshcheryakova E., Guryanova S., Makarov E., Alekseeva L., et al. Prevention of experimental septic shock by pretreatment of mice with muramyl peptides. Int. Immunopharmacol. 2001; 1 (910): 1857-65.
31. Kolesnikova N.V., Kozlov I.G., Guryanova S.V., Kokov E.A., Andronova T.M. Clinical and immunological efficiency of muramyl dipeptide in the treatment of atopic diseases. Meditsinskaya immu-nologiya. 2016; 18 (1): 15-20. DOI: 10.15789/1563-0625-2016-1-1520 (in Russian)
32. Guryanova S., Udzhukhu V., Kubylinsky A. Pathogenetic therapy of psoriasis by muramyl peptide. Front. Immunol. 2019; 10: 1275. DOI: 10.3389/fimmu.2019.01275.
33. Manapova E.R., Fazylov V.Ch., Guryanova S.V. Cytopenias and their correction during antiviral therapy of chronic hepatitis C in patients with genotype 1. Voprosy virusologii. 2017; 62 (4): 174-8. (in Russian)
34. Segovis C.M., Schoon R.A., Dick C.J., Nacusi L.P., Leib-son P.J., Billadeau D.D. PI3K links NKG2D signaling to a CrkL pathway involved in natural killer cell adhesion, polarity, and granule secretion. J. Immunol. 2009; 182 (11): 6933-42. DOI: 10.4049/jimmu-nol.0803840.
35. Cocco L., Gilmour R.S., Ognibene A., Manzoli F.A., Irvine R.F. Synthesis of polyphosphoinositides in nuclei of Friend cells. Evidence for phosphoinositide metabolism inside the nucleus which changes with cell differentiation. Biochem. J. 1987; 248: 765-70.
36. Ponti C., Falconi M., Billi A.M., Faenza I., et al. IL-12 and IL-15 induce activation of nuclear PLCbeta in human natural killer cells. Int. J. Oncol. 2002; 20 (1): 149-53.
37. Matalon O., Fried S., Ben-Shmuel A., Pauker M.H., Joseph N., Keizer D., et al. Dephosphorylation of the adaptor LAT and phospholipase C-g by SHP-1 inhibits natural killer cell cytotoxicity. Sci. Signal. 2016; 9: ra54.
38. Comet N.R., Aguiló J.I., Rathoré M.G., Catalán E., et al. IFNa signaling through PKC-0 is essential for antitumor NK cell function. Oncoimmunology. 2014; 3 (8): e948705. DOI: 10.4161/21624011.2014.948705.
39. Takehara T., Uemura A., Tatsumi T., Suzuki T., Kimura R., Shiotani A., Ohkawa K., Kanto T., Hiramatsu N., Hayashi N. Natural killer cell-mediated ablation of metastatic liver tumors by hydrody-namic injection of IFNalpha gene to mice. Int. J. Cancer. 2007; 120 (6): 1252-60. DOI: 10.1002/ijc.22152.
40. Li C., Ge B., Nicotra M., Stern J.N.H., et al. JNK MAP kinase activation is required for MTOC and granule polarization in NKG2D-mediated NK cell cytotoxicity. Proc. Natl Acad. Sci. USA. 2008; 105 (8): 3017-22. DOI: 10.1073/pnas.0712310105.
41. Parkes M.D., Halloran P.F., Hidalgo L.G. Evidence for CD16a-mediated NK cell stimulation in antibody-mediated kidney transplant rejection. Transplantation. 2017; 101 (4): e102-11. DOI: 10.1097/TP.0000000000001586.
42. Gaponov A.M., Yakushenko E.V., Tutelyan A.V., Kozlov I.G. Influence of muramyl dipeptide derivative (GMDP-A) on NOD-2 expressed tumor cell lines. Rossiyskiy immsunologicheskiy zhurnal. 2018; 12 (21): 128-40. (in Russian)
