CC BY
50
УДК 577.151.4
Глутамилэндопептидазы: загадка субстратной специфичности
И. В. Демидюк*, К. Н. Чухонцева, С. В. Костров
Институт молекулярной генетики РАН, 123182, Москва, пл. Академика Курчатова, 2 *E-mail: duk@img.ras.ru Поступила в редакцию 02.11.2016 Принята к печати 22.02.2017
РЕФЕРАТ Глутамилэндопептидазы (ГЭПазы) - ферменты, относящиеся к структурной группе химотрип-сина и предпочтительно гидролизующие связи а-карбоксильных групп глутаминовой кислоты. Несмотря на многолетнюю историю исследований, структурные детерминанты, определяющие строгую субстратную специфичность ГЭПаз, остаются невыясненными. В обзоре обобщены данные о молекулярных механизмах, лежащих в основе субстратных предпочтений ГЭПаз, а также кратко рассмотрены современные направления изучения этих ферментов.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА глутамилэндопептидаза, протеаза V8, субстратная специфичность, химотрипсиноподоб-ная протеаза, 3С-подобная сериновая протеаза, эпидермолитический токсин.
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ГЭПаза - глутамилэндопептидаза; ХПП - химотрипсиноподобная протеаза; 3Cpro -3С протеаза пикорнавируса; 3CLpro - 3С-подобная протеаза; 3CLSP - 3С-подобная сериновая протеаза; BIGEP - ГЭПаза Bacillus intermedius; Boc-AAPE - трет-бутилоксикарбонил-Ala-Ala-Pro-Glu; EAV-Nsp4 -неструктурный белок 4 вируса инфекционного артериита лошадей; Esp - внеклеточная сериновая протеаза Staphylococcus epidermidis; ET - эпидермолитический токсин; ETA и ETB - эпидермолитические токсины A и B Staphylococcus aureus; Glu-SGP - ГЭПаза Streptomyces griseus; Glu/Gln-P1 - аминокислотный остаток в положении P1 субстрата; Glu-V8 - протеаза V8 S. aureus; HAstV-pro - протеаза астровируса человека; PDB ID - номер доступа в Protein Data Bank (http://www.rcsb.org); PRRSV-Nsp4 - неструктурный белок 4 вируса репродуктивного и респираторного синдрома свиней; SeMV-pro - протеаза вируса мозаики сесбании.
ГЛУТАМИЛЭНДОПЕПТИДАЗЫ - ЧЛЕНЫ СТРУКТУРНОГО СЕМЕЙСТВА ХИМОТРИПСИНА
Глутамилэндопептидазы (ГЭПазы) - ферменты, предпочтительно гидролизующие связи а-карбоксильных групп глутаминовой кислоты [1, 2]. К настоящему времени охарактеризованы ГЭПазы целого ряда грамположительных бактерий [3-22], а также (+)РНК-вирусов [23-25]. Все ГЭПазы входят в структурное семейство химотрипсина - одно из самых обширных и хорошо изученных. Молекулы химотрипсиноподобных протеаз (ХПП) имеют общий принцип пространственной организации, так называемый химотрипсиновый (или трипсиновый) фолд (рис. 1). Ключевым для определения места гидролиза субстрата ХПП является остаток в положении Р1 (по номенклатуре Шехтера и Бергера: расщепляемая связь субстрата находится после остатка Р1, которому соответствует S1-связывающий сайт фермента [26]). Традиционно, как и в случае панкреатических сериновых протеаз, ХПП, исходя из первичной субстратной специфичности, делят на три основные группы: 1) гидролизующие связи, образованные а-карбоксильными группами крупных гидрофобных
аминокислотных остатков (химотрипсиноподобная специфичность); 2) расщепляющие связи после положительно заряженных остатков (трипсиноподобная специфичность) и 3) предпочитающие малые гидрофобные остатки в положении P1 (эластазоподобная специфичность) [27]. Кроме того, обнаружены ХПП со специфичностью смешанного типа. Например, коллагенолитические ферменты крабов сочетают специфичность трипсина, химотрипсина и эластазы [28], а дуоденаза крупного рогатого скота [29] и катеп-син G [30] способны эффективно гидролизовать субстраты как трипсина, так и химотрипсина. Известны ХПП, расщепляющие связи преимущественно после остатка Gln, например, многие ЗС-подобные протеа-зы вирусов [23], а также специфичные к отрицательно заряженным аминокислотным остаткам - гран-зим B, предпочтительно гидролизующий связи после остатков Asp [31], и ГЭПазы, которым посвящен данный обзор.
Молекулы ХПП состоят из двух перпендикулярных Р-цилиндрических доменов и C-концевой а-спирали (рис. 1). Каталитический и субстратсвя-зывающий сайты находятся в щели между дву-
мя Р-цилиндрами. Функционально существенные остатки локализованы преимущественно в петлях, соединяющих Р-тяжи. Sl-карман, расположенный рядом с каталитическим остатком Ser(Cys)195 (здесь и далее нумерация по химотрипсину), сформирован участками 189-192, 214-216 и 224-228. В большинстве случаев ключевыми детерминантами субстратной специфичности являются остатки в позициях 189, 216 и 226 [32, 33]. Причем у ферментов, узнающих заряженные остатки в положении P1, в позиции 189 (Asp у трипсина [34]) или 226 (Arg у гранзима B [35], Glu у катепсина G [36], Asp у коллагеназы краба [37] и дуоденазы [38]) находятся остатки-компенсаторы заряда субстрата. Это позволяет полагать, что первичная субстратная специфичность ХПП контролируется относительно небольшим числом структурных элементов сайта S1. Однако простой перенос этих структурных элементов из одной молекулы в другую не приводит к «переключению» субстратной специфичности.
Как показано на примере конверсии трипсина в химотрипсин, на специфичность влияет также целый набор удаленных структурных элементов, не взаимодействующих с субстратом непосредственно. Сайты S1 обоих ферментов сходны. Однако замена главной детерминанты связывания заряженных субстратов трипсина Asp189 на Ser, характерный для химотрипсина, не приводит к возникновению соответствующей специфичности. Вместо этого формируется низкоэффективная неспецифичная протеаза [39]. Создание химотрипсиноподобной специфичности требует замены четырех остатков в S1-кармане вместе с модификацией удаленных от S1-сайта областей: двух поверхностных петель, которые не контактируют с субстратом непосредственно [40], и остатка Tyr172 [41]. Сравнение кристаллических структур и кинетических характеристик полученных вариантов со структурами и каталитическими свойствами химотрипсина и трипсина показывает, что дополнительные модификации существенны не для связывания собственно остатка P1, а для точного позиционирования расщепляемой связи относительно каталитического центра белка: пары Ser195-His57 и оксианионной впадины [40-43].
Таким образом, основываясь на данных о структурных детерминантах субстратной специфичности ХПП, можно ожидать, что предпочтительный выбор ГЭПазами отрицательно заряженных аминокислотных остатков в положении P1 определяется теми же участками полипептидной цепи, что и у других ферментов группы. Причем ключевой структурной детер-минантой специфичности, как у всех распознающих заряженные Р1-остатки ХПП, должен быть локализованный в S1-кармане компенсатор заряда субстрата.
Рис. 1. Пространственная структура химотрипсина (PDB ID - 5cha). Показана структура остатков каталитической триады. Области, формирующие Si-карман, выделены синим цветом; позиции, соответствующие ключевым остаткам Si-кармана, - сиреневым. Все рисунки, содержащие изображения пространственных структур белков, построены с помощью PyMOL Molecular Graphics System (www.pymol.org)
В качестве кандидата на эту роль по аналогии можно предложить остаток Arg или Lys в положении 189 или 226. В то же время следует помнить, что для высокоэффективного взаимодействия с Р1-остатком существенна структура регионов, удаленных от S1.
ГЛУТАМИЛЭНДОПЕПТИДАЗА STREPTOMYCES GRISEUS
Первой ГЭПазой, пространственная структура которой была установлена, стала Glu-специфичная протеаза S. griseus (Glu-SGP) (PDB ID - 1hpg) [44]. Структура этого фермента в целом типична для ХПП (рис. 2A) и имеет наибольшее сходство с бактериальными ХПП (протеазами А и В из Str. griseus и а-литической протеазой). Общая геометрия области S1 также очень близка к геометрии этой области у перечисленных бактериальных ферментов. Вопреки ожиданиям, в структуре Sl-сайта не удалось обнаружить явного компенсатора отрицательного заряда субстрата - остатка Lys или Arg. Карбоксильная группа Glu в положении P1 субстрата формирует водородные связи с Ser190 (192 в нумерации [44]), Ser216 и His213. Таким образом, эти остат-
Рис. 2. Пространственная структура глутамилэндопептидазы Streptomyces griseus (Жрд). А - общий вид. Б -гистидиновая триада. Фиолетовым цветом выделен лиганд Вос-ААРЕ (защитная группа не показана); остатки каталитической триады - синим; остатки, непосредственно взаимодействующие с карбоксильной группой Glu-Р1, - оранжевым; гистидиновая триада - желтым. Молекулы воды представлены синими сферами. Расстояния приведены в ангстремах
ки, вероятно, играют ключевую роль в узнавании субстрата. Боковая цепь гистидина способна нести положительный заряд. Однако, если считать, что pKa бокового радикала His213 в отсутствие субстрата равна 6.4, то при pH 8.5, оптимальном для функционирования Glu-SGP, имидазольное кольцо будет протонировано менее чем на 1%, и, следовательно, гистидин должен быть нейтральным [44]. В то же время значение pKa аминокислотных остатков в белке может существенно варьировать в зависимости от окружения [45].
Анализ структуры Glu-SGP выявил в ней так называемую гистидиновую триаду, в состав которой, кроме His213, входят His199 и His228. Три остатка His пронизывают С-концевой ß-цилиндрический домен, формируя цепь водородных связей, соединяющую карбоксильную группу Glu-P1 субстрата и, через связанные с ферментом две молекулы воды, N-концевой обвод С-концевой а-спирали молекулы (рис. 2Б). Постулировалось, что именно эта структура обеспечивает перенос положительного заряда, компенсирующего заряд субстрата, с микродиполя а-спирали на His213 субстратсвязывающей области [44]. Отметим, что у глутамилэндопептидаз остатки гистидиновой триады не консервативны [46] и, кроме Glu-SGP, обнаружены лишь у высокогомологичного фермента из Str. fradiae [13].
Роль остатков, формирующих Sl-карман и ги-стидиновую триаду Glu-SGP, была изучена с помощью сайт-направленного мутагенеза. Любые модификации Ser190(192) (Ala/Gly/Asn/Thr/Val) и His213 (Ala/Gly/Lys/Asn/Arg/Ser/Val) приводят к прекращению автокаталитического процессинга (по связи Glu(-l)-Vall) предшественника ГЭПазы, что доказывает принципиальную роль этих остатков в формировании Sl-сайта. В то же время Ser216, по-видимому, менее важен, так как его замена на Ala или Gly не приводит к потере ферментом соответствующей активности. Похожий результат наблюдается и при некоторых модификациях остатков гисти-диновой триады: мутации ffis199^Val и His228^Ala/ Asp/Asn/Ser/Val не препятствуют процессингу фермента. Все мутантные белки (ffis199^Val, Ser216^Ala, Ser216^Gly и His228^Ala), специфичность которых была исследована, сохраняли предпочтение к субстратам с Glu-P1 [47]. Итак, гипотеза о важности ги-стидиновой триады для компенсации заряда не была подтверждена экспериментально, и на ключевые роли в распознавании субстрата вышли остатки Ser190(192) и His213.
Таким образом, с одной стороны, известна структура Sl-сайта. С другой стороны, неясно, каким образом формирующие этот сайт элементы могут обеспечивать наблюдаемую субстратную специфич-
ность. Это противоречие становится еще более явным при рассмотрении данных о структуре и специфичности вирусных 3С-подобных сериновых протеаз.
ВИРУСНЫЕ 3С-ПОДОБНЫЕ СЕРИНОВЫЕ ПРОТЕАЗЫ
Процессинг полибелков-предшественников является важной частью жизненного цикла большинства (+)РНК-вирусов [48-50] и обычно осуществляется при участии вирусных папаиноподобных или химо-трипсиноподобных протеаз, которые входят в состав полибелка [51]. Большинство ХПП (+)РНК-вирусов это цистеиновые протеазы, например, 3С протеазы (3Cpro) пикорнавирусов или 3С-подобные протеазы (3CLpro) корона-, поти- или комовирусов [49]. В то же время обнаружены ферменты, активные центры которых содержат каталитический остаток серина. Такие белки обозначаются как 3С-подобные сериновые протеазы (3CLSP) [23]. ХПП ( + )РНК-вирусов проявляют узкую субстратную специфичность. Сайты гидролиза 3С и 3С-подобных проте-аз в целом похожи и обычно содержат остаток Gln или Glu в позиции P1 в сочетании с расположенным за ним небольшим аминокислотным остатком (Gly, Ala или Ser) [23, 52]. При этом одни протеазы ги-дролизуют связи, образованные как Gln, так и Glu [53-57]. Другие ферменты предпочитают Gln-P1 (например, 3Cpro и 3CLpro пикорна- и коронавирусов [23, 48]) или являются истинными ГЭПазами, расщепляющими полипептидную цепь после Glu. Такую специфичность проявляют ХПП артери- [23], собемо-[25] и астровирусов [24].
ГЭПазы артеривирусов, обозначаемые как Nsp4 (неструктурный белок 4) [23], являются сериновыми протеазами [58, 59]. К настоящему времени изучены свойства и установлены пространственные структуры Nsp4 вируса артериита лошадей (EAV) и вируса репродуктивного и респираторного синдрома свиней (PRRSV). Пространственная структура EAV-Nsp4 в целом типична для ХПП (PDB ID - 1mbm). В то же время каталитический домен фермента, сформированный двумя перпендикулярными Р-цилиндрами, дополнен С-концевым расширением (рис. 3A) [60]. Структура PRRSV-Nsp4 (PDB ID - 3fan) сходна со структурой EAV-Nsp4, заметно отличаясь, однако, взаимным расположением каталитического и С-концевого доменов (рис. 3Б) [59].
Организация Sl-участков EAV-Nsp4 и Glu-SGP очень близка (рис. 4A). Карман S1 содержит те же три основных структурных элемента: His213 (134 в EAV-Nsp4, 1198 в полибелке), Thr190 (115, 1179), соответствующий Ser190 у Glu-SGP, и Ser216 (137, 1201) [60]. Все три остатка сохранены и в первичной структуре PRRSV-Nsp4 [58, 59]. Однако, судя по результатам рентгеноструктурного анализа, S1-сайт последнего
фермента имеет иную, чем у EAV-Nsp4 и Glu-SGP, структуру (рис. 4Б). Положение участка полипептидной цепи 190-194 (113-117 в PRRSV-Nsp4) изменено по сравнению с большинством ХПП, что приводит к нетипичной конфигурации оксианионной впадины и существенному удалению Thr190 (113) от карбоксильной группы Glu-P1. Кроме того, методом рентгеноструктурного анализа не удается определить положение содержащей Ser216 петли 216-220 (136-140), что свидетельствует о высокой подвижности этого участка. Расположение наиболее консервативного остатка S1-участка - His213 (133) в трех упомянутых белках не отличается [59]. Возможно, наблюдаемая картина не отражает состояние PRRSV-Nsp4 в растворе, а представляет артефакт кристаллизации свободного фермента.
Важность остатков His213 и Thr190 для функционирования EAV-Nsp4 подтверждена экспериментами по сайт-направленному мутагенезу. Путем модификации остатков каталитической триады показано, что процессинг полибелка с расщеплением связей после остатков Glu зависит от активности EAV-Nsp4. К полному прекращению процессинга приводили и модификации ffis213(1198)^Lys/Arg/Tyr. Тот же эффект вызывала замена Thr190(1179)^Asp, однако мутации Thr190(1179)^Ser/Gly лишь несколько снижали эффективность процессинга [58]. В совокупности с данными, полученными на модели Glu-SGP, эти результаты показывают принципиальное значение His213 и существенно меньшую важность остатков в позициях 190 и 216 для гидролиза специфических субстратов ГЭПазами. В то же время остается неясным, является ли His213 ключевым элементом в распознавании заряженного субстрата, а также какой вклад в формирование субстратной специфичности вносят Thr/Ser190 и Ser216. Помочь разобраться с некоторыми из этих вопросов может анализ структур других вирусных ГЭПаз.
Протеаза вируса мозаики сесбании (SeMV-pro) имеет типичную для ХПП пространственную структуру (PDB ID - 1zyo), которая ближе к структурам клеточных (в частности, Glu-SGP), а не вирусных представителей семейства (рис. 3B) [61]. Протеаза имеет классическую каталитическую триаду, модификация остатков которой приводит к прекращению процессинга полибелка [62]. В структуре S1-участка фермента сохранены, как и у всех ГЭПаз, консервативные остатки His213(298) и Thr190(279). Однако позицию 216(301) занимает крупный гидрофобный остаток Phe (рис. 4B). Наложение пространственных структур SeMV-pro и Glu-SGP в комплексе с тетрапептидным продуктом протеолиза трет-бутилоксикарбонил-Ala-Ala-Pro-Glu (Boc-AAPE) показывает, что боковой радикал остатка
Рис. 3. Пространственные структуры вирусных глутамилэндопептидаз. А - EAV-Nsp4 (PDB ID - 1mbm; голубой) и Glu-SGP (1 hpg; желтый). Б - EAV-Nsp4 (голубой) и PRRSV-Nsp4 (3fan; сиреневый). В - Glu-SGP (желтый) и SeMV-pro (1zyo; голубой). Г - SeMV-pro (голубой) и HAstV-pro (2w5e; сиреневый). Обозначены остатки каталитической триады
Glu-P1 хорошо вписывается в Sl-карман вирусной протеазы. Сохранение объема Sl-кармана при наличии остатка с крупным боковым радикалом требует существенного смещения основной цепи белка на участке 214(299)-223(308) и заполнения образовавшегося в результате этого смещения пространства боковой цепью остатка Asn223(308), который участвует в формировании дна Sl-кармана, но, по-видимому, с Glu-Pl непосредственно не взаимодействует (рис. 4B). Эта ситуация показывает, что Ser в положении 216 и водородная связь остатка 216 с у-карбоксильной группой Glu-Pl не принципиальны для обеспечения глутаматной специфичности. К сожалению, экспериментов по модификации Phe216(301) в составе SeMV-pro не проводилось. В то же время замены His213(298) и Thr190(279) на Ala, но не мутация Asn223(308)^Ala, полностью подавляют процессинг in cis слитого белка SeMV-pro/ VPg (VPg - вирусный белок, который находится в полибелке за SeMV-pro) в модельной системе [61].
Субстратная специфичность протеазы астровиру-са человека (HAstV-pro) мало изучена. Данные о сайтах процессинга вирусного полибелка, осуществляемого этим ферментом, противоречивы [63]. Вместе с тем, с использованием рекомбинантного фермента и набора синтетических субстратов in vitro показано, что HAstV-pro гидролизует только связи, образованные a-карбоксильными группами Glu и Asp [24]. Пространственная структура HAstV-pro (PDB ID -2w5e) в целом близка к структуре SeMV-pro (рис. 3Г), но имеет ряд специфических особенностей. Так, остаток Asp102 (489 в полибелке) каталитической триады, в которую входят также Ser195(551) и His57(461), имеет неканоническую конформацию [24].
Структура участка S1 также заметно отличается от рассмотренных выше. Несмотря на то что остаток His213 и его положение инвариантны, в позиции 216 вместо Ser находится Asn216(569), амидная группа которого, как показывает наложение структур HAstV-pro и Glu-SGP в комплексе с лиган-дом, практически занимает место у-карбоксильной группы субстрата Glu-P1 (рис. 4Г). Это приводит к существенному уменьшению кармана S1 [24], объем которого не соответствует боковому радикалу Glu. Кроме того, конформация участка 189-193 (545-549) основной цепи иная, чем у большинства ХПП. Как следствие, консервативный остаток Thr190 удален от S1-сайта и развернут в сторону. (Положение участка 189-193 напоминает конфигурацию этого региона в PRRSV-Nsp4.) Учитывая описанные отличия от структур других ГЭПаз и ХПП, сложно сделать какие-либо определенные выводы о взаимодействиях HAstV-pro с остатком P1 субстрата.
Обобщая данные о вирусных ГЭПазах и Glu-SGP, можно заключить, что His213 является общим элементом Sl-кармана, а его модификация во всех случаях приводит к инактивации ферментов. Этот остаток способен нести положительный заряд и поэтому представляется кандидатом на роль ключевого структурного элемента, определяющего субстратные предпочтения Glu-специфичных протеаз. Остаток Thr/Ser190 также консервативен у всех ГЭПаз, однако его модификация не приводит к потере ферментами специфической активности, и, вероятно, он не играет принципиальной роли в распознавании остатка Glu-Pl субстрата. Наконец, природа остатка 216 несущественна для обеспечения субстратной специфичности. Как следствие, в этой позиции у ГЭПаз обнаружены остатки, сильно отличающиеся по свойствам: Ser, Asn и Phe. Дополнительную информацию о структурных детерминантах субстратной специфичности ГЭПаз может дать анализ вирусных 3С и ЗС-подобных протеаз, проявляющих специфичность к Gln в положении P1.
Сравнение первичных и пространственных структур ГЭПаз и 3C/3CLpro выявляет сходство их S1-участков (рис. 4Д,Е). Во-первых, все 3C/3CLpro, так же как и ГЭПазы, содержат консервативный остаток His213 [64-76], модификации которого приводят к инактивации ферментов [77-79]. Это позволяет заключить, что данный остаток не является ключевым элементом распознавания заряда субстрата, но принципиален для обеспечения корректной геометрии Sl-сайта. Во-вторых, большинство 3C/3CLpro сохраняют характерный для ГЭПаз остаток Thr/Ser190 [58], что подтверждает вывод о его важности для формирования правильной геометрии Sl-кармана, а не для распознавания заряда. На месте третьего элемента Sl-участка ГЭПаз, в положении 216, у 3C/3CLpro, как правило, находятся остатки Gly (рис. 4Е) и иногда Ala (рис. 4Д), которые не встречаются у известных ГЭПаз. Последнее стало основанием для рассуждений об участии Ser216 в компенсации заряда субстрата у ГЭПаз [60]. Однако мутагенез на модели Glu-SGP показывает, что замены Ser216^Ala/Gly не делают субстраты с Gln-P1 предпочтительными, хотя и увеличивают эффективность их гидролиза [47]. Кроме того, обсуждавшиеся данные о ГЭПазах с остатками Phe/Asn216 также не свидетельствуют в пользу подобных предположений. Следует упомянуть еще об одной гипотезе, которая до сих пор остается непроверенной. Поскольку все ГЭПазы являются сериновыми, а Gln-специфичные ферменты - цистеиновыми про-теазами, можно предположить, что различие в их субстратной специфичности определяется каталитическими остатками.
Рис. 4. Sl-участки вирусных Glu- и Gln-специфичных протеаз. А - EAV-Nsp4 (1mbm; голубой) и Glu-SGP (1hpg; желтый) в комплексе с Boc-AAPE (сиреневый, защитная группа не показана). Б - EAV-Nsp4 (голубой) и PRRSV-Nsp4 (3fan; желтый), в Sl-участок вписан Boc-AAPE из структуры Glu-SGP (сиреневый). В - Glu-SGP (желтый) в комплексе с Boc-AAPE (сиреневый) и SeMV-pro (1zyo; голубой). Г - Glu-SGP (желтый) в комплексе с Boc-AAPE (сиреневый) и HAstV-pro (2w5e; голубой). Д - Glu-SGP (желтый) и Gln/Glu-специфичная протеаза вируса Норуолк (4in1; голубой) с заменой Cys195^Ala в комплексе с те-трапептидом Ile-Asn-Phe-Glu (сиреневый). E - EAV-Nsp4 (голубой) и Gln-специфичная протеаза 3C риновируса человека (1cqq, желтый) в комплексе с ингибитором AG7088 (сиреневый). Штриховые линии обозначают водородные связи
Итак, ни один из обнаруженных консервативных структурных элементов S1 участка Glu-SGP и вирусных 3CLSP, по-видимому, не определяет предпочтения этих ферментов к остатку Glu в положении P1 субстрата. Следовательно, такая специфичность ГЭПаз вирусов и стрептомицетов обеспечивается структурными детерминантами, не находящимися непосредственно в субстратсвязывающей области. Однако традиционный путь исследований, сочетающий анализ пространственных структур, сайт-направленный мутагенез и изучение каталитических свойств ферментов, до настоящего времени не позволил выявить эти детерминанты. Более успешными кажутся исследования ГЭПаз бактерий.
ЭПИДЕРМОЛИТИЧЕСКИЕ ТОКСИНЫ СТАФИЛОКОККОВ
Стафилококки продуцируют два типа ГЭПаз: ферменты, сходные с протеазой V8 Staphylococcus aureus (Glu-V8), о которых пойдет речь в следующем разделе, и эпидермолитические токсины (ET). ЕТ являются основными факторами вирулентности, отвечающими за развитие буллезного импетиго и его генерализованной формы - стафилококкового синдрома ошпаренной кожи, а также сходных заболе-
ваний животных [80, 81]. Биологическая активность ET связана с их способностью с высокой специфичностью гидролизовать связь Glu381-Gly в десмогле-ине 1 - десмосомальном белке кадгенинового типа, обеспечивающем межклеточные взаимодействия (более подробно см. обзор [80]). Кроме того, in vitro ET расщепляют эфирные связи, образованные карбоксильными группами остатков Glu [82].
Пространственные структуры эпидермолитиче-ских токсинов A [83, 84] и B [85] из S. aureus указывают на принадлежность ET к ХПП (рис. 5). В то же время эти белки обладают уникальными особенностями. Первая из них - N-концевая а-спираль. Вторая - необычное положение остатков, формирующих оксианионную впадину: пептидная связь Pro/ Val192-Gly193 (нумерация по химотрипсину) развернута на 180° по сравнению с другими ХПП. Это приводит к формированию водородной связи между карбонильным кислородом остатка 192 и гидрокси-лом каталитического Ser195, что, по-видимому, препятствует проявлению активности. На основе анализа структур высказано предположение, что связывание ET с субстратом (или рецептором), в которое вовлечена N-концевая а-спираль, приводит к перестройке активного центра и активации ферментов [83].
Рис. 5. Пространственные структуры эпидермолитических токсинов S. aureus. А - ETA (1 agj; голубой) и Glu-SGP (1hpg; желтый). Б - ETA (голубой) и ETB (1 qtf; сиреневый). Обозначены остатки каталитической триады
Как у всех обсуждавшихся выше ГЭПаз, S1-карманы ET содержат три ключевых элемента, два из которых - консервативные остатки His213 и Thr190 (рис. 6). Третьим, как предсказано ранее на основе моделирования пространственных структур [46], является идеально подходящий на роль компенсатора отрицательного заряда Glu-P1 остаток Lys в позиции 216, где у других ГЭПаз обычно находится Ser. Остаток Lys консервативен у большинства ET S. aureus и S. hyicus, а у ExhA (ET из S. hyicus) в положении 216 обнаружен Arg [86, 87]. Важность Lys216 для гидролиза субстратов с остатком Glu подтверждена экспериментами по сайт-направленному мутагенезу, выполненными на модели ETA [88]. Любая из замен Lys216^Ala/Glu/Thr аналогично мутациям по остаткам каталитической триады приводила к потере белком способности гидролизовать a-фениловый эфир N-Boc-L-глутаминовой кислоты и утрате эпидермолитической активности.
Итак, в случае ET положительно заряженный остаток, вероятный компенсатор заряда субстрата, удается обнаружить непосредственно в S1-участке, причем в положении 216, важном для распознавания субстрата всеми ХПП. Этот компенсатор принципиален для проявления ET ферментативной активности. В то же время прямые доказательства того, что Lys/ Arg216 у ET отвечает за глутаматную специфич-
ность, в настоящее время отсутствуют. При этом Sl-сайты ET, за исключением Lys216, очень похожи на соответствующие области ГЭПаз вирусов и стреп-томицетов (рис. 6). Однако приведенные выше данные указывают на то, что остаток в положении 216 не существен для обеспечения субстратной специфичности этих ферментов. Тогда следует заключить, что разные группы ГЭПаз имеют разные механизмы распознавания субстрата. У ET ключевым является стандартный компенсатор заряда в Sl-кармане, у ферментов вирусов и стрептомицетов - какой-то другой удаленный структурный элемент. Такой вывод подкрепляется данными, полученными для других бактериальных ГЭПаз.
ДРУГИЕ БАКТЕРИАЛЬНЫЕ ГЛУТАМИЛЭНДОПЕПТИДАЗЫ
Кроме ГЭПаз стрептомицетов и ET охарактеризован целый ряд протеаз, секретируемых грамполо-жительными бактериями и обладающих общими структурными особенностями. Проведенное на ранних этапах изучения ГЭПаз моделирование пространственных структур относящихся к этой группе Glu-V8, ГЭПаз Bacillus licheniformis и B. subtilis привело к предположению, что компенсацию заряда субстрата у всех трех белков обеспечивает а-аминогруппа остатка в положении 1 зрелого фер-
А
. HIS-57
ASP-102V
ASP-102 i
SER/THR-190
HIS-213
THR-190
SER/LYS-216
LYS-216
Б
Рис. 6. Si-участки эпидермолитических токсинов S. aureus. А - ETA (1 agj; голубой) и Glu-SGP (1hpg; желтый) в комплексе с Boc-AAPE (сиреневый, защитная группа не показана). Б - ETA (голубой) и ETB (iqtf; желтый), в Si-участок вписан лиганд Boc-AAPE из структуры Glu-SGP (сиреневый). Штриховые линии обозначают водородные связи
мента [46]. Сегодня локализация N-концевого остатка в Sl-участке ГЭПаз этой группы подтверждена экспериментальными данными о третичных структурах ГЭПазы B. intermedius (BIGEP) [89], Glu-V8 [90] и внеклеточной сериновой протеазы S. epidermidis (Esp) [91].
Обсуждаемые белки обладают высоким структурным сходством между собой, а также с ET стафилококков, и имеют типичное для ХПП строение. Их молекулы состоят из двух Р-доменов, разделенных глубокой щелью, в которой расположен активный центр (рис. 7). Участки S1 у Glu-V8, BIGEP и Esp в целом организованы сходно с аналогичными регионами других ГЭПаз и содержат обязательные элементы: His213 и Ser/Thr190 (рис. 8А,Б). В то же время в третьей ключевой позиции Sl-кармана находится остаток Gly, что, как обсуждалось выше, является особенностью вирусных Gln-специфичных 3С- и 3CLpro. Однако отсутствие бокового радикала, способного формировать водородную связь с кислородом карбоксильной группы субстрата, у остатка в позиции 216 компенсируется, как и было предсказано, а-аминогруппой Vall, которая занимает место, соответствующее положению е-аминогруппы остатка Lys216 у ET (рис. 8В). Таким образом, в случае Glu-V8, BIGEP и Esp, по-видимому, наблюдается уникальная ситуация, когда специфичность проте-азы определяется N-концом полипептидной цепи. Своеобразие такого «конструктивного решения» состоит в том, что Glu-V8, BIGEP и Esp синтезируются клеткой в виде предшественников, включающих, кроме каталитической части, сигнальный пептид и пропептид. Следовательно, N-конец зрелого белка, а значит, и Sl-карман формируются только после процессинга. Эта ситуация напоминает механизм активации ХПП млекопитающих: после удаления пропептида N-концевая NH..-группа зрелого белка образует солевой мостик с остатком Asp194, что индуцирует структурные перестройки молекулы фермента, приводящие к его активации благодаря формированию корректной структуры Sl-участка и оксианионной впадины [92-96].
Направленная модификация остатков Sl-участков BIGEP и Glu-V8 дала очень интересные результаты. Прежде всего, был впервые исследован вариант ГЭПазы с модификацией остатка His213. (Подобные мутации вводили и ранее [47, 58], но получить белки не удалось.) Показано, что BIGEP с заменой His213 (186 в BIGEP) на Thr не изменяет субстратных предпочтений и гидролизует белковый субстрат только после остатков Glu. В то же время модификация существенно влияет на эффективность катализа (k снижается более чем в 600 раз), но при этом относительно мало сказывается на связывании субстрата
(KM возрастает примерно в 5 раз) [97]. Интересно, что подобный эффект наблюдается в случае гидролиза нативными ГЭПазами субстратов, содержащих остаток Asp в положении P1: KM растет примерно в 6 раз, а падение kcat имеет тот же порядок (~150 раз) [98]. Полученные результаты позволяют заключить, что консервативный остаток His213 не является ключевым элементом, определяющим распознавание отрицательного заряда субстрата ГЭПазами, но, по-видимому, существен для точного позиционирования расщепляемой связи относительно нуклеофи-ла - кислорода гидроксильной группы Ser195. Этот вывод хорошо согласуется с тем, что His213 является общим структурным элементом для Glu- и Gln-специфичных протеаз.
Данные о роли N-концевого остатка в функционировании ГЭПаз получены на модели Glu-V8. Показано, что замена N-концевого Val на Leu/Ala/ Phe/Gly/Ser приводит к снижению эффективности гидролиза субстратов c остатком Glu в примерно 3, 20, 50, 100 и 200 раз соответственно [9, 99], и чем ближе остаток по своим свойствам к Val, тем меньше снижение активности. Этот результат свидетельствует о важности остатка 1 для функционирования фермента и может быть объяснен различным отклонением положения a-аминогруппы этого остатка у мутантов от оптимального. Кроме того, удалось получить варианты Glu-V8 с дополнительными аминокислотными остатками, фрагментами пропепти-да, на N-конце. Введение дополнительных остатков (от 1 до 39) во всех случаях приводило к значительному падению активности фермента при гидролизе субстратов с Glu-P1 [9, 100], но в меньшей степени влияло на эффективность гидролиза аналогичных субстратов с Gln-P1. При этом мутанты сохраняли предпочтение к субстратам с Glu-P1, которые они гидролизовали примерно в 10-20 раз эффективнее [100]. Таким образом, вероятно, a-аминогруппа N-концевого остатка Val вносит очень существенный вклад в узнавание заряженного субстрата обсуждаемыми бактериальными ГЭПазами, но не определяет специфичность ферментов полностью.
Обобщая всю имеющуюся информацию о ГЭПазах, можно сделать вывод о различиях в механизмах распознавания заряженного субстрата ферментами разных групп. Вероятно, это свидетельствует о том, что на эволюционном древе ХПП ветви ГЭПаз возникали несколько раз, возможно, на основе базовой структуры S1-кармана, одинаково хорошо подходящей для реализации как глутаматной, так и глу-таминовой специфичности, и наиболее близкой, по-видимому, к структуре S1-областей вирусных ферментов. Необходимость реализации нескольких структурных вариантов оптимизации специфично-
Рис. 7. Пространственные структуры бактериальных глутамилэндопептидаз. A - BIGEP (1p3c; голубой) и Glu-SGP (ihpg; желтый). Б - BIGEP (голубой) и Glu-V8 (1qy6; сиреневый). В - Glu-V8 (сиреневый) и Esp (4jcn; голубой). Г - Glu-V8 (сиреневый) и ETA S. aureus (1 agj; голубой). Обозначены остатки каталитической триады
А
Рис. 8. Si-участки бактериальных глутамилэндопеп-тидаз. А - BIGEP (1 p3c; голубой) и Glu-SGP (1 hpg; желтый) в комплексе с Boc-AAPE (сиреневый, защитная группа не показана). Б - BIGEP (голубой) и Glu-V8 (1qy6; желтый). B - BIGEP (голубой) и ETA (1agj; желтый). На частях Б и В в Si-сайт вписан лиганд Boc-AAPE из структуры Glu-SGP (сиреневый). Пунктирные линии обозначают водородные связи
сти очевидно должна быть обусловлена отличиями в функционировании протеаз, относящихся к разным группам. Анализ опубликованных данных о ГЭПазах позволяет обнаружить, что вариации в структуре S1-участков этих ферментов коррелируют с различиями в механизмах созревания их предшественников. Такое наблюдение позволяет выдвинуть гипотезу о том, что способ компенсации заряда диктуется путем созревания белка-предшественника.
СТРУКТУРНЫЕ ДЕТЕРМИНАНТЫ СУБСТРАТНОЙ СПЕЦИФИЧНОСТИ И СОЗРЕВАНИЕ ПРЕДШЕСТВЕННИКОВ ГЛУТАМИЛЭНДОПЕПТИДАЗ
Все ГЭПазы синтезируются в виде предшественников. Однако механизмы процессинга ферментов существенно различаются и могут быть разделены на три группы. ГЭПазы стрептомицетов и вирусов процессируются автокаталитически [47, 51]. Предшественники ЕТ содержат только секреторный лидер [3] и, следовательно, процессируются сигнальной пептидазой. В случае же бактериальных ГЭПаз, подобных С1и^8 и ВЮЕР, удаление про-пептида, за единственным исключением [21], осуществляется различными протеазами гетероката-литически [22, 100 — 104]. Сопоставление структур S1-участков ГЭПаз и механизмов процессинга показывает, что у автоактивирующихся ферментов в S1-кармане не удается обнаружить явного компенсатора заряда субстрата, для S1-участка ЕТ характерно наличие остатка Lys216, а для ГЭПаз, сходных с С1и^8 и процессирующихся гетерокаталитически, -а-аминогруппы ^концевого остатка. Рассмотрим эти соответствия с точки зрения биологических функций протеаз каждой группы.
Вирусные ГЭПазы синтезируются как часть протяженного полибелка, селективный гидролиз которого является основной функцией данных ферментов [25, 51, 105, 106]. Таким образом, вирусные ГЭПазы функционируют внутри клетки, начиная действовать сразу после синтеза полибелка. Следовательно, активный центр фермента, включая определяющие специфичность участки, должен быть сформирован и способен осуществлять высокоспецифический гидролиз уже в составе полибелка-предшественника, сохраняя структуру после процессинга. Функционирование ГЭПаз стрептоми-цетов кажется существенно иным. Эти внеклеточные ферменты синтезируются как классические предшественники протеаз, содержащие препропептид. Функции пропоследовательностей ГЭПаз стрепто-мицетов не установлены, однако по аналогии с близкородственной протеазой В из Str. д^е^ [107, 108] можно полагать, что пропептиды обеспечивают кинетическую стабильность зрелых молекул и участвуют
в их секреции. В то же время автокаталитический процессинг и отсутствие видимой регуляции активности на посттрансляционном уровне делают ситуацию сходной с описанной для вирусных ферментов: активный центр должен быть полностью сформирован в составе предшественника и сохраняться неизменным после образования зрелой молекулы. Эта задача в обоих случаях, по-видимому, имеет одно структурное решение (рис. 4). В Sl-кармане нет прямого компенсатора заряда. N-Конец удален от активного центра в зрелом белке и, следовательно, не участвует в формировании Sl-участка, так как вовлечен в процессинг. Не установленные до настоящего времени структурные элементы, отвечающие за глу-таматную специфичность, локализованы вне S1-области и, вероятно, формируются до процессинга предшественника. Таким образом, изменяющиеся в ходе созревания элементы структуры не участвуют в образовании значимых для катализа регионов молекулы.
Противоположная ситуация наблюдается в случае синтезируемых в виде препробелков ГЭПаз, подобных Glu-V8. Эти протеазы не только подвергаются гетероактивации [101-103, 109], но и, как показано на примере Glu-V8, вовлечены в регуляторные ак-тивационные каскады [110-112]. Это предполагает строгий контроль активности, который реализуется достаточно сложным и в чем-то противоречивым способом. На первый взгляд, предшественники Glu-V8, BIGEP и Esp должны быть неактивны, поскольку S1-участок у этих белков формируется только в зрелой молекуле (рис. 7 и 8). В то же время опубликованы данные, которые показывают, что предшественники Glu-V8 [113], BIGEP [109], Esp [7], а также ГЭПаз B. licheniformis [114], B. subtilis [102] и Thermoactinomyces sp. [21] способны к ав-топроцессингу, причем в большинстве случаев гидролизу подвергаются связи, соответствующие специфичности зрелых ферментов [7, 21, 109, 114]. Кроме того, обнаружена глутаматная активность in trans аналогов предшественников [100]. Эти факты ставят под сомнение саму возможность управления активностью обсуждаемых протеаз, однако внимательный анализ пути активации предшественников показывает, что ситуация более сложная.
Автопроцессинг, возможно внутримолекулярный, нативных ферментов, проходящий спонтанно как in vitro, так и in vivo, приводит не к полному удалению пропоследовательности, а к формированию форм белков с «обрезками» пропептидов (обычно протяженностью 3-15 аминокислотных остатков) [7, 100, 109, 113, 114], т.е. соответствующих по размеру пропептидам ХПП млекопитающих. Эти формы не проявляют активности по отноше-
нию к белковым субстратам (а также малоактивны по отношению к пептидам) in trans и могут быть активированы только гетерокаталитически [7, 100, 109, 113, 114]. (Для полноты картины следует отметить, что недавно опубликованы данные о ферменте Thermoactinomyces sp. с остатком Glu в положении -1, который способен к автоактивации в гетерологич-ной экспрессионной системе in vitro [21], как и полученные ранее искусственно мутанты других ГЭПаз [109, 114].) Таким образом, созревание ферментов, сходных с Glu-V8, происходит ступенчато. По-видимому, эти белки содержат как бы два пропеп-тида. Первый, протяженный фолдинг-ассистент [99, 109], обеспечивающий кинетическую стабильность зрелого белка, как это часто бывает у бактериальных протеаз [115]. Второй - короткий, формирующийся после первого акта процессинга, - активационный модуль [109, 113, 114], поддерживающий фермент в неактивном состоянии. Нельзя исключить также, что структура активного центра протеаз меняется после удаления первой части пропептида. Можно сказать, что пропептиды ГЭПаз описываемой группы одновременно сочетают в себе свойства, типичные для пропептидов бактериальных ХПП и ферментов млекопитающих. Таким образом, необходимость строгого контроля активности ферментов, подобных Glu-V8, обеспечивается за счет формирования полноценного S1-кармана только после удаления про-пептида. Для этого используется механизм, сходный с механизмом активации ХПП млекопитающих, -участие N-концевой аминогруппы в структуре существенных для катализа элементов молекулы. Но удаление фолдинг-ассистента при этом происходит автокаталитически за счет базовой специфичности ферментов.
ET стафилококков представляют собой промежуточный вариант. С одной стороны, их предшественники процессируются гетерокаталитически. С другой стороны, процессинг не связан с регуляцией активности, поскольку заключается лишь в удалении сигнального пептида. Таким образом, формирование функционально активного фермента до процессинга, как и строгий контроль активности, очевидно, не являются необходимыми. Здесь, по-видимому, подошел бы вариант, реализованный у ГЭПаз вирусов и стрептомицетов. Однако филогенетический анализ показывает, что ET с наибольшей вероятностью представляют собой паралоги Glu-V8 (рис. 9, см. обсуждение ниже), т.е. эти белки «созданы» на одной базе с Glu-V8 и, по существу, используют ту же схему строения S1-участка (рис. 8). В то же время, в отличие от Glu-V8, ET не содержат пропептидов, что указывает на иной путь сворачивания [115], и имеют значительно более узкую специфичность.
Рис. 9. Филогенетическое дерево химотрипсиноподобных протеаз. Ветви, соответствующие ГЭПазам, выделены цветом: оранжевый - компенсатор заряда в Si-сайте ферментов не выявлен, сиреневый - Lys216 в Si-участке, синий - а-аминогруппа N-концевого остатка в Si-сайте. ГЭПазы: Glu-SFP из Str. fradiae, SEGEP из S. epidermidis, SWGEP из S. warneri, ScohGEP из S. cohnii, ScapGEP из S. caprae, BLGEP из B. licheniformis, BSGEP из B. subtilis, TS-GSE из Thermoactinomyces sp., EFGEP из Ent. faecalis; ExhA, ExhB, ExhC и ExhD - эпидермолитические токсины A, B, C и D из S. hyicus. NV-pro - протеаза вируса Норфолк; HRV-3C, HAV-3C - протеазы 3C риновируса и вируса гепатита A человека; aLP - а-литическая протеаза Lysobacter enzymogenes; Sgt, SgpA, SgpB - трипсин, протеазы A и B Str. griseus; kall-1, trypsin, nelast, cathG, granB - калликреин 1, трипсин 1, эластаза нейтрофилов, катепсин G, гранзим B человека; chymo, elast - химотрипсин A и эластаза 1 быка; tonin - тонин крысы. Выравнивание последовательностей и построение дерева с использованием метода присоединения соседей осуществлены с помощью программы ClustalX 2.1 (www.clustal.org). Дерево визуализировано при помощи программы FigTree (tree.bio.ed.ac.uk/software/figtree/). Цифры соответствуют числу дендрограмм, в которых были представлены индивидуальные бифуркации при бутстреп-анализе 1000 вариантов филогенетических деревьев
Они неактивны по отношению к большинству белков и пептидов, что достигается, возможно, за счет введения остатка Ь^216 и уменьшения объема S1-кармана, а также за счет необычной конформации оксианионной впадины [83].
В контексте нашего обсуждения интересно было бы проследить филогению ГЭПаз.
Единственную опубликованную попытку филогенетического анализа ферментов этой группы мы обнаружили в работе, вышедшей в свет 20 лет назад [46]. Поэтому в рамках данного обзора на основе сравнения последовательностей охарактеризованных ГЭПаз и некоторых ХПП с другой специфичностью мы построили филогенетическое дерево,
которое представлено на рис. 9. Первое, что хочется отметить вслед за авторами работы [46], - складывается впечатление, что ГЭПазы возникали на эволюционном древе ХПП по меньшей мере 2 раза. На это указывает наличие двух удаленных ветвей бактериальных ГЭПаз, одна из которых включает белки, сходные с Glu-V8 и ET, а другая соответствует ферментам стрептомицетов. (Судить об эволюционном положении вирусных протеаз сложно, поскольку топология полученного дерева в части, касающейся этих белков, недостоверна.) Особенно показательно, что ГЭПазы стрептомицетов представляют собой лишь небольшой побег на ветви бактериальных про-теаз с широкой специфичностью. Это наблюдение позволяет предположить, что вероятность реализации глутаматной специфичности (как, впрочем, и любой другой) на базе химотрипсинового фолда достаточно велика. По-видимому, для этого достаточно модификации ключевых остатков Sl-кармана (His213, Thr/ Ser190), обеспечивающих необходимую геометрию и минимальные взаимодействия для связывания остатков Glu/Gln. Однако такая базовая специфичность, вероятно, требует «усиления», которое может быть достигнуто разными путями, в частности, введением компенсатора в Sl-сайт, но эта возможность, как показывает анализ ферментов вирусов и стреп-томицетов, не единственная. Ветвь, объединяющую все бактериальные ГЭПазы, кроме ферментов стреп-томицетов, следует рассмотреть отдельно. Топология этой ветви ожидаемо соответствует таксономии бактерий-продуцентов. При этом ET и ферменты стафилококков, подобные Glu-V8, локализуются на одной общей ветви, т.е. они структурно ближе друг к другу, чем к остальным бактериальным ГЭПазам.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Проведенный нами анализ показывает, что все известные ГЭПазы относятся к структурному семейству химотрипсина и имеют в целом сходное строение Sl-субстратсвязывающего участка. При этом у ферментов этой группы существует несколько разных систем компенсации заряда субстрата. Отличия в механизмах распознавания отрицательного заря-
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Демидюк И.В., Костров С.В. // Молекуляр. биология. 1999. Т. 33. № 1. С. 100-105.
2. Мильготина Е.И., Воюшина Т.Л., Честухина Г.Г. // Биоорган. химия. 2003. Т. 29. № 6. С. 563-576.
3. Dancer S.J., Garratt R., Saldanha J., Jhoti H., Evans R. // FEBS Lett. 1990. V. 268. № 1. P. 129-132.
4. Hanakawa Y., Schechter N.M., Lin C., Nishifuji K., Amagai M., Stanley J.R. // J. Biol. Chem. 2004. V. 279. № 7. P. 5268-5277.
5. Dubin G., Chmiel D., Mak P., Rakwalska M., Rzychon M., Dubin A. // Biol. Chem. 2001. V. 382. № 11. P. 1575-1582.
да коррелируют с различиями в архитектуре и путях процессинга предшественников, что, вероятно, определяется биологическими функциями соответствующих протеаз. Все это позволяет предположить, что ГЭПазы возникли на эволюционном древе ХПП, по крайней мере, дважды. В то же время мы вынуждены констатировать, что имеющаяся в настоящее время информация о структуре и механизмах действия ГЭПаз не позволяет до конца справиться с загадкой их строгой субстратной специфичности.
Следует подчеркнуть, однако, что сегодня центр тяжести исследований ГЭПаз смещается от изучения собственно ферментов к анализу их биологических функций, как правило, в связи с патогенезом. Так, например, активно изучают участие ГЭПаз стафилококков в регуляции роста биопленок, что определяется, в первую очередь, надеждами на обнаружение новых средств борьбы со стафилококковой инфекцией [116]. Интенсивно ведутся работы по изучению вирусных ГЭПаз, что связано с попытками создания эффективных противовирусных препаратов. При этом ГЭПазы обычно не выделяют из всего пула ЗС-подобных протеаз в поисках универсальных ингибиторов процессинга вирусных полибелков. Инженерия ингибиторов требует экстенсивного изучения белок-лигандных взаимодействий, что влечет за собой получение большого объема структурных данных (см., например, [76, 117]). Не прекращается изучение роли ГЭПаз в жизненном цикле вирусов [24, 118]. Отдельно следует отметить появление работ, посвященных изучению вирусных 3С и 3С-подобных протеаз, в том числе и ГЭПаз, в качестве индукторов программируемой клеточной гибели [119-122]. Несомненно, исследования ГЭПаз в медицинском контексте будут активно продолжаться. При этом важно подчеркнуть, что, поскольку строгая субстратная специфичность является основой биологического действия ГЭПаз, в ходе таких исследований неизбежно будут получены новые данные, касающиеся ее структурных детерминант.
Работа поддержана Российским научным фондом (грант № 14-14-00526).
6. Moon J.L., Banbula A., Oleksy A., Mayo J.A., Travis J. // Biol. Chem. 2001. V. 382. № 7. P. 1095-1099.
7. Ohara-Nemoto Y., Ikeda Y., Kobayashi M., Sasaki M., Tajika S., Kimura S. // Microb. Pathog. 2002. V. 33. № 1. P. 33-41.
8. Yokoi K., Kakikawa M., Kimoto H., Watanabe K., Yasukawa H., Yamakawa A., Taketo A., Kodaira K.I. // Gene. 2001. V. 281. № 1-2. P. 115-122.
9. Ono T., Ohara-Nemoto Y., Shimoyama Y., Okawara H., Kobayakawa T., Baba T.T., Kimura S., Nemoto T.K. // Biol. Chem. 2010. V. 391. № 10. P. 1221-1232.
10. Fudaba Y., Nishifuji K., Andresen L.O., Yamaguchi T.,
Komatsuzawa H., Amagai M., Sugai M. // Microb. Pathog. 2005. V. 39. № 5-6. P. 171-176.
11. Nishifuji K., Fudaba Y., Yamaguchi T., Iwasaki T., Sugai M., Amagai M. // Vet. Dermatol. 2005. V. 16. № 5. P. 315-323.
12. Yoshida N., Tsuruyama S., Nagata K., Hirayama K., Noda K., Makisumi S. // J. Biochem. 1988. V. 104. № 3. P. 451-456.
13. Kitadokoro K., Nakamura E., Tamaki M., Horii T., Okamoto H., Shin M., Sato T., Fujiwara T., Tsuzuki H., Yoshida N., et al. // Biochim. Biophys. Acta. 1993. V. 1163. № 2. P. 149-157.
14. Хайдарова Н.В., Руденская Г.Н., Ревина Л.П., Степанов В.М., Егоров Н.С. // Биохимия. 1989. Т. 54. № 1. С. 46-53.
15. Svendsen I., Breddam K. // Eur. J. Biochem. 1992. V. 204. № 1. P. 165-171.
16. Rufo G.A., Jr., Sullivan B.J., Sloma A., Pero J. // J. Bacteriol. 1990. V. 172. № 2. P. 1019-1023.
17. Leshchinskaya I.B., Shakirov E.V., Itskovitch E.L., Balaban N.P., Mardanova A.M., Sharipova M.R., Viryasov M.B., Rudenskaya G.N., Stepanov V.M. // FEBS Lett. 1997. V. 404. № 2-3. P. 241-244.
18. Rebrikov D.V., Akimkina T.V., Shevelev A.B., Demidyuk I.V., Bushueva A.M., Kostrov S.V., Chestukhina G.G., Stepanov V.M. // J. Protein Chem. 1999. V. 18. № 1. P. 21-27.
19. Мосолова О.В., Руденская Г.Н., Степанов В.М., Ходова О.М., Цаплина И.А. // Биохимия. 1987. Т. 52. № 3. С. 414-422.
20. Демидюк И.В., Носовская Е.А., Цаплина И.А., Каравайко Г.И., Костров С.В. // Биохимия. 1997. Т. 62. № 2. С. 202-207.
21. Liu F., Zhao Z.S., Ren Y., Cheng G., Tang X.F., Tang B. // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2016. V. 100. № 24. P. 10429-10441.
22. Kawalec M., Potempa J., Moon J.L., Travis J., Murray B.E. // J. Bacteriol. 2005. V. 187. № 1. P. 266-275.
23. Ziebuhr J., Snijder E.J., Gorbalenya A.E. // J. Gen. Virol. 2000. V. 81. № 4. P. 853-879.
24. Speroni S., Rohayem J., Nenci S., Bonivento D., Robel I., Barthel J., Luzhkov V.B., Coutard B., Canard B., Mattevi A. // J. Mol. Biol. 2009. V. 387. № 5. P. 1137-1152.
25. Somera M., Sarmiento C., Truve E. // Viruses. 2015. V. 7. № 6. P. 3076-3115.
26. Schechter I., Berger A. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1967. V. 27. № 2. P. 157-162.
27. Stroud R.M. // Sci. Am. 1974. V. 231. № 1. P. 74-88.
28. Руденская Г.Н. // Биоорган. химия. 2003. Т. 29. № 2. С. 117-128.
29. Zamolodchikova T.S., Sokolova E.A., Alexandrov S.L., Mikhaleva I.I., Prudchenko I.A., Morozov I.A., Kononenko N.V., Mirgorodskaya O.A., Da U., Larionova N.I., et al. // Eur. J. Biochem. 1997. V. 249. № 2. P. 612-621.
30. Polanowska J., Krokoszynska I., Czapinska H., Watorek W., Dadlez M., Otlewski J. // Biochim. Biophys. Acta. 1998. V. 1386. № 1. P. 189-198.
31. Poe M., Blake J.T., Boulton D.A., Gammon M., Sigal N.H., Wu J.K., Zweerink H.J. // J. Biol. Chem. 1991. V. 266. № 1. P. 98-103.
32. Perona J.J., Craik C.S. // Protein Sci. 1995. V. 4. № 3. P. 337-360.
33. Hedstrom L. // Chem. Rev. 2002. V. 102. № 12. P. 4501-4524.
34. Krieger M., Kay L.M., Stroud R.M. // J. Mol. Biol. 1974. V. 83. № 2. P. 209-230.
35. Waugh S.M., Harris J.L., Fletterick R., Craik C.S. // Nat. Struct. Biol. 2000. V. 7. № 9. P. 762-765.
36. Hof P., Mayr I., Huber R., Korzus E., Potempa J., Travis J., Powers J.C., Bode W. // EMBO J. 1996. V. 15. № 20. P. 5481-5491.
37. Tsu C.A., Perona J.J., Fletterick R.J., Craik C.S. // Biochemistry. 1997. V. 36. № 18. P. 5393-5401.
38. Pletnev V.Z., Zamolodchikova T.S., Pangborn W.A., Duax W.L. // Proteins. 2000. V. 41. № 1. P. 8-16.
39. Graf L., Jancso A., Szilagyi L., Hegyi G., Pinter K., Naray-Szabo G., Hepp J., Medzihradszky K., Rutter W.J. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1988. V. 85. № 14. P. 4961-4965.
40. Hedstrm L., Szilagyi L., Rutter W.J. // Science. 1992. V. 255. № 5049. P. 1249-1253.
41. Hedstrom L., Perona J. J., Rutter W.J. // Biochemistry. 1994. V. 33. № 29. P. 8757-8763.
42. Hedstrom L., Farr-Jones S., Kettner C.A., Rutter W.J. // Biochemistry. 1994. V. 33. № 29. P. 8764-8769.
43. Perona J.J., Hedstrom L., Rutter W.J., Fletterick R.J. // Biochemistry. 1995. V. 34. № 5. P. 1489-1499.
44. Nienaber V.L., Breddam K., Birktoft J.J. // Biochemistry. 1993. V. 32. № 43. P. 11469-11475.
45. Cortes A., Emery D.C., Halsall D.J., Jackson R.M., Clarke
A.R., Holbrook J.J. // Protein Sci. 1992. V. 1. № 7. P. 892-901.
46. Barbosa J.A., Saldanha J.W., Garratt R.C. // Protein Eng. 1996. V. 9. № 7. P. 591-601.
47. Stennicke H.R., Birktoft J.J., Breddam K. // Protein Sci. 1996. V. 5. № 11. P. 2266-2275.
48. Dougherty W.G., Semler B.L. // Microbiol. Rev. 1993. V. 57. № 4. P. 781-822.
49. Gorbalenya A., Snijder E. // Perspectives Drug Discov. Design. 1996. V. 6. № 1. P. 64-86.
50. Spall V.E., Shanks M., Lomonossoff G.P. // Semin. Virol. 1997. V. 8. № 1. P. 15-23.
51. Gorbalenya A.E., Koonin E.V. // Sov. Sci. Rev. Sect. D Physicochem. Biol. 1993. V. 11. № 3. P. 1-84.
52. Blanck S., Stinn A., Tsiklauri L., Zirkel F., Junglen S., Ziebuhr J. // J. Virol. 2014. V. 88. № 23. P. 13747-13758.
53. Meyers G., Wirblich C., Thiel H.J., Thumfart J.O. // Virology. 2000. V. 276. № 2. P. 349-363.
54. Belliot G., Sosnovtsev S.V., Mitra T., Hammer C., Garfield M., Green K.Y. // J. Virol. 2003. V. 77. № 20. P. 10957-10974.
55. Sosnovtsev S.V., Belliot G., Chang K.O., Prikhodko V.G., Thackray L.B., Wobus C.E., Karst S.M., Virgin H.W., Green K.Y. // J. Virol. 2006. V. 80. № 16. P. 7816-7831.
56. Robel I., Gebhardt J., Mesters J.R., Gorbalenya A., Coutard
B., Canard B., Hilgenfeld R., Rohayem J. // J. Virol. 2008. V. 82. № 16. P. 8085-8093.
57. Wei C., Meller J., Jiang X. // Virology. 2013. V. 436. № 1. P. 24-32.
58. Snijder E.J., Wassenaar A.L., van Dinten L.C., Spaan W.J., Gorbalenya A.E. // J. Biol. Chem. 1996. V. 271. № 9. P. 4864-4871.
59. Tian X., Lu G., Gao F., Peng H., Feng Y., Ma G., Bartlam M., Tian K., Yan J., Hilgenfeld R., et al. // J. Mol. Biol. 2009. V. 392. № 4. P. 977-993.
60. Barrette-Ng I.H., Ng K.K., Mark B.L., van Aken D., Cherney M.M., Garen C., Kolodenko Y., Gorbalenya A.E., Snijder E.J., " James M.N. // J. Biol. Chem. 2002. V. 277. № 42. P. 39960-39966.
61. Gayathri P., Satheshkumar P.S., Prasad K., Nair S., Savithri H.S., Murthy M.R. // Virology. 2006. V. 346. № 2. P. 440-451.
62. Satheshkumar P.S., Lokesh G.L., Savithri H.S. // Virology. 2004. V. 318. № 1. P. 429-438.
63. Bosch A., Pinto R.M., Guix S. // Clin. Microbiol. Rev. 2014. V. 27. № 4. P. 1048-1074.
64. Matthews D.A., Smith W.W., Ferre R.A., Condon B., Budahazi G., Sisson W., Villafranca J.E., Janson C.A., McElroy H.E., Gribskov C.L., et al. // Cell. 1994. V. 77. № 5. P. 761-771.
65. Mosimann S.C., Cherney M.M., Sia S., Plotch S., James M.N. // J. Mol. Biol. 1997. V. 273. № 5. P. 1032-1047.
66. Bergmann E.M., Mosimann S.C., Chernaia M.M., Malcolm B.A., James M.N. // J. Virol. 1997. V. 71. № 3. P. 2436-2448.
67. Matthews D.A., Dragovich P.S., Webber S.E., Fuhrman S.A., Patick A.K., Zalman L.S., Hendrickson T.F., Love R.A., Prins T.J., Marakovits J.T., et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1999. V. 96. № 20. P. 11000-11007.
68. Anand K., Palm G.J., Mesters J.R., Siddell S.G., Ziebuhr J., Hilgenfeld R. // EMBO J. 2002. V. 21. № 13. P. 3213-3224.
69. Anand K., Ziebuhr J., Wadhwani P., Mesters J.R., Hilgenfeld R. // Science. 2003. V. 300. № 5626. P. 1763-1767.
70. Yang H., Yang M., Ding Y., Liu Y., Lou Z., Zhou Z., Sun L., Mo L., Ye S., Pang H., et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2003. V. 100. № 23. P. 13190-13195.
71. Birtley J.R., Knox S.R., Jaulent A.M., Brick P., Leatherbarrow R.J., Curry S. // J. Biol. Chem. 2005. V. 280. № 12. P. 11520-11527.
72. Nakamura K., Someya Y., Kumasaka T., Ueno G., Yamamoto M., Sato T., Takeda N., Miyamura T., Tanaka N. // J. Virol.
2005. V. 79. № 21. P. 13685-13693.
73. Zeitler C.E., Estes M.K., Venkataram Prasad B.V. // J. Virol.
2006. V. 80. № 10. P. 5050-5058.
74. Leen E.N., Baeza G., Curry S. // PLoS One. 2012. V. 7. № 6. P. e38723.
75. Muhaxhiri Z., Deng L., Shanker S., Sankaran B., Estes M.K., Palzkill T., Song Y., Prasad B.V. // J. Virol. 2013. V. 87. № 8.
P. 4281-4292.
76. Damalanka V.C., Kim Y., Alliston K.R., Weerawarna P.M., Galasiti Kankanamalage A.C., Lushington G.H., Mehzabeen N., Battaile K.P., Lovell S., Chang K.O., et al. // J. Med. Chem. 2016. V. 59. № 5. P. 1899-1913.
77. Ziebuhr J., Heusipp G., Siddell S.G. // J. Virol. 1997. V. 71. № 5. P. 3992-3997.
78. Hegyi A., Friebe A., Gorbalenya A.E., Ziebuhr J. // J. Gen. Virol. 2002. V. 83. № 3. P. 581-593.
79. Someya Y., Takeda N., Miyamura T. // J. Virol. 2002. V. 76. № 12. P. 5949-5958.
80. Nishifuji K., Sugai M., Amagai M. // J. Dermatol. Sci. 2008. V. 49. № 1. P. 21-31.
81. Bukowski M., Wladyka B., Dubin G. // Toxins (Basel). 2010. V. 2. № 5. P. 1148-1165.
82. Bailey C.J., Redpath M.B. // Biochem. J. 1992. V. 284. № 1. P. 177-180.
83. Vath G.M., Earhart C.A., Rago J.V., Kim M.H., Bohach G.A., Schlievert P.M., Ohlendorf D.H. // Biochemistry. 1997. V. 36. № 7. P. 1559-1566.
84. Cavarelli J., Prevost G., Bourguet W., Moulinier L., Chevrier B., Delagoutte B., Bilwes A., Mourey L., Rifai S., Piemont Y., et al. // Structure. 1997. V. 5. № 6. P. 813-824.
85. Vath G.M., Earhart C.A., Monie D.D., Iandolo J.J., Schlievert P.M., Ohlendorf D.H. // Biochemistry. 1999. V. 38. № 32.
P. 10239-10246.
86. Yamaguchi T., Nishifuji K., Sasaki M., Fudaba Y., Aepfelbacher M., Takata T., Ohara M., Komatsuzawa H., Amagai M., Sugai M. // Infect. Immun. 2002. V. 70. № 10. P. 5835-5845.
87. Ahrens P., Andresen L.O. // J. Bacteriol. 2004. V. 186. № 6. P. 1833-1837.
88. Rago J.V., Vath G.M., Bohach G.A., Ohlendorf D.H., Schlievert P.M. // J. Immunol. 2000. V. 164. № 4. P. 2207-2213.
89. Meijers R., Blagova E.V., Levdikov V.M., Rudenskaya G.N., Chestukhina G.G., Akimkina T.V., Kostrov S.V., Lamzin V.S., Kuranova I.P. // Biochemistry. 2004. V. 43. № 10. P. 2784-2791.
90. Prasad L., Leduc Y., Hayakawa K., Delbaere L.T. // Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 2004. V. 60. № 2. P. 256-259.
91. Chen C., Krishnan V., Macon K., Manne K., Narayana S.V., Schneewind O. // J. Biol. Chem. 2013. V. 288. № 41. P. 29440-29452.
92. Bode W. // J. Mol. Biol. 1979. V. 127. № 4. P. 357-374.
93. Bode W., Schwager P., Huber R. // J. Mol. Biol. 1978. V. 118. № 1. P. 99-112.
94. Wang D., Bode W., Huber R. // J. Mol. Biol. 1985. V. 185. № 3. P. 595-624.
95. Wroblowski B., Diaz J.F., Schlitter J., Engelborghs Y. // Protein Eng. 1997. V. 10. № 10. P. 1163-1174.
96. Gomis-Ruth F.X., Bayes A., Sotiropoulou G., Pampalakis G., Tsetsenis T., Villegas V., Aviles F.X., Coll M. // J. Biol. Chem. 2002. V. 277. № 30. P. 27273-27281.
97. Demidyuk I.V., Romanova D.V., Nosovskaya E.A., Chestukhina G.G., Kuranova I.P., Kostrov S.V. // Protein Eng. Des. Sel. 2004. V. 17. № 5. P. 411-416.
98. Breddam K., Meldal M. // Eur. J. Biochem. 1992. V. 206. № 1. P. 103-107.
99. Nemoto T.K., Ohara-Nemoto Y., Ono T., Kobayakawa T., Shimoyama Y., Kimura S., Takagi T. // FEBS J. 2008. V. 275. № 3. P. 573-587.
100. Rouf S.M., Ohara-Nemoto Y., Shimoyama Y., Kimura S., Ono T., Nemoto T.K. // Indian J. Biochem. Biophys. 2012. V. 49. № 6. P. 421-427.
101. Drapeau G.R. // J. Bacteriol. 1978. V. 136. № 2. P. 607-613.
102. Park C.H., Lee S.J., Lee S.G., Lee W.S., Byun S.M. // J. Bacteriol. 2004. V. 186. № 19. P. 6457-6464.
103. Велишаева Н.С., Гасанов Е.В., Громова Т.Ю., Демидюк И.В. // Биоорган. химия. 2008. Т. 34. № 6. С. 786-791.
104. Demidyuk I.V., Gasanov E.V., Safina D.R., Kostrov S.V. // Protein J. 2008. V. 27. № 6. P. 343-354.
105. Geigenmuller U., Chew T., Ginzton N., Matsui S.M. // J. Virol. 2002. V. 76. № 4. P. 2003-2008.
106. Kiang D., Matsui S.M. // J. Gen. Virol. 2002. V. 83. № 1. P. 25-34.
107. Truhlar S.M., Cunningham E.L., Agard D.A. // Protein Sci. 2004. V. 13. № 2. P. 381-390.
108. Baardsnes J., Sidhu S., MacLeod A., Elliott J., Morden D., Watson J., Borgford T. // J. Bacteriol. 1998. V. 180. № 12. P. 3241-3244.
109. Gasanov E.V., Demidyuk I.V., Shubin A.V., Kozlovskiy V.I., Leonova O.G., Kostrov S.V. // Protein Eng. Des. Sel. 2008. V. 21. № 11. P. 653-658.
110. Rice K., Peralta R., Bast D., de Azavedo J., McGavin M.J. // Infect. Immunol. 2001. V. 69. № 1. P. 159-169.
111. Massimi I., Park E., Rice K., Muller-Esterl W., Sauder D., McGavin M.J. // J. Biol. Chem. 2002. V. 277. № 44. P. 4177041777.
112. Shaw L., Golonka E., Potempa J., Foster S.J. // Microbiology. 2004. V. 150. № 1. P. 217-228.
113. Nickerson N.N., Prasad L., Jacob L., Delbaere L.T., McGavin M.J. // J. Biol. Chem. 2007. V. 282. № 47. P. 34129-34138.
114. Trachuk L.A., Shcheglov A.S., Milgotina E.I., Chestukhina G.G. // Biochimie. 2005. V. 87. № 6. P. 529-537.
115. Demidyuk I.V., Shubin A.V., Gasanov E.V., Kostrov S.V. // BioMolecular Concepts. 2010. V. 1. № 3-4. P. 305-322.
116. Iwase T., Uehara Y., Shinji H., Tajima A., Seo H., Takada K., Agata T., Mizunoe Y. // Nature. 2010. V. 465. № 7296.
P. 346-349.
117. Kim Y., Lovell S., Tiew K.C., Mandadapu S.R., Alliston K.R., Battaile K.P., Groutas W.C., Chang K.O. // J. Virol. 2012. V. 86. № 21. P. 11754-11762.
118. Nair S., Savithri H.S. // Virology. 2010. V. 396. № 1. P. 106117.
119. Calandria C., Irurzun A., Barco A., Carrasco L. // Virus Res. 2004. V. 104. № 1. P. 39-49.
120. Chau D.H., Yuan J., Zhang H., Cheung P., Lim T., Liu Z., Sall A., Yang D. // Apoptosis. 2007. V. 12. № 3. P. 513-524.
121. Ma Z., Wang Y., Zhao H., Xu A.T., Wang Y., Tang J., Feng W.H. // PLoS One. 2013. V. 8. № 7. P. e69387.
122. Shubin A.V., Demidyuk I.V., Lunina N.A., Komissarov A.A., Roschina M.P., Leonova O.G., Kostrov S.V. // BMC Cell Biol. 2015. V. 16. № 1. P. 4.
