CC BY
17
Medical Immunology (Russia)/ Медицинская иммунология ОрЫгЫНаЛЬНЬ1@ C^fttt^ftbW Meditsinskaya Immunologiya 2018, Т. 20, № 6, стр. 847-854 * ^ . . . . . 2018, Vol. 20, No 6, pp. 847-854
© 2018, СПбРО РААКИ Original articles © 2018, SPb RAACI
ДИФФЕРЕНЦИРОВАННЫЕ ВЛИЯНИЯ ГЛЮКОЗАМИНИЛМУРАМИЛДИПЕПТИДА НА НЕТРАНСФОРМИРОВАННЫЙ И ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНО ТРАНСФОРМИРОВАННЫЙ ФЕНОТИП СУБПОПУЛЯЦИИ CD62L+CD63+CD66d+ НЕЙТРОФИЛЬНЫХ ГРАНУЛОЦИТОВ УСЛОВНО ЗДОРОВЫХ ЛИЦ
Нестерова И.В.1, 2, Малиновская В.В.3, Хайдуков С.В.4, Нгуен Тхи Зеу Лен1, Чудилова Г.А.2, Ломтатидзе Л.В.2
1ФГАОУ ВО «Российский университет дружбы народов» Министерства образования и науки РФ, Москва, Россия
2 ФГБОУ ВО «Кубанский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения РФ, г. Краснодар, Россия
3 ГУ «Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени Н.Ф. Гамалеи Российской академии медицинских наук», Москва, Россия
4 ФГБУН«Институт биоорганической химии имени академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова», Москва, Россия
Резюме. Современными исследованиями доказана высокая пластичность и существование множества фенотипов нейтрофильных гранулоцитов (НГ) с разной рецепторной оснащенностью, являющейся для исследователей диагностическим маркером функциональной возможности клетки, реализуемой в ходе работы. Исследованы НГ периферической крови, полученные от здоровых лиц обоего пола в возрасте от 26 до 66 лет. Оценка экспрессии рецепторов на мембране НГ проводилась методом проточной цитометрии. Оценивали относительное количество нейтрофильных гранулоцитов, несущих мембранные CD62L, CD63, CD66d рецепторы, и интенсивность их экспрессии по значению средней интенсивности флуоресценции. Проведено изучение поверхностных мембранных рецепторов НГ — CD62L, CD63, CD66d — под влиянием бактериального пептида N-формил-метионил-лейцил-фенилаланин (fMLP) (модель1), под воздействием глюкозаминилмурамилдипептида (ГМДП) (модель 2) и при одновременной инкубации НГ цельной крови с fMLP и ГМДП (модель 3) в созданных в системе in vitro экспериментальных моделях. Под влиянием бактериального пептида fMLP в созданной в системе in vitro экспериментальной модели получена трансформация фенотипа НГ условно здоровых субъектов, экспрессирующих CD62, CD63, CD66d молекулы: значительно уменьшилось
Адрес для переписки:
Нестерова Ирина Вадимовна
ФГАОУ ВО «Российский университет дружбы народов» Министерства образования и науки РФ 117513, Россия, Москва, Ленинский пр., 123-1. Тел.: 8(916) 187-73-41. E-mail: inesterova1@yandex.ru
Образец цитирования:
И.В. Нестерова, В.В. Малиновская, С.В. Хайдуков, Тхи Зеу Лен Нгуен, Г.А. Чудилова, Л.В. Ломтатидзе «Дифференцированные влияния глюкозаминилмурамилдипептида на нетрансформированный и экспериментально трансформированный фенотип субпопуляции CD62L+CD63+CD66d+ нейтрофильных гранулоцитов условно здоровых лиц» // Медицинская иммунология, 2018. Т. 20, № 6. С. 847-854. doi: 10.15789/1563-0625-2018-6-847-854 © Нестерова И.В. и соавт., 2018
Address for correspondence:
Nesterova Irina V.
People's Friendship University of Russia
117513, Russian Federation, Moscow, Leninsky ave, 123-1.
Phone: 7(916) 187-73-41.
E-mail: inesterova1@yandex.ru
For citation:
I.V. Nesterova, V.V. Malinovskaya, S.V. Khaydukov, Thi Dieu Lien Nguyen, G.A. Chudilova, L.V. Lomtatidze "Differentiated effects of glucosaminyl muramil dipeptide on the non-transformed and experimentally transformed phenotype of CD62L+CD63+CD66d+ neutrophilic granulocytes in conventionally healthy people", Medical Immunology (Russia)/Meditsinskaya Immunologiya, 2018, Vol. 20, no. 6, pp. 847-854. doi: 10.15789/1563-0625-2018-6-847-854
DOI: 10.15789/1563-0625-2018-6-847-854
как относительное количество нейтрофильных гранулоцитов, экспрессирующих CD62L, так и плотность экспрессии CD62L с параллельным повышением плотности экспрессии CD63. Воздействие ГМДП на нетрансформированный фенотип НГ условно здоровых субъектов не изменяло количества CD62L+НГ и CD63+НГ и плотность экспрессии CD62L и CD63 на поверхностной мембране НГ, однако при этом достоверно увеличилось количество CD66d^^ при неизменившейся плотности экспрессии молекул CD66d. ГМДП, введенный одномоментно с бактериальным пептидом fMLP, нивелировал некоторые трансформационные изменения фенотипа НГ, возникающие под влиянием fMLP: незначительно восстановилось количество CD62L+НГ и достоверно возросла плотность экспрессии CD62L; при этом ГМДП не корректировал негативное влияние fMLP на количество CD63+НГ и CD66d+НГ и плотность экспрессии молекул CD63 и CD66d. Одномоментное введение fMLP и ГМДП достоверно увеличило количество CD66d+НГ и плотность экспрессии молекул CD63 на мембране CD63+НГ по сравнению с интактными НГ условно здоровых субъектов. Полученные данные важны для разработки новых иммунотерапевтических стратегий, направленных на коррекцию негативно трансформированного фенотипа НГ при нетипично протекающих инфекционно-воспалительных заболеваниях бактериальной этиологии.
Ключевые слова: нейтрофильные гранулоциты, эксперимент in vitro, трансформация иммунофенотипа
DIFFERENTIATED EFFECTS OF GLUCOSAMINYLMURAMILDIPEPTIDE ON THE NON-TRANSFORMED AND EXPERIMENTALLY TRANSFORMED PHENOTYPE OF CD62L+CD63+CD66d+ NEUTROPHILIC GRANULOCYTES IN CONVENTIONALLY HEALTHY PEOPLE
Nesterova I.V.8' b, Malinovskaya V.V.c, Khaydukov S.V.d, Nguyen Thi Dieu Liena, Chudilova G.A.b, Lomtatidze L.V.b
a People's Friendship University of Russia, Moscow, Russian Federation b Kuban State Medical University, Krasnodar, Russian Federation
c N. Gamaleya Research Institute of Epidemiology and Microbiology, Moscow, Russian Federation d M. Shemyakin and Yu. Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry, Moscow, Russian Federation
Abstract. Modern studies have shown a high plasticity and phenotypic diversity of neutrophilic granulocytes (NG) provided by different receptors, which are diagnostic markers for the functional capacity of the cell in the course of their activities. We investigated NG from peripheral blood, obtained from healthy people of both sexes aged from 26 to 66 years. Evaluation of the neutrophil membrane receptor expression was carried out by flow cytometry. The relative amount of neutrophilic granulocytes expressing membrane CD62L, CD63, CD66d receptors and the intensity of their expression were determined according to their fluorescence intensities. The surface NG membrane receptors, i.e., CD62L, CD63, CD66d were studied upon the in vitro experimental influence of the following bacterial peptides: N-formyl-methionyl-leucyl-phenylalanine (FMLP, model 1); glucosaminylmuramyldipeptide (GMDP, model 2), and simultaneous incubation of NG blood with fMLP and GMDP (model 3). The in vitro treatment with fMLP in the in vitro model was used to transform the NG phenotype of conventionally healthy subjects, expressing CD62, CD63, CD66d molecules. The treatment caused a significantly decrease in both CD62L and the CD62L expression in relative amounts of neutrophilic granulocytes with a parallel increase of CD63 expression density. The effect of GMDP on the NG phenotype of conditionally healthy subjects did not change the amount of CD62L+NG and CD63+NG, and did not affect CD62L and CD63 expression density on the surface of NG. However, the amount of CD66d+NG was significantly increased with the unchanged expression of CD66d molecules. GMDP introduced together with the bacterial fMLP peptide was shown to neutralize some features of the NG phenotype transformation caused by fMLP, i.e., the amount of CD62L+ NG was restored by 22 % and the CD62L expression density increased significantly. At the same time, GMDP did not correct the negative effect of fMLP upon the number of CD63+NG and CD66d+NG, and on the CD63 and CD66d expression. Simultaneous addition of fMLP
and GMDP did significantly increase the amount of CD66d+NG and expression density of CD63 molecules on the CD63+NG membrane as compared to intact NG of conditionally healthy subjects. The obtained data are important in order to justify some new immunotherapeutic strategies aimed at correction of the negatively transformed NG phenotype, which accompanies some infectious and inflammatory diseases of bacterial etiology with atypical clinical course.
Keywords: neutrophilic granulocytes, in vitro experiment, immunophenotype transformation
Введение
Нейтрофильные гранулоциты (НГ) являются доминантными клетками иммунной системы, которые способны молниеносно реагировать на изменение экстрацеллюлярного микроокружения (острофазные белки, стрессорные половые гормоны, хемокины, цитокины, бактерии, вирусы, грибы и т.д.) благодаря мощному ре-цепторному оснащению. Очевиден факт, свидетельствующий о том, что богатый арсенал высокочувствительных мембранных поверхностных структур предопределяет функциональную направленность НГ и резервную способность к молниеносной перестройке фенотипов различных субпопуляций НГ в зависимости от инициирующего сигнала [1, 4, 7, 11]. Современными исследованиями доказана высокая пластичность и существование множества фенотипов нейтро-фильных гранулоцитов с разной рецепторной оснащенностью, являющейся для исследователей диагностическим маркером функциональной возможности клетки, реализуемой в ходе работы. Отсутствие адекватного реагирования, а также гиперактивация или полная функциональная блокада НГ приводят к развитию заболеваний, не отвечающих на традиционную терапию.
Изучение поверхностных мембранных рецепторов НГ — CD62L, CD63, CD66d — представляет несомненно большой интерес.
CD62L — L-селектин ^АМ-1] относится к семейству поверхностных селектинов, участвующих в «роллинге» НГ на поверхности эндотелия. CD62L экспрессируются на всех циркулирующих неактивированных НГ и костномозговых миело-идных клетках. Известно, что при запуске воспалительного процесса в ходе иммунного ответа уровень экспрессии CD62L может меняться [3].
CD63 — лизосомальный мембран-ассоци-ированный гликопротеин-3 ^АМР-3) семейства тетраспанинов (TM4SF, ^апзтетЬгапе-4 superfamily). CD63 и другие тетраспанины ^9, CD81, CD82) образуют связь с ^А-3, фосфатидилинозитол-4-киназой, УЬА-6, CD11/ CD18 и тирозин-киназой. CD63 экспрессирует-ся на поверхности и цитоплазме многих клеток организма человека. Известно, что CD63 содержится только в азурофильных гранулах неактивированных нейтрофилов, и увеличение уров-
ня экспрессии данного рецептора на мембране клетки свидетельствует о запуске процесса дегра-нуляции, что в свою очередь является маркером активации НГ в процессе фагоцитоза [9].
CD66d рецептор НГ — молекула клеточной адгезии — раково-эмбриональный антиген, относящийся к суперсемейству иммуноглобулинов (CEACAM). CD66d (GM-1) является эксклюзивным маркером гранулоцитов, экспрессия которого увеличивается под влиянием многих стимуляторов. Известно, что повышение адгезионной активности НГ, опосредованной молекулой CD66d, сопряжена с увеличением экспрессии CD11/CD18 и снижением экспрессии CD62L на поверхностной мембране НГ. Интересен тот факт, что данный рецептор может играть роль паттернраспознающего рецептора для некоторых бактерий [12, 13].
В настоящее время описаны особенности изменения интенсивности оснащения рецепторами CD62L, CD16 субпопуляции CD16+CD62L+ при вирусных и вирусно-бактериальных инфекциях новорожденных [6] и CD62L, CD63 субпопуляции CD62L+CD63+НГ здоровых новорожденных и новорожденных с врожденной пневмонией и при пневмонии, осложненной сепсисом [10]. Наши исследования выявили наличие субпопуляций НГ: CD62LdimCD63dim, CD62LbrightCD63dim, CD62LdimCD63mid. Изменение соотношения субпопуляций (увеличение CD62LdimCD63midНГ на фоне снижения CD62LbrightCD63dimНГ) является маркером тяжести протекающего инфекционного процесса [10]. Оценка антигенного репертуара НГ с учетом интенсивности экспрессии рецепторов на мембранной поверхности клетки дает возможность оценивать не только полноценность функционального состояния нейтрофиль-ных гранулоцитов, но и их доминантную направленность как при нормальных физиологических, так и при различных патологических процессах. Проведенные ранее исследования позволили заключить, что ядерный аппарат НГ быстро отвечает изменением уровня реструктуризации хроматина и его биологической активности на самые различные внешние стимулы. Реструктуризация хроматина является предверием проявления матричной активности ДНК с последующим белковым синтезом. Так, при воздействии на НГ в эксперименте в системе in vitro таких цитокинов,
как IFNy, G-CSF, TNFa или их комплекса, наблюдались различные трансформации фенотипа субпопуляций НГ CD64+CD32+CD16+CD11b+ и CD64"CD32+CD16+CD11b+, коррелирующие с достоверным увеличением реструктуризации хроматина НГ[2]. Показано, что при инкубации НГ здоровых субъектов с IFNy in vitro повышается уровень экспрессии генов IL-8, IL-1ß и TNFa относительно неиндуцированного контроля. Следует отметить, что в ходе исследования была отмечена сильная прямая корреляционная связь между трансформационными изменениями фенотипа НГ, экспрессией генов цитокинов и уровнем реструктуризации хроматина [2].
Эксперимент in vitro, в ходе которого создается модель, предоставляет исследователю неограниченные возможности, поскольку есть тесная связь между действующим причинным фактором и инициируемым процессом. Исследования, проводимые с целью выявления возможностей влияния на клетку определенной иммунотроп-ной субстанции (ИТС), позволяют оценить непосредственное воздействие ИТС на рецептор-ное оснащение НГ, сопряженное с модуляцией их функциональной активности, и по-прежнему представляют определенный интерес. Полученные в ходе таких исследований данные в дальнейшем могут явиться основой для разработки новых методов таргетных иммунотерапевтических воздействий на дефектно функционирующие НГ (нейтропения, депрессия фагоцитарной функции, негативная гиперактивация, «парализис»-блокада активации при контакте с микробным антигеном) при многих иммунозависимых заболеваниях.
В связи с изложенным определенный интерес представляет изучение влияния глюкозами-нилмурамилдипептида (ГМДП) с доказанными иммунотропными свойствами на трансформированный фенотип НГ. ГМДП представляет собой основную структурную единицу пептидогликана клеточной стенки бактерий, который связывается с цитозольными рецепторами NOD2 и YB1, запускает сигналинг, что в конечном итоге приводит к повышению экспрессии генов провоспа-лительных цитокинов, инициирующих базисную воспалительную реакцию [5]. Известно, что воздействие ГМДП вызывает стимуляцию эффек-торных функций фагоцитов (фагоцитоз, синтез активных форм кислорода, активация микроби-цидных систем, презентация антигенов) [8], тем не менее исследования влияния ГМДП на экспрессию мембранных рецепторов CD62L, CD63, CD66d НГ до настоящего времени не проводилось. Таким образом, создание экспериментальных моделей дисфункций НГ и экспериментальный поиск новых иммунотропных субстанций,
действие которых будет корректировать работу дефектно функционирующих НГ, является, с нашей точки зрения, перспективным направлением и представляет определенный интерес.
Цель исследования — оценить особенности влияния ГМДП на экспериментально трансформированный фенотип НГ условно здоровых лиц, экспрессирующих молекулы CD62L, CD63, CD66d в системе in vitro.
Материалы и методы
Исследованы 40 образцов НГ периферической крови 10 условно здоровых лиц обоего пола в возрасте от 26 до 66 лет. Оценка экспрессии рецепторов на мембране НГ проводилась методом проточной цитометрии с использованием проточного цитофлуориметра FC 500 (Beckman Coulter, США) и конъюгатов моноклональных антител CD62L-ECD, CD63-FITC, CD66d-PE (Beckman Coulter International S.A., Франция). Оценивали относительное количество НГ (% НГ), экспрессирующих мембранные CD62L, CD63, CD66d рецепторы и интенсивность их экспрессии по MFI (middle fluorescence intensity). Для создания моделей in vitro были использованы N-формил-метионил-лейцил-фенилаланин (fMLP) и глюкозаминилмурамилдипептид (ГМДП).
На первом этапе проведена оценка количества интактных НГ, экспрессирующих CD62L, CD63, CD66d молекулы с параллельной детекцией интенсивности их экспрессии по MFI (контрольная группа). На втором этапе для создания в системе in vitro экспериментальной модели трансформированного фенотипа НГ, экспрессирующих CD62L, CD63, CD66d молекулы (экспериментальная модель 1), использовали N-формил-метионил-лейцил-фенилаланин (fMLP), который является пептидом бактериального происхождения, активирующим фагоцитоз, дегрануляцию и метаболизм кислородзависи-мых микробицидных систем НГ. Образцы цельной крови условно здоровых лиц инкубировали с fMLP в конечной концентрации 7 х 10-7 М в течение 1 часа при температуре 37 °С. Далее оценивали особенности трансформированного фенотипа НГ. На третьем этапе оценивали влияние в системе in vitro глюкозаминилмурамилдипептида (ГМДП) на неизмененный фенотип НГ, экс-прессирующих мембранные молекулы CD62L, CD63, CD66d условно здоровых лиц (экспериментальная модель 2). Образцы цельной крови условно здоровых лиц инкубировали с ГМДП в конечной концентрации 10-6 г/л в течение 1 часа при температуре 37 °С. На четвертом этапе оценивали совместное одномоментное влияние fMLP в конечной концентрации 7 х 10-7 М
и ГМДП в конечной концентрации 10-6 г/л на фенотип НГ условно здоровых лиц, экспрессирую-щих мембранные CD62L, CD63, CD66d (экспериментальная модель 3). Инкубацию проводили в течение 1 часа при температуре 37 °С. Оценка относительного количества НГ, экспрессирую-щих CD62L, CD63, CD66d молекулы на фоне детекции по MFI уровня экспрессии исследуемых рецепторов, была проведена во всех экспериментальных моделях in vitro.
Полученные результаты исследования были обработаны при помощи методов вариационной статистики и представлены в виде среднего значения с показателем стандартной ошибки и минимального, максимального значения (M±m [min; max]). При анализе количественных признаков оценка достоверности различий между группами проводилась с использованием непараметрического критерия Манна—Уитни. Различия, связи и зависимости считали статистически значимыми при р < 0,05. Ввод данных — в таблицах Microsoft Excel 2007. Обработка результатов проводилась с использованием пакета прикладных программ IBM SPSS Statistics 20.
Результаты и обсуждение
Анализ полученных данных показал, что у условно здоровых лиц относительное количество интактных НГ, несущих CD62L, CD63
и CD66d рецепторы, составило: CD62L+НГ — 94,19±0,63 [92,20; 96,50] с плотностью оснащения по MFI 5,08±0,24 [4,29; 6,20]; CD63+НГ -99,83±0,09 [99,10; 100,00] с MFI 3,14±0,06 [2,81; 3,41]; CD66d+НГ - 78,07±1,54 [72,30; 81,40] с уровнем экспрессии по MFI 2,29±0,06 [2,09; 2,58] (табл. 1).
Культивирование образцов периферической крови с fMLP (экспериментальная модель 1) способствовало значительному снижению относительного количества CD62L+НГ в 1,7 раза (на 58,7% -с 94,19±0,63 до 55,29±3,40) [42,10; 70,60] (р < 0,01), коэффициент регрессии составил 0,6±0,11. При этом наблюдалось уменьшение плотности данного рецептора на мембране НГ в 2,24 раза (на 44,7%) в сравнении с контрольными показателями (р < 0,01) (в частности, MFI CD62L составил 2,27±0,11 [1,86; 2,70]), коэффициент регрессии был равен 0,4±0,06. Кроме того, под влиянием fMLP умеренно, но достоверно увеличилась плотность экспрессии молекул CD63+НГ с 3,14±0,07 [2,81; 3,41] до 3,52±0,08 [3,23; 3,90] (р < 0,05), при этом относительное количество CD63+НГ не отличалось от контрольных значений. Следует отметить, что инкубация образцов периферической крови с fMLP не привела к достоверному изменению уровня CD66d+НГ (82,54±1,1 [78,50; 86,60])
ТАБЛИЦА 1. ОСОБЕННОСТИ ЭКСПРЕССИИ МОЛЕКУЛ CD62L, CD63, CD66d НА ПОВЕРХНОСТНОЙ МЕМБРАНЕ ИНТАКТНЫХ НГ И НГ, ПОДВЕРГНУТЫХ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫМ ВОЗДЕЙСТВИЯМ
TABLE 1. PECULIARITIES OF THE EXPRESSION OF CD62L, CD63, CD66d MOLECULES ON THE SURFACE MEMBRANE OF INTACT NG AND NG, SUBJECTED TO EXPERIMENTAL INFLUENCE
^"""---.....Фенотип Phenotype Группы Groups CD62L CD63 CD66d
% НГ % NG MFI % НГ % NG MFI % НГ % NG MFI
Контроль (интактные НГ) Control (intact NG) 94,19±0,63 [92,20; 96,50] 5,08±0,24 [4,29; 6,20] 99,83±0,09 [99,10; 100,00] 3,14±0,066 [2,81; 3,41] 78,07±1,54 [72,30; 81,40] 2,29±0,06 [2,09; 2,58]
Экспериментальная модель 1 - fMLP Experimental model 1 - fMLP 55,29±3,40 [42,10; 70,60] P ** 2,27±0,11 [1,86; 2,70] P ** P1** 99,92±0,05 [99,50; 100,00] 3,52±0,077 [3,23; 3,90] P1* 82,54±1,18 [78,50; 86,60] 2,40±0,05 [2,22; 2,54]
Экспериментальная модель 2 - ГМДП Experimental model 2 - GMDP 92,68±0,63 [90,80; 94,80] 4,76±0,31 [4,01; 5,88] 99,78±0,07 [99,30; 100,00] 3,21±0,075 [3,00; 3,46] 88,27±1,48 [83,90; 92,40] P1** 2,38±0,09 [2,05; 2,69]
Экспериментальная модель 3 - fMLP + ГМДП Experimental model 3 -fMLP + GMDP 77,33±1,98 [72,30; 84,30] Pi**, P2**, P3** 2,79±0,15 [2,34; 3,15] P1**, P2*,P3** 99,92±0,05 [99,50; 100,00] 3,44±0,068 [3,23; 3,59] P1** 85,69±1,30 [80,40; 90,00] P1** 2,38±0,06 [2,22; 2,64]
Примечание. p, - достоверность различий между контролем и экспериментальными моделями; p2 -достоверность различий между экспериментальной моделью 1 и моделью 3; p3 - достоверность различий между экспериментальной моделью 2 и моделью 3; * - p < 0,05; ** - р < 0,01.
Note. p1, reliability of differences between the control and the experimental models; p2, reliability of differences between the experimental model 1 and model 3; p3, reliability of differences between the experimental model 2 and model 3; *, p < 0.05; **, р < 0.01.
Экспериментальная модель 3 - fMLP + ГМДП Experimenta model 3 - fMLP + GMDP
Экспериментальная модель 2 - ГМДП Experimental model 2 - GMDP
Экспериментальная модель 1 - fMLP Experimental model 1 - fMLP
Контроль (интактные НГ) Control (intact NG)
I_S5,69 Экспериментальная модель 3 - fMLP + ГМДП
77,33*
Ц 99,92
5,27* 99,78
J 92,68
П 82,54
Г5529* ~178,07
99,92
□ % CD66d НГ % CD66d NG
□ % CD63 НГ % CD63 NG
99,83 94,19
> CD62L НГ
> CD62L NG
Experimenta model 3 - fMLP + GMDP
Экспериментальная модель 2 - ГМДП Experimental model 2 - GMDP
Экспериментальная модель 1 - fMLP Experimental model 1 - fMLP
Контроль (интактные НГ) Control (intact NG)
3,44*
□ MFI CD66d
□ MFI CD63
MFI CD62L
Рисунок 1. Фенотипический профиль нейтрофильных гранулоцитов в экспериментах in vitro Примечание. * - p < 0,05 (достоверность различий между контролем и экспериментальными моделями).
Figure 1. Phenotypic profile of neutrophilic granulocytes in experiments in vitro
Note. *, p < 0.05 (reliability of differences between the control and the experimental models).
и MFI CD66d (2,4±0,05 [2,22; 2,54]) в сравнении с контрольными показателями (рис. 1, 2).
Выявленная динамика перераспределения изучаемых поверхностных мембранных молекул CD62L, CD63, CD66d НГ под воздействием fMLP, полученная в созданной в системе in vitro экспериментальной модели 1 по трансформации фенотипа CD62L+CD63+CD66d+НГ, сходна с ранее выявленными нами изменениями экспрессии молекул CD62L и CD63 у новорожденных с врожденной пневмонией и пневмонией тяжелого течения, осложненной сепсисом, в виде снижения относительного количества CD62L+CD63+НГ и уровня плотности экспрессии CD62L+НГ на фоне увеличения уровня экспрессии CD63+OT [10].
В созданной на третьем этапе исследования экспериментальной модели 2 проводилась оценка влияния регуляторного ГМДП на НГ условно здоровых лиц. После инкубации образцов крови с ГМДП наблюдалось умеренное повышение относительного количества НГ (по сравнению с контролем), экспрессирующих CD66d+НГ: с 78,07±1,54до 88,27±1,48 [83,90; 92,40] (p < 0,01), при этом плотность экспрессии этой молекулы была неизменна (табл. 1). Полученные данные продемонстрировали отсутствие позитивных и негативных влияний ГМДП на относительный уровень CD62L^^ CD63+НГ и плотность их экспрессии по сравнению с контролем (рис. 2).
Оценка одномоментного комбинированного воздействия fMLP и ГМДП на четвертом этапе
Рисунок 2. Изменение уровня интенсивности оснащения рецепторами CD62L, CD63, CD66d нейтрофильных гранулоцитов в экспериментах in vitro Примечание. * - p < 0,05 (достоверность различий между контролем и экспериментальными моделями). Figure 2. Changing of intensity level equipment receptors CD62L, CD63, CD66d of neutrophilic granulocytes in experiments in vitro
Note. *, p < 0.05 (reliability of differences between the control and the experimental models).
исследования (экспериментальная модель 3) позволила установить нивелирование выявленных ранее негативных эффектов fMLP на CD62L+НГ. Так, под влиянием ГМДП значительно увеличилось количество CD62L+НГ с 55,29% (моновлияние fMLP) до 77,33±1,98 [72,30; 84,30] (р < 0,01) (рис.1). Кроме того, умеренно возросла плотность экспрессии молекул CD62L с 2,27±0,11 [1,86; 2,70] до 2,79±0,15 [2,34; 3,15] (р < 0,05). Однако при этом ГМДП не корректировал негативное влияние fMLP на относительное количество CD63+OT и CD66d+OT и плотность CD63 и CD66d рецепторов на поверхностной мембране НГ (табл. 1, рис. 2). Следует отметить, что одновременная инкубация НГ с fMLP и ГМДП привела к достоверному приросту относительного количества CD66d+НГ (85,69±1,30 против 78,07±1,54 в контроле, p < 0,01) и достоверному увеличению плотности CD63+НГ в сравнении с контролем (3,44±0,07 против 3,14±0,07 в контроле, соответственно, p < 0,01). Таким образом, выявлен иммуномодулирующий эффект ГМДП — нивелирование негативных трансформационных изменений фенотипических характеристик НГ, которые были вызваны влиянием бактериального пептида fMLP, наиболее выраженные в отношении значимого восстановления количества НГ, экспрессирующих CD62L, и полного восстановления плотности экспрессируе-мых на мембране НГ CD62L, что, с нашей точки зрения, важно для полноценного перемещения НГ к очагу воспаления.
Выводы
1. Под влиянием бактериального пептида fMLP в созданной в системе in vitro экспериментальной модели получена трансформация фенотипа НГ условно здоровых субъектов, одномоментно экспрессирующих CD62, CD63, CD66d молекулы: значительно уменьшилось как количество НГ, экспрессирующих CD62L, так и плотность экспрессии CD62L с параллельным повышением плотности экспрессии CD63.
2. Воздействие ГМДП на нетрансформиро-ванный фенотип НГ условно здоровых субъектов не изменяло количество CD62L+НГ и CD63^^ не менялась и плотность экспрессии CD62L и CD63 на поверхностной мембране НГ, однако при этом достоверно увеличилось количество CD66d^^ при неизменившейся плотности экспрессии молекул CD66d.
3. ГМДП, введенный одномоментно с бактериальным пептидом fMLP, нивелировал некото-
рые трансформационные изменения фенотипа НГ, возникающие под влиянием fMLP: на 22,04% восстановилось количество CD62L+НГ и достоверно возросла плотность экспрессии CD62L; при этом ГМДП не корректировал негативное влияние fMLP на количество CD63+OT и CD66d+OT и плотность экспрессии молекул CD63 и CD66d.
4. Одномоментное введение fMLP и ГМДП достоверно увеличило количество CD66d+НГ и плотность экспрессии молекул CD63 на мембране CD63+НГ по сравнению с интактными НГ условно здоровых субъектов.
5. Полученные данные представляют определенный интерес для разработки новых имму-нотерапевтических стратегий, направленных на коррекцию негативно трансформированного фенотипа НГ при нетипично протекающих ин-фекционно-воспалительных заболеваниях бактериальной этиологии.
Список литературы / References
1. Нестерова И.В., Колесникова Н.В., Чудилова Г. А., Ломтатидзе Л.В., Ковалева С. В., Евглевский А.А., Нгуен Т.З.Л. Новый взгляд на нейтрофильные гранулоциты: переосмысление старых догм // Инфекция и иммунитет, 2017. Т. 7, № 3. С. 219-230. [Nesterova I.V., Kolesnikova N.V., Chudilova G.A., Lomtatidze L.V., Kovaleva S.V., Evglevsky A.A., Nguyen T.D.L. A new look at neutrophilic granulocytes: rethinking old dogmas. Infektsiya i immunitet = Russian Journal of Infection and Immunity, 2017, Vol. 7, no. 3, pp. 219-230. (In Russ.)] doi: 10.15789/2220-7619-2017-3-219-230.
2. Нестерова И.В., Евглевский А.А., Чудилова Г. А., Фомичева Е.В., Ковалева С. В., Ломтатидзе Л.В. Реструктуризация хроматина нейтрофильных гранулоцитов в норме и патологии / Под ред. И.В. Нестеровой и А.А. Евглевского. М.: Capricorn Publishing, Inc., 2017. 356 с. [Nesterova I.V., Evglevsky A.A., Chudilova G.A., Fomicheva E.V., Kovaleva S.V., Lomtatidze L.V. Chromatin restructuring of neutrophilic granulocytes in normal and pathology. Ed. by I.V. Nesterova and A.A. Evglevsky. Moscow: Capricorn Publishing, Inc., 2017. 356 p.]
3. Савченко А.А., Борисов А.Г., Кудрявцев И.В., Гвоздев И.И., Мошев А.В., Черданцев Д.В., Перво-ва О.В. Взаимосвязь фенотипа и метаболизма нейтрофилов крови у больных распространенным гнойным перитонитом в динамике послеоперационного периода // Инфекция и иммунитет, 2017. Т. 7, № 3. С. 259-270. [Savchenko A.A., Borisov A.G., Kudryavtsev I.V., Gvozdev 1.1., Moshev A.V., Cherdantsev D.V., Pervova O.V. Interrelation of the phenotype and metabolism of blood neutrophils in patients with advanced purulent peritonitis in the dynamics of the postoperative period. Infektsiya i immunitet = Russian Journal of Infection and Immunity, 2017, Vol. 7, no. 3, pp. 259-270. (In Russ.)] doi: 10.15789/2220-7619-2017-3-259-270.
4. Boer K., Vogelsang H., Deufel T., Pfister W., Kiehntopf M. CD62L on neutrophil granulocytes, a useful, complementary marker for the prediction of ventriculitis in blood-containing CSF. Clin. Biochem., 2010, Vol. 43, no. 16-17, pp. 1351-1355.
5. Boyle J.P., Parkhouse R., Monie T.P. Insights into the molecular basis of the NOD2 signalling pathway. Open Biol., 2014, Vol. 4, no. 12, pp. 140-178.
6. Cortjens B., Ingelse S.A., Calis J.C., Valar A.P., Koendetman L., Bem R.A., van Woensel J.B. Neutrophil subset responses in infants with severe viral respiratory infection. Clin. Immunol., 2017, Vol. 176, pp. 100-106.
7. de Jong E., de Lange D.W., Beishuizen A., van de Ven P.M., Girbes A.R., Huisman A. Neutrophil CD64 expression as a longitudinal biomarker for severe disease and acute infection in critically ill patients. Int. J. Lab. Hematol., 2016, Vol. 38, no. 5, pp. 576-584.
8. Laman A.G., Lathe R., Shepelyakovskaya A.O., Gartseva A., Brovko F.A., Guryanova S., Alekseeva L., Meshcheryakova E.A, Ivanov V.T. Muramyl peptides activate innate immunity conjointly via YB1 and NOD2. Innate Immunity, 2016, Vol. 22, no. 8, pp. 1-8.
9. Naegelen I., Beaume N., Plan£on S., Schenten V., Tschirhart E.J., Brechard S. Regulation of neutrophil degranulation and cytokine secretion: a novel model approach based on linear fitting. J. Immunol. Res., 2015, Vol. 2015, 817038. doi:10.1155/2015/817038.
10. Nesterova I.V., Chudilova G.A., Lomtatidze L.V., Kleschenko E., Kovaleva S. Smerchinskaya T., Sapun O. Three neutrophilic granulocyte's subpopulations CD62LdlmCD63dim, CD62LbrlghtCD63dlm and CD62LdlmCD63mld in newborns with congenital pneumonia. In: Allergy, John Wiley & Sons A/S, Barcelona, 2015, 70, Suppl. S101, p. 217.
11. Qian W., Huang G.Z. Neutrophil CD64 as a marker of bacterial infection in acute exacerbations of chronic obstructive pulmonary disease. Immunol. Invest., 2016, Vol. 45, no. 6, pp. 490-503.
12. Skubitz K.M., Campbell K.D., Skubitz A.P. CD66a, CD66b, CD66c, and CD66d each independently stimulate neutrophils. J. Leukoc. Biol., 1996, Vol. 60, no. 1, pp. 106-117.
13. Skubitz K.M., Campbell K.D., Skubitz A.P. Synthetic peptides of CD66a stimulate neutrophil adhesion to endothelial cells. J. Immunol., 2000, Vol. 164, no. 8, pp. 4257-4264.
Авторы:
Нестерова И.В. — д.м.н., профессор, профессор кафедры аллергологии и иммунологии ФПКМР Медицинского института ФГАОУ ВО «Российский университет дружбы народов» Министерства образования и науки РФ, Москва; главный научный сотрудник отдела клинической и экспериментальной иммунологии и молекулярной биологии Центральной научно-исследовательской лаборатории ФГБОУ ВО «Кубанский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения РФ, г. Краснодар, Россия
Малиновская В.В. — д.б.н., профессор, руководитель лаборатории онтогенеза и коррекции системы интерферона ГУ «Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени Н.Ф. Гамалеи Российской академии медицинских наук», Москва, Россия
Хайдуков С.В. — д.б.н., старший научный сотрудник отдела химической биологии гликанов и липидов ФГБУН «Институт биоорганической химии имени академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова», Москва, Россия Нгуен Тхи Зеу Лен — аспирант кафедры аллергологии и иммунологии ФПК МР Медицинского института ФГАОУ ВО «Российский университет дружбы народов» Министерства образования и науки РФ, Москва, Россия
Чудилова Г.А. — к.б.н., доцент, заведующая отделом клинической и экспериментальной иммунологии и молекулярной биологии Центральной научно-исследовательской лаборатории ФГБОУ ВО «Кубанский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения РФ, г. Краснодар, Россия
Ломтатидзе Л.В. — к.б.н., старший научный сотрудник отдела клинической и экспериментальной иммунологии и молекулярной биологии Центральной научно-исследовательской лаборатории ФГБОУ ВО «Кубанский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения РФ, г. Краснодар, Россия
Поступила 03.03.2018 Принята к печати 13.03.2018
Authors:
Nesterova I.V., PhD, MD (Medicine), Professor, Department of Allergology and Immunology at the Medical Institute, People's Friendship University of Russia, Moscow; Chief Research Associate, Central Research Laboratory, Kuban State Medical University, Krasnodar, Russian Federation
Malinovskaya V.V., PhD, MD (Biology), Professor, Head, Laboratory of Ontogenesis and Correction of Interferon System, N. Gamaleya Research Institute of Epidemiology and Microbiology, Moscow, Russian Federation
Khaydukov S.V., PhD, MD (Biology), Senior Research Associate, Department of Chemical Biology of Glycans and Lipids, M. Shemyakin and Yu. Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry, Moscow, Russian Federation Nguyen Thi Dieu Lien, Postgraduate Student, Department of Allergology and Immunology, People's Friendship University of Russia, Moscow, Russian Federation
Chudilova G.A., PhD (Biology), Associate Professor, Head, Department of Clinical and Experimental Immunology and Molecular Biology, Central Research Laboratory, Kuban State Medical University, Krasnodar, Russian Federation
Lomtatidze L.V., PhD (Biology), Senior Research Associate, Department of Clinical and Experimental Immunology and Molecular Biology, Central Research Laboratory, Kuban State Medical University, Krasnodar, Russian Federation
Received 06.03.2018 Accepted 13.03.2018
