CC BY
241
УДК 577.21
Посттрансляционные модификации рибосомных белков Escherichia coli
М. В. Нестерчук*, П. В. Сергиев, О. А. Донцова
Научно-исследовательский институт физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского и химический факультет Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова, 119992, Москва, Ленинские горы, 1, стр. 40 *E-mail: nesterchuk.mihail@gmail.com Поступила в редакцию 14.02.2011 г.
реферат в клетках Escherichia coli ряд рибосомных белков подвергается посттрансляционной модификации: шесть белков метилированы (S11, L3, L11, L7/L12, L16, L33), три - ацетилированы (S5, S18 и L7), один метилтиолирован (S12), к одному добавляются дополнительные аминокислотные остатки (S6), а у одного удаляются С-концевые аминокислотные остатки (L31). Функциональная значимость модификаций рибосомных белков в настоящее время не известна, они не относятся к жизненно необходимым для клетки и, вероятно, выполняют регуляторную роль. В обзоре рассмотрены все известные посттрансляционные модификации рибосомных белков E. coli, а также некоторые ферменты, осуществляющие модификацию, и механизм их действия.
КЛЮчЕВыЕ СЛОВА рибосомные белки, посттрансляционная модификация, Escherichia coli.
СПИСОК сокращений РНК - рибонуклеиновая кислота; рРНК - рибосомная РНК; мРНК - матричная РНК; тРНК - транспортная РНК; IF2 - инициаторный фактор 2; EF-Tu - элонгационный фактор Tu; EF-G - элон-гационный фактор G; RF3 - фактор терминации 3; GTP - гуанозин-5’-трифосфат.
ВВЕДЕНИЕ
Рибосома - сложная молекулярная машина, отвечающая за правильный перевод генетической информации с последовательности нуклеотидов мРНК в последовательность аминокислот синтезируемого белка. Рибосома представляет собой комплекс рибосомных РНК (рРНК) и белков, который состоит из двух неравных частей (большой и малой субчастиц). Малая субчастица рибосом Escherichia coli состоит из 16S рРНК и 22 белков (обозначаемых S1-S22), а большая - из 5S и 23S рРНК и 34 различных белков (L1-L36). В клетке как рРНК, так и рибосом-ные белки подвергаются ферментативной модификации. Больше чем у половины рибосомных белков отщепляется N-концевой остаток метионина. Шесть белков метилированы (S11, L3, L11, L7/L12, L16, L33), три - ацетилированы (S5, S18 и L7), один метилтиолирован (S12), к одному добавляются дополнительные аминокислотные остатки (S6), а один подвергается частичному протеолизу (L31) (табл. 1). Природа некоторых модификаций рибосомных белков E. coli до сих пор не установлена [1].
Гены, которые кодируют ферменты, осуществляющие посттрансляционную модификацию, в большинстве случаев идентифицированы. Несмотря на это, функциональная роль этих модификаций практиче-
ски не изучена. Центральная роль рибосомы в механизме реализации генетической информации в клетке позволяет предположить, что модифицированные белки рибосомы могут быть важны для целого ряда механизмов регуляции экспрессии генов.
процессинг n-конца рибосомных БЕЛКОВ
Самый распространенный тип посттрансляционной модификации белков - удаление N-концевого остатка метионина, осуществляемое метионин-аминопептидазой (MAP). Концевой метионин отщепляется у 34 из 57 рибосомных белков E. coli (табл. 2).
Эта модификация наиболее часто встречается в белках, в которых следующий за метионином аминокислотный остаток имеет короткую боковую цепь [2]. Большие боковые цепи препятствуют попаданию белка в активный центр метионин-аминопептидазы. Если в молекуле белка второй остаток - аланин (21 случай), а также лейцин, пролин или глицин, то N-концевой метионин всегда отщепляется. Если же за первым остатком следуют лизин, изолейцин, глутамин, аргинин, аспарагиновая кислота, тирозин, глутаминовая кислота, фенилаланин или валин, как это наблюдается у 20 рибосомных белков, то N-концевой остаток метионина всегда сохраняется в молекуле
Таблица 1. Модификации рибосомных белков E. coli
Белок Положение модификации Модификация Модифицирующий фермент
S5 П-концевая аминогруппа Ацетилирование RimJ
S6 С-конец Добавление дополнительных остатков глутаминовой кислоты ГтК
S11 П-концевая аминогруппа Метилирование, образование изопептидной связи Не установлен
Образование остатка изоаспартата Не установлен
S12 Asp88 Метилтиолирование RimO
S18 П-концевая аминогруппа Ацетилирование RimI
L3 Gln150 Метилирование РгтВ
L7/L12 Lys81 Метилирование Не установлен
L11 А1а1, Lys3, Lys39 Метилирование РгтА
L12 П-концевая аминогруппа Ацетилирование RimL
L16 П-концевая аминогруппа Метилирование Не установлен
L31 С-конец Удаление аминокислотных остатков Не установлен
L33 П-концевая аминогруппа Метилирование Не установлен
белка. Когда в положении 2 находится серин, в четырех случаях из пяти остаток метионина сохраняется. Следует отметить, что остатки метионина удаляются только из некоторой доли молекул белка L33, часть цепей (не более 25%) остается с П-концевым метилированным метионином. Вероятно, это связано с конкуренцией П-концевого метилирования и отщепления метионина [3].
ПРОЦЕССИНГ С-КОНЦА БЕЛКА L31
Определенная химическим путем С-концевая аминокислотная последовательность рибосомного белка L31 (...Е^ПК) [4] отличается от предсказанной по нуклеотидной последовательности гена этого белка (...RFNKRFШPGSK). Был сделан вывод, что белок L31 подвергается С-концевому процессингу (возможно, существует специфическая протеаза, удаляющая фрагмент RFNIPGSK). В дальнейшем эти данные опровергли и показали, что первичная структура L31 согласуется с геномной [5]. Однако масс-спектрометрический анализ рибосомных белков выявляет два пика для L31: при 7871.1 Да, который соответствует полной последовательности L31, предсказанной по геномной, и при 6971.1 Да, соответствующий фрагменту L31 без С-концевого участка ...RFNIPGSK [1]. По-видимому, процессируется только часть молекул белка L31.
L31 - малоизученный компонент бактериальной рибосомы. Известно, что L31 образует рибонуклео-протеидный комплекс с белками L5, L18, L25 и 58 рРНК, он располагается на вершине центрального протуберанца в непосредственной близости к месту контакта субчастиц. Посттрансляционная модифи-
кация служит, возможно, для активации белка либо играет регуляторную роль. Однако данных о функции сайт-специфического протеолиза L31, как и о его возможном механизме, нет.
Интересно, что геном Е. со11 содержит два гена белка L31 со сходной, но не идентичной последовательностью [6]. Белок L31, присутствующий в клетках в «обычных» лабораторных условиях культивирования, содержит мотив «цинковая лента». При недостатке ионов цинка при помощи транскрипционного регулятора Zur активируется экспрессия другого варианта L31, лишенного «цинковой ленты». Это переключение, по-видимому, способствует более экономному использованию ионов цинка в клетке. Аналогичный механизм описан для рибосомного белка L36 [7].
метилирование рибосомных белков
Метилирование - один из наиболее распространенных типов посттрансляционной модификации белков, которому подвергаются самые разные прокариотические и эукариотические белки. Метилирование осуществляется специальными ферментами (метилтрансферазами), которые используют 8-аденозилметионин в качестве донора метильных групп. Выделяют пять классов метилтрансфераз, отличающихся структурой и субстратной специфичностью.
Как правило, метилирование рибосомных белков происходит по боковой аминогруппе лизина или аргинина, часто встречается и метилирование П-концевой аминогруппы. В клетках Е. со11 метилированы шесть рибосомных белков (табл. 1) [8]. Идентифицированы
Таблица 2. Посттрансляционное удаление N-концевого остатка метионина в рибосомных белках E. coli [1]
Белок Удаление Met Второй остаток после Met
S1 ? Thr
S2 + Ala
S3 + Gly
S4 + Ala
S5 + Ala
S6 - Arg
S7 + Pro
S8 + Ser
S9 + Ala
S10 - Gln
S11 + Ala
S12 + Ala
S13 + Ala
S14 + Ala
S15 + Ser
S16 - Val
S17 + Thr
S18 + Ala
S19 + Pro
S20 + Ala
S21 + Pro
S22 - Lys
L1 + Ala
L2 + Ala
L3 - Ile
L4 - Glu
L5 + Ala
L6 + Ser
L7 + Ser
L9 - Gln
L10 + Ala
L11 + Ala
L12 + Ser
L13 - Lys
L14 - Ile
L15 - Arg
L16 - Leu
L17 - Arg
L18 - Asp
L19 - Ser
L20 + Ala
L21 - Tyr
L22 - Glu
L23 - Ile
L24 + Ala
L25 - Phe
L26 + Ala
L27 + Ala
L28 + Ser
L29 - Lys
L30 + Ala
L31 - Lys
L32 + Ala
L33 + Ala
L34 - Lys
L35 + Pro
L36 - Lys
специфичные для двух белков (L11 и L3) метилтранс-феразы (PrmA и PrmB соответственно), найдены кодирующие их гены. Об остальных модификациях известно очень немного.
Некоторые метилированные рибосомные белки играют важную роль в функционировании рибосомы: L7/L12 и L11 взаимодействуют с факторами трансляции, L3 участвует в сборке рибосомы. Однако, несмотря на то что функции этих рибосомных белков достаточно хорошо изучены, биологическое значение их метилирования до сих пор не выяснено. Мутации в генах, кодирующих соответствующие метилтранс-феразы, не приводят к заметным фенотипическим изменениям. Вероятно, метилирование регулирует внутри- и межмолекулярные взаимодействия в белке или влияет на его сродство к РНК и таким образом действует на различные клеточные процессы - регуляцию трансляции, ее точность, процессинг РНК и сборку рибосомы.
Метилирование белка L11
Наиболее сильно метилированный белок бактериального аппарата трансляции - рибосомный белок L11 [9]. Он содержит три метилированных аминокислотных остатка: N-концевой остаток аланина три-метилирован по а-аминогруппе, 3-й и 39-й остатки лизина триметилированы по е-аминогруппам. Таким образом, всего к белку посттрансляционно присоединяются девять метильных групп [10]. Метилирование осуществляет один фермент - PrmA (protein modification), который был выделен и охарактеризован [11]. Установлено, что это белок массой 31 кДа, использующий в качестве донора метильной группы S-аденозилметионин и преимущественно модифицирующий свободный белок L11. Последнее указывает на то, что метилирование предшествует встраиванию белка в рибосому [11].
Получен мутантный штамм E. coli, не содержащий метильных групп в белке L11. С помощью этого штамма определено положение гена prmA, кодирующего метилтрансферазу PrmA [12].
Этот фермент обладает необычной субстратной специфичностью, что позволяет ему модифицировать несколько аминогрупп белка, принадлежащим разным аминокислотным остаткам и расположенным различным образом по отношению к пептидному скелету (а- и е-аминогруппы). Для этого фермент должен либо связываться с субстратом в нескольких разных ориентациях, либо для множественной модификации использовать систему гибкого субстратного позиционирования, позволяющую переориентировать субстрат относительно постоянного участка связывания. Строение PrmA и механизм его взаимодействия с субстратом подробно изучен [13, 14].
Рис. 1. Структура РгтА в комплексе с ^концевым доменом L11. РгтА и L11 показаны розовым и голубым. Боковая цепь остатка Lys39 показана в каркасном виде
[13].
Метилтрансфераза PrmA состоит из двух доменов, соединенных гибким линкером (рис. 1). Большой каталитический С-концевой домен является типичным примером метилтрансфераз класса I. Семитяжевой P-лист фланкирован с обеих сторон а-спиралями. Небольшой дополнительный трехтяжевой Р-лист служит связующим звеном между С-концевым доменом и линкерной междоменной а-спиралью. Малый N-концевой домен состоит из четырехтяжевого P-листа, фланкированного с одной стороны междоменной линкерной а-спиралью, с другой -N-концевой а-спиралью. N-Концевой домен PrmA уникален, он способен распознавать и связывать белок L11 (рис. 1) [13]. С помощью биоинформатических методов установлено, что N-концевой домен PrmA по структуре напоминает V-домен фактора EF-G, который при связывании с рибосомой находится в непосредственной близости к белку L11 [15].
Поверхность связывания N-концевого домена PrmA с белком L11 частично перекрывается с поверхностью связывания L11 c 23S рРНК. Поэтому PrmA модифицирует L11 только в свободном состоянии, до его встраивания в рибосому. Это подтверждает ранее полученные данные метилирования L11 in vitro [11]. Связывание N-концевого домена PrmA c L11 высокоспецифично, стабилизировано множеством водородных связей, тогда как каталитический С-концевой домен сам по себе не обладает специфичностью, его взаимодействие с субстратом стабилизировано лишь локальным гидрофобным взаимодействием (боковая цепь модифицируемого остатка лизина попадает в активный центр через туннель, образованный гидрофобными аминокислотными остатками, которые взаимодействуют с гидрофобной частью бокового радикала лизина). За счет гибкости
N-Концевой домен
С-Концевой
домен
Рис. 2. Наложение структур PrmA в четырех различных конформациях. Зеленым и серым показаны две конформации PrmA в свободном состоянии, желтым -комплекс PrmA и SAM, розовым - в комплексе с L11. Видна высокая подвижность N-концевого домена [13].
междоменного линкера каталитический домен может изменять свое положение относительно связанного с L11 N-концевого домена и метилировать все доступные для него аминогруппы (рис. 2).
В структуре каталитического домена имеется специальный гидрофобный карман для связывания S-аденозилметионина, этот карман открыт, т.е. возможен обмен между S-аденозилгомоцистеином (продуктом реакции) и S-аденозилметионином без нарушения фермент-субстратного комплекса. В активном центре PrmA нет атомов, затрудняющих вращение метилированной аминогруппы, что позволяет однажды связавшемуся с субстратом ферменту сразу три-метилировать его. Для метилирования аминогруппы необходимо, чтобы каталитический центр содержал основной аминокислотный остаток, акцептирующий протон с атома азота. Роль такого остатка, очевидно, выполняет His104, находящийся в активном центре напротив участка связывания кофактора.
Таким образом, метилирование, осуществляемое ферментом PrmA, служит редким примером одновременного специфического узнавания мишени и множественной модификации субстрата за счет разделения в пространстве участка связывания и каталитического центра, а также их взаимной подвижности. Одна молекула метилтрансферазы способна последовательно ввести девять метильных групп
в белок L11 без диссоциации фермент-субстратного комплекса.
Белок L11 - это консервативный компонент большой субчастицы бактериальной рибосомы и активный участник взаимодействия рибосомы с факторами инициации, элонгации и терминации трансляции. Он состоит из двух доменов, соединенных между собой гибким линкером: С-концевого, связывающего 23S РНК, и N-концевого, взаимодействующего с факторами трансляции [13]. N-Концевой домен является мишенью антибиотика тиострептона, который ингибирует связывание EF-G с рибосомой (устойчивость к тиострептону обеспечивается рядом мутаций в N-концевом домене белка L11) [16]. Методом крио-электронной микроскопии показано, что N-концевой домен L11 прямо контактирует с факторами EF-G [15] и EF-Tu [17].
Все аминокислотные остатки, которые тримети-лируются PrmA, находятся в N-концевом домене. Такое расположение модифицированных остатков рядом с местом контакта с факторами трансляции может указывать на функциональную значимость метилирования. Структура PrmA консервативна у всех бактерий, что также может свидетельствовать о его вкладе в функционирование L11. Но, тем не менее, функция модификации, осуществляемой PrmA, до сих пор не установлена. Штамм с мутацией гена prmA не только жизнеспособен, но и не имеет никаких заметных отличий от штамма дикого типа (одинаковая скорость роста и одинаковое поведение в стрессовых условиях) [18, 19]. Это означает, что множественное метилирование L11 не является необходимым для нормального функционирования рибосомы. В то же время оно может влиять на скорость и точность таких этапов работы рибосомы, как декодирование и транслокация, что можно зафиксировать только с применением очень точного кинетического анализа in vitro либо введением специфических мутаций в белок L11 или другие компоненты аппарата трансляции in vivo [13].
Метилирование белка L3
К рибосомному белку L3 посттрансляционно добавляется одна метильная группа [20]. Метилирование происходит по амидной группе 150-го остатка глутамина [21]. Модификацию осуществляет специфическая метилтрансфераза PrmB, ген которой идентифицирован [12]. PrmB - первая описанная метилтрансфе-раза, мишенью которой служит амидный атом азота.
У штамма, содержащего мутацию в гене prmB, отсутствие метилирования в белке L3 сочетается с чувствительностью к холоду. Скорость роста мутантных клеток при 22°С значительно ниже, чем у клеток дикого типа [22, 23]. Это связано с тем, что при низкой
температуре сборка рибосом в мутантных клетках происходит неэффективно, а по структуре и стабильности образующиеся промежуточные рибону-клеопротеидные комплексы отличаются от соответствующих интермедиатов в штамме дикого типа. Тем не менее, полностью сформированные при пониженной температуре мутантные рибосомы не отличаются по стабильности от рибосом дикого типа. Разницы в скорости трансляции и ее точности также не наблюдается ни in vivo, ни in vitro [22].
Изучение активности фермента PrmB in vitro показало, что белок L3 в свободном состоянии не метилируется. Полностью собранную рибосому метил-трансфераза также не модифицирует. Наибольшая активность наблюдается в частично собранной рибосоме, а также в присутствии в реакционной смеси РНК (любой, не обязательно рибосомной) [22].
Белок L3 связывается с 3’-концевым участком 23S рРНК на самом первом этапе сворачивания структуры и является, наряду с L24, инициатором всего процесса сборки рибосомы [24].
Из сказанного можно сделать вывод, что in vivo PrmB осуществляет метилирование L3, связываясь с рибосомой на одном из промежуточных этапов ее сворачивания, и, вероятно, оказывает определенное влияние на правильность ее упаковки. Таким образом, фермент PrmB можно отнести к факторам сборки рибосомы.
Белок L3 имеет глобулярный домен, располагающийся на поверхности рибосомы, и длинный глубоко погруженный внутрь отросток. Модифицированный 150-й остаток глутамина располагается внутри рибосомы рядом с туннелем для растущей полипеп-тидной цепи, он образует контакты с нуклеотидными остатками G2032, C2055 и A2572, которые находятся в 3’-концевой области 23S рРНК. Очевидно, этот остаток вносит вклад в формирование и поддержание правильной конформации рРНК.
Метилирование белка S11 и образование изомерной пептидной связи
В рибосомном белке S11 метилированию подвергается N-концевая аминогруппа, принадлежащая остатку аланина. Помимо метилирования наблюдается образование изопептидной связи. Этой модификации подвержен только один белок E. coli, S11. При этом разрушается пептидная связь между первым и вторым остатками (аланин и лизин) в молекуле S11 (рис. 3) [25].
В работе [26] сообщается, что в белке S11 обнаружен остаток изоаспартата. На один моль белка приходится 0.5 моль изоаспартата. При этом показано, что в логарифмической фазе роста такую модификацию имеет только S11.
Рис. 3. Структура метилированного ^концевого остатка Б11, образующего изопептидную связь [25].
Ферменты, осуществляющие перечисленные модификации, не установлены, как и функциональная роль модификаций.
Белок S11 находится в непосредственной близости к мРНК и тРНК в Е-участке. Его П-конец, выступающий на поверхность рибосомы, не виден в кристаллической структуре и, вероятно, не имеет фиксированной ориентации. Маловероятно, что модифицированный остаток вносит вклад в поддержание структуры рибосомы. Возможно, метилированный П-конец S11 взаимодействует с тРНК и облегчает ее выход из Е-участка.
Метилирование белка L7/L12
Рибосомный белок L7/L12 монометилирован по е-аминогруппе 81-го остатка лизина. Степень метилирования сильно зависит от температуры. При 37°С модификации практически не наблюдается (меньше 0.1 метильной группы на молекулу белка). С понижением температуры количество вводимых групп резко увеличивается и при 27°С составляет 0.6 остатка монометиллизина на молекулу белка [27]. Фермент, осуществляющий эту модификацию, не установлен.
В составе рибосомы белок L7 ^12 находится в виде тетрамера, представляющего собой палочковидный отросток, так называемый Л7^12-стержень». Каждая цепь в тетрамере состоит из двух доменов: П-концевого, связывающегося с белком L10, и С-концевого. Домены соединены гибким линкером, позволяющим С-концевым доменам свободно изменять свое положение относительно большой субчастицы. Таким образом, L7/L12 - единственный рибосомный белок, не контактирующий непосредственно с рРНК, он связан с ней через комплекс с белком L10. Этот комплекс выполняет важную роль в процессе трансляции, он участвует в связывании с рибосомой факторов трансляции (№2, ЕF-Tu, ЕF-G и Б^3) [28]. Метилированные остатки располагаются в С-концевом домене и, возможно, вносят свой вклад во взаимодействие с факторами трансляции.
Метилирование белков L16 и L33
В рибосомных белках L16 и L33 метилированию подвергаются П-концевые аминогруппы. В L16 моди-
фицирован первый остаток метионина [29]. А в L33 часть полипептидных цепей начинается с мономе-тилированного метионина (не более 25%), а часть -с монометилированного аланина [30]. Подобная гетерогенность, по-видимому, связана с конкуренцией процессов метилирования и отщепления П-концевого метионина. Предположение о возможном восстановлении П-формилметионина до П-метилметионина было опровергнуто [3].
Метилтрансферазы, осуществляющие модификацию белков L16 и L33, не идентифицированы.
В белке L16 обнаружен еще один вид модификации. Исходя из аминокислотной последовательности, белок L16 должен иметь массу 15281.3 Да. Однако на масс-спектре этого белка нет пика, соответствующего такой массе, но есть пик для массы 15326.2 Да, что на 44.9 Да больше. Метильная группа на П-конце белка увеличивает его массу только на 14 Да. Это означает, что молекула L16 должна содержать, как минимум, еще одну посттрансляционную модификацию. Предположительно, А^81 подвергается гидрокси-лированию, но и в этом случае модифицированный белок должен быть на 14.9 Да легче наблюдаемого масс-спектрометрически [1]. Возможно, имеет место еще одно метилирование или гидроксилирование. Более определенные данные о природе и локализации неизвестной модификации будут получены из масс-спектров продуктов трипсинолиза белка L16.
Белки L16 и L33 располагаются рядом с центральным протуберанцем с противоположных сторон. Их П-концевые остатки выходят на поверхность рибосомы и не образуют прямых контактов с рРНК и белками.
ацетилирование рибосомных белков
Па-ацетилирование белков катализируется Па-ацетилтрансферазами, которые переносят ацетильную группу с ацетилкофермента А на П-концевую аминогруппу белка. У эукариот такая модификация белков встречается повсеместно - 80-90% цитоплазматических белков у млекопитающих и 50% у дрожжей ацетилированы по П-концевому аминокислотному остатку [31]. У прокариот такая модификация осуществляется редко. Известно всего четыре белка E. ^И, которые ей подвергаются: фактор ЕF-Tu, а также рибосомные белки S5, S18 и L7. Определены гены, кодирующие ферменты, которые осуществляют модификацию рибосомных белков S5, S18 и L7: rimJ, riml и rimL соответственно. Каждая из перечисленных ацетилтрансфераз специфически модифицирует только один белок (в отличие от эукариот, у которых такие ферменты менее специфичны). Несмотря на сходные функции, структуры этих ферментов сильно различаются. Сходство
последовательностей RimI (148 остатков), RimJ (194 остатка) и RimL (178 остатков) составляет 19 и 20% соответственно, а между RimJ и RimL - 23% (хотя RimI и RimJ - аланин-ацетилтрансферазы, а RimL - серин-ацетилтрансфераза). Вероятно, эти белки не имели общего предка и эволюционировали независимо друг от друга [32].
Эукариотические №а-ацетилтрансферазы, как правило, состоят из двух или трех различных субъединиц, они модифицируют субстрат котрансляционно, тогда как прокариотические ферменты чаще мономерны или представляют собой гомодимеры (например, RimL) и ацетилируют субстрат посттрансляци-онно [33].
Ацетилирование белка S5
Рибосомный белок S5 ацетилирован по а-аминогруппе первого остатка аланина [34]. Ацетилирование осуществляется специфическим ферментом RimJ (ribo-somal modification) [35]. Идентифицирован и секвени-рован ген rimJ, кодирующий этот фермент [36].
Установлена субстратная специфичность RimJ. В работе [37] авторы исследовали штамм E. coli, содержащий мутацию в центральном псевдоузле 16S рРНК (С18А). Эта мутация приводит к нарушению сборки 30S субчастицы, ухудшению связывания с ней белков S1, S2, S18 и S21 и, следовательно, к снижению эффективности трансляции. Помимо этого, мутация вызывает уменьшение доли ацетилирован-ных молекул S5, т.е. снижается активность RimJ. Это, очевидно, связано с тем, что S5 находится в непосредственной близости к центральному псевдоузлу, мутации в котором могут изменять место посадки S5 на 30S субчастицу, тогда RimJ не может связываться с субстратом. Стоит отметить, что в собранных 70S мутантных рибосомах неацетилированный S5 не найден. Видимо, связывание мутантной 30S субчастицы с 50S стабилизирует функционально активную конформацию 30S субчастицы. Находясь в этой конформации, 30S субчастица становится субстратом RimJ. Ранее было показано, что мутация в белке S4 также приводит к меньшей эффективности ацетилирования
S5 [38]. Эти данные свидетельствуют о том, что аце-тилирование S5 осуществляется на собранной рибосоме.
Функция RimJ связана не только с модификацией белка S5, но и с другими этапами биогенеза малой субчастицы рибосомы [39]. В штамме E. coli с мутацией в гене белка S5 (28-й остаток глицина заменен на аспарагиновую кислоту) нарушена сборка рибосом и снижена точность трансляции, наблюдается чувствительность к холоду. Суперэкспрессия RimJ в этом штамме полностью восстанавливает все дефекты трансляции. Это означает, что независимо от ацетилтрансфераз-
ной активности RimJ вносит вклад в формирование правильной структуры рибосомы. Доказательством может служить то, что RimJ связывается с 30S субчастицей на ранних стадиях ее сборки [39]. Функции RimJ как фактора сборки рибосомы и ацетилтранс-феразы могут совмещаться и осуществляться одновременно или последовательно.
Белок S5 располагается на противоположной по отношению к декодирующему центру стороне малой субчастицы. №-Концевые остатки выступают над поверхностью рибосомы и не видны в кристаллической структуре. Значит, а-аминогруппа первого остатка белка S5 в составе рибосомы доступна для ацети-лирования, что согласуется с результатами работы [37].
Белок RimJ выполняет функции, не связанные прямо с ацетилированием S5. Показано, что RimJ является репрессором оперона pap, отвечающего за биосинтез пилей в патогенном штамме E. coli, вызывающем пиелонефрит. RimJ регулирует транскрипцию этого оперона в зависимости от внешних условий (температура, наличие питательных веществ). Механизм этой регуляции и ее связь с ацетилтрансферазной функцией RimJ не установлены [40].
Ацетилирование белка S18
Белок S18, как и S5 и L12, подвергается №-концевому ацетилированию (по остатку аланина) [41]. Модификация осуществляется специфической ацетилтранс-феразой, кодируемой геном rimI [36].
Ацетилирование S18 не относится к модификациям, необходимым для клетки. Клетки с мутациями в гене rimI не только жизнеспособны, но и не отличаются фенотипически от клеток дикого типа [42].
Определена пространственная структура RimI из Salmonella typhimurium (первичная структура полностью идентична RimI из E. coli) [32]. Фермент имеет смешанную aP-структуру с центральным семитяжевым P-листом, фланкированным четырьмя а-спиралями (рис. 4). Центральный P-лист имеет преимущественно антипараллельную структуру, за исключением параллельных тяжей 4 и 5. Порядок P-тяжей в листе линейный, кроме тяжа P7, расположенного между P5 и P6. Лист имеет V-образную структуру, в которой тяжи P1 — P4 формируют одно плечо, а P5 — P7 - другое. Предполагается, что в V-образном расширении между P4- и P5-тяжами располагается ацетилтрансферазный центр.
Исходя из данных о пространственной структуре комплекса фермента с субстратом и коферментом (ацетилкоферментом A), предложен механизм аце-тилтрансферазной реакции (рис. 5).
№-Концевой атом азота S18 нуклеофильно атакует карбонильный атом углерода ацетилкофермента A,
Рис. 4. Структура комплекса RimI-бисубстрат. Бисубстрат показан в каркасном виде. Элементы вторичной структуры окрашены зеленым (в 1, а1, а2), желтым (Р2-Р4), красным (а3, Р5) и синим (а4, Р6, Р7) в порядке их следования с Оконца [32].
остаток Glu103 выступает здесь как акцептор протона (рис. 5а). Это приводит к образованию тетраэдрического интермедиата (рис. 5б). При распаде интермедиата Туг115 служит донором протона (рис. 5в).
Несмотря на то что установлен механизм ацети-лирования S18, до сих пор не выяснено, в чем состоит функция ацетилирования, и когда оно происходит. Белок S18 располагается в центральном домене малой субчастицы рибосомы рядом с белками S11 и S6,
причем взаимодействие S18 c S6 настолько прочное, что образуется стабильный гетеродимер [43]. S18 находится вблизи Е-участка. Первые 15 №-концевых остатков S18 не видны в кристаллической структуре рибосомы, а значит, скорее всего, не имеют фиксированного положения в пространстве. Возможно, они располагаются рядом с участком посадки мРНК на малую субчастицу. В этом случае №-концевое аце-тилирование может влиять на процесс инициации трансляции.
Ацетилирование белка L12
Рибосомный белок L12 существует в двух различных формах: неацетилированной (L12) и ацетилирован-ной (называемой L7) [44]. Из-за идентичности аминокислотных последовательностей этот белок называют L7/L12.
Ацетилирование а-атома азота Ser1 в белке L12 осуществляется специфическим ферментом RimL и приводит к образованию L7 [45]. RimL может аце-тилировать in vitro как свободный белок L12 [46], так и L12 в составе рибосомы [33]. По-видимому, in vivo модификация L12 тоже может происходить на любом этапе биогенеза рибосомы. В отличие от полностью модифицированных S5 и S18, L12 ацетилирован лишь частично. Соотношение L7/L12 варьирует в зависимости от фазы и скорости роста клеток. В середине логарифмической фазы доля L12 достигает 85%, затем содержание L7 постепенно увеличивается до 75-80% в стационарной фазе [47]. При росте клеток в минимальной среде белок целиком переходит в форму L7.
Показано, что модификация L12 повышает прочность комплекса тетрамера L7/L12 с белком L10 [48]. Авторы объясняют это тем, что ацетилирование стабилизирует №-концевые а-спирали L7 (на рис. 6 обозначены а1), фиксируя положение №-концевого
nh2
Arg2-S18
/—NH \
Leu66°..
Ala1-S18
Si,
7\ GIU103
H *Glu103
M..........Glu103°
Ile69
CoA
Leu66“ .
О
/ X Glu103
H Glu103N
X
HjC CH,
.*w
Tyr115 I
б
Рис. 5. Предполагаемый механизм реакции, катализируемой ферментом RimI. а - нуклеофильная атака карбонильного атома ацетил-кофермента А; б - образование тетраэдрического интермедиата; в - комплекс RimI с продуктами [32].
а
в
L7/L12 dNTD
a2
Рис. 6. Гипотетическая модель рибосомы E. coli с входящим в ее состав комплексом L7/L12 и L10. L10 показан синим, димеры L7/L12 - красным/фиолетовым и оттенками зеленого. Более детальное изображение взаимодействия димера N-концевых доменов L7/
L12 со спиралью а8 белка L10 иллюстрирует гипотезу о том, что N-концевое ацетилирование приводит к более сильному связыванию N-концевого домена L7/L12 с белком L10 [48].
остатка в пространстве и компактизуя тем самым структуру, делает ее более прочной.
Тем не менее, штамм с мутацией в гене rimL, в котором весь белок L12 находится в деацетилирован-ной форме, не имеет никаких заметных фенотипических отличий от штамма дикого типа. В частности, нет разницы в скорости роста клеток при 25, 37 и 42°С [46]. Значит, модификация неважна для функционирования рибосомы, а вопрос о ее возможной функции до сих пор остается открытым.
Субстратная специфичность RimL и природа №-концевого аминокислотного остатка субстрата изучена в работе [33]. Согласно опубликованным данным, в №а-ацетилированных белках это, как правило, серин, аланин или метионин. Например, в L12
из E. coli это серин, в L12 из Pseudomonas aeruginosa и Bacillus subtilis - аланин, как и в S18 и S5 E. coli. Предположение об отсутствии у RimL специфичности к N-концевому остатку было подтверждено экспериментально. RimL эффективно ацетилирует in vitro мутантный L12, в котором Ser1 заменен на Ala1 [ЗЗ].
В случае эукариотических ^-ацетилтрансфераз второй аминокислотный остаток ^-ацетилируемого белка влияет на модификацию первого. Если второй остаток - аспартат или глутамат, то модификация происходит эффективно. Чтобы исследовать влияние второго аминокислотного остатка на активность RimL, получили мутантный L12, в котором Ile2 заменили на Asp2. Оказалось, что RimL ацетилирует такой мутантный белок гораздо менее эффективно, чем нативный L12. Это еще раз подчеркивает отличие прокариотических ^-ацетилтрансфераз от эукариотических [ЗЗ].
Получена кристаллическая структура RimL из Salmonella typhimurium (сходство первичной структуры с RimL из E. coli составляет 83%). RimL представляет собой гомодимер, способный связать две молекулы ацетилкофермента A и модифицировать димерный L12 [49].
мЕтИЛтИОЛИРОВАНИЕ БЕЛКА S12
Первичную структуру рибосомного белка S12 E. coli определили химическим путем, однако его 88-й аминокислотный остаток установить не удалось [50]. Последующее секвенирование гена, кодирующего S12, показало, что в этой позиции находится аспарагиновая кислота [51]. И только через 20 лет, используя масс-спектрометрический анализ, показали, что молекулярная масса S12 равна 1З652 Да (на 46.1 Да больше, чем предсказано по нуклеотидной последовательности) [1]. Дальнейшее изучение этого феномена показало, что такое несоответствие обусловлено наличием метилтиоэфирной группы (-SCH3) (рис. 7) у Р-атома углерода Asp88 [52]. Еще позднее нашли ген rimO, который кодирует метилтиотранс-феразу, осуществляющую данную посттрансляци-онную модификацию [5З].
Рис. 7. Реакция, катализируемая RimO. Метилтиолиро-вание остатка Asp88 белка S12.
RimO-[Fe-S]
ы-СН
SAM
• гЛ
V
A
S12-[D88]
• A
s ♦ OH OH
COO' 5' -дезоксиаденозил-
радикал
A
OH OH + \
У
5'-дезоксиаденозин
V*
II.,С
«S» SAM o' *0 -o'
Рис. 8. Механизм реакции, катализируемой RimO [55].
Эта реакция - пример достаточно редкого в природе ферментативного образования связи С^ из С-Н. Такие реакции осуществляются по радикальному механизму с использованием S-аденозилметионина в качестве кофермента [54].
S12 - консервативный элемент рибосомы, а остаток Asp88 найден у всех известных гомологов S12 -в бактериях, археях и эукариотах (хотя модификация наблюдается не всегда). Asp88 располагается рядом с функциональным центром рибосомы. Попытки получить клетки Е. со11 с мутацией по этой аминокислоте не дали положительного результата. Все это указывает на важность Asp88 для функционирования рибосомы.
Все известные до БлтО метилтиотрансферазы посттранскрипционно модифицируют РНК, ШтО -первый изученный фермент этого семейства, мишенью которого служит белок. В Е. со11 помимо ШтО обнаружена только одна метилтиотрансфераза, МлаВ, модифицирующая тРНК. Аминокислотные последовательности этих двух белков характеризуются сильным сходством [53]. В частности, обе содержат мотив СхххСххС, канонический для всего семейства метилтиотрансфераз.
Метилтиолирование белка S12 осуществляется по радикальному механизму (рис. 8). На первом этапе разрывается связь С^ в S-аденозилметионине с образованием свободного метионина и 5’-дез-оксиаденозил-радикала. Затем этот радикал отнимает атом водорода у Р-атома углерода Asp88. После этого образуется тиоэфир, который на последней стадии метилируется. Таким образом, для модификации одной молекулы белка S12 требуются две молекулы S-аденозилметионина [55].
Метилирование на последней стадии также происходит с помощью фермента ШтО. Это значит,
что RimO является метилтрансферазой, хотя консервативные S-аденозилметионинсвязывающие мотивы, характерные для ферментов этого семейства, в нем не найдены [56].
Спектроскопически установлено, что в состав RimO входят два кластера [4Fe-4S] (рис. 9). Первый координирован остатками Cys150, Cys154 и Cys157 (консервативный СхххСххС-мотив), второй - остатками Cys17, Cys53 и Cys82. Предполагается, что первый кластер участвует в образовании 5’-дезоксиаденозил-радикала, а второй служит источником атома серы для образования тиоэфира [56].
RimO содержит так называемый TRAM-домен, который у MiaB служит для связывания PHK [53]. Это может указывать на то, что RimO модифицирует белок S12 в составе рибосомы. Действительно, экспериментально подтверждено, что in vivo RimO метил-тиолирует остаток Asp88 белка S12, который входит в состав малой субчастицы [57]. Ранее было установлено, что in vitro рекомбинантный RimO из E. coli и Thermatoga maritima может модифицировать синтетический пептидный субстрат, который имитирует петлю, содержащую остаток Asp88, но с очень низкой эффективностью [58].
Недавно показали, что в модификации белка S12 принимает участие не только RimO, но и консервативный белок YcaO, функция которого ранее не была известна. Нокаут гена ycaO приводит к практически полному подавлению метилтиолирующей активности RimO. Кроме того, транскриптомный анализ штаммов с делецией генов rimO и ycaO указывает на перекрывание транскрипционных фенотипов, что говорит о функциональном родстве RimO и YcaO. Белок YcaO связывается с малой субчастицей и, возможно, выполняет функцию шаперона, облегчая образование фермент-субстратного комплекса [57].
Следует упомянуть, что после метилтиолирования остатка аспарагиновой кислоты появляется новый хиральный центр (Р-атом углерода), но его конфигурация до сих пор не установлена.
Белок S12 состоит из глобулярного домена, расположенного рядом с А-участком в декодирующем
Cys
Cys Fe/.S -Fe
S;
I /4^Fe
Fe --S
Рис. 9. Кластер [4Fe-4S], координированный остатками ци-стеина, в структуре RimO [56].
Cys
е
центре, и длинного стержнеобразного отростка, который закрепляет белок на малой субчастице. S12 -единственный белок, находящийся на поверхности соприкосновения большой и малой субчастиц. Модифицированный остаток располагается вблизи декодирующего центра, но не образует прямых контактов ни с мРНК, ни с тРНК. Он погружен в карман, образованный двумя петлями: первая формируется из нуклеотидов 522-528 16S рРНК, вторая - из аминокислотных остатков 44-51 самого S12.
Функция модификации S12 до сих пор не выяснена. Известно, что мутации в соседних остатках (Lys87, Ley89, Рго90, Gly91 и А^93) приводят к появлению устойчивости к стрептомицину или зависимости от него [53]. Также известно, что белок S12 принимает участие в самопроизвольной транслокации рибосомы (не зависящей от EF-G и GTP), а мутация в соседнем 87-м аминокислотном остатке нарушает эту функцию [59]. Тем не менее, в случае мутации в гене птО упомянутые фенотипические изменения отсутствуют. Единственное отличие такого мутанта от штамма дикого типа - немного сниженная скорость роста [53].
МОДИФИКАЦИЯ БЕЛКА 56
Рибосомный белок S6 имеет уникальную разновидность посттрансляционной модификации. На его С-конце располагаются от двух до шести остатков глутаминовой кислоты (...ADDAEAGDSEE(E)0_4) [60, 61]. Из них в гене (rpsF) закодированы только первые два (...ADDAEAGDSEE) [62], остальные добавляются посттрансляционно. Модификация происходит ступенчато, остатки глутаминовой кислоты добавляются по одной [63].
Получен мутантный штамм, в котором не наблюдается гетерогенности С-конца белка S6 и содержатся только два остатка глутаминовой кислоты. С помо-
щью этого штамма обнаружен ген птК, отвечающий за эту модификацию [64]. Этот ген кодирует фермент с молекулярной массой 31.5 кДа, который узнает белок S6 и добавляет дополнительные остатки на его С-конец. В случае мутации в гене rpsF, приводящей к замене предпоследнего остатка глутаминовой кислоты на лизин, посттрансляционной модификации белка S6 не наблюдается [64]. Это означает, что ШтК узнает С-концевой участок белка S6 дикого типа. В некоторых мутантных штаммах ШтК добавляет к S6 больше четырех остатков глутаминовой кислоты, однако причины этого не выяснены [65].
Установлено, что в условиях, когда не происходит сборка рибосомы (в облученных ультрафиолетом клетках), S6 не подвергается модификации [66]. Био-информатическими методами в ШтК найден РНК-связывающий мотив [67]. Эти данные могут указывать на то, что модификация происходит во время или после встраивания белка S6 в рибосому.
Белок S6 располагается в центральном домене малой субчастицы рибосомы. Взаимодействуя с белками S18, S8 и S15, он предохраняет 16S рРНК от атаки эндонуклеаз. С-Концевые аминокислотные остатки S6 выступают наружу и не видны в кристаллической структуре.
S6 - самый кислый белок 30S субчастицы (р! = 4.8), а наблюдаемая посттрансляционная модификация делает его кислотность еще более высокой. Функция этой модификации не выяснена, однако это первый известный случай посттрансляционного добавления аминокислотных остатков. •
Работа поддержана Российским фондом фундаментальных исследований (грант 10-04-01345-а), Федеральной программой «Кадры» НК29П П800, грантом HFSP RGY 0088/2008, Программой Московского университета ПНР 5.13.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Arnold R.J., Reilly J.P. // Anal. Biochem. 1999. V. 269. P. 105-112.
2. Ben-Bassat A., Bauer K., Chang S.Y., Myambo K., Boosman A., Chang S. // J. Bacteriol. 1987. V. 169. P. 751-757.
3. Chang F.N., Budzilowicz C. // J. Bacteriol. 1977. V. 131.
P. 105-110.
4. Brosius J. // Biochemistry. 1977. V. 17. P. 501-508.
5. Eistetter A.J., Butler PD., Traut R.R., Fanning T.G. // FEMS Microbiol. Lett. 1999. V. 180. P. 345-349.
6. Makarova K.S., Ponomarev V.A., Koonin E.V. // Genome Biol. 2001. V. 2. Research 0033.
7. Gabriel S.E., Helmann J.D. // J. Bacteriol. 2009. V. 191.
P. 6116-6122.
8. Polevoda B., Sherman F. // Mol. Microbiol. 2007. V. 65.
P. 590-606.
9. Chang C.N., Chang N. // Biochemistry. 1975. V. 14. P. 468-477.
10. Dognin M.J., Wittmann-Liebold B. // Eur. J. Biochem. 1980.
V. 112. P 131-151.
11. Chang F.N., Cohen L.B., Navickas I.J., Chang C.N. // Biochemistry. 1975. V. 14. P. 4994-4998.
12. Colson C., Lhoest J., Urlings C. // Mol. Gen. Genet. 1979.
V. 169. P. 245-250.
13. Demirci H., Gregory S.T., Dahlberg A.E., Jogl G. // EMBO J.
2007. V. 26. P. 567-577.
14. Demirci H., Gregory S.T., Dahlberg A.E., Jogl G. // Structure.
2008. V. 16. P 1059-1066.
15. Agrawal R.K., Linde J., Sengupta J., Nierhaus K.H., Frank J. // J. Mol. Biol. 2001. V. 311. P 777-787.
16. Cameron D.M., Thompson J., March PE., Dahlberg A.E. // J. Mol. Biol. 2002. V. 319. P. 27-35.
17. Valle M., Zavialov A., Li W., Stagg S.M., Sengupta J., Nielsen R.C., Nissen P., Harvey S.C., Ehrenberg M., Frank J. // Nat. Struct. Biol. 2003. V. 10. P. 899-906.
18. Vanet A., Plumbridge J.A., Guerin M.F., Alix J.H. // Mol. Microbiol. 1994. V. 14. P. 947-958.
19. Colson C., Smith H.O. // Mol. Gen. Genet. 1977. V. 154.
P. 167-173.
20. Lhoest J., Colson C. // Mol. Gen. Genet. 1977. V. 154. P. 175180.
21. Muranova T.A., Muranov A.V., Markova L.F., Ovchinnikov Y.A. // FEBS Lett. 1978. V. 96. P. 301-305.
22. Lhoest J., Colson C. // Eur. J. Biochem. 1981. V. 121. P. 33-37.
23. Heurgue-Hamard V., Champ S., Engstrom A., Ehrenberg M., Buckingham R.H. // EMBO J. 2002. V. 21. P. 769-778.
24. Kaczanowska M., Ryden-Aulin M. // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2007. V. 71. P. 477-494.
25. Chen R., Chen-Schmeisser U. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1977. V. 74. P. 4905-4908.
26. David C.L., Keener J., Aswad D.W. // J. Bacteriol. 1999. V. 181. P. 2872-2877.
27. Chang F.N. // J. Bacteriol. 1978. V. 135. P. 1165-1166.
28. Gudkov A.T. // FEBS Lett. 1997. V. 407. P. 253-256.
29. Brosius J., Chen R. // FEBS Lett. 1976. V. 68. P. 105-109.
30. Chang C.N., Schwartz M., Chang F.N. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1976. V. 73. P. 233-239.
31. Polevoda B., Sherman F. // Genome Biol. 2002. V. 3. Review
0006.
32. Vetting M.W., Bareich D.C., Yu M., Blanchard J.S. // Protein. Sci. 2008. V. 17. P. 1781-1790.
33. Miao L., Fang H., Li Y., Chen H. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2007. V. 357. P. 641-647.
34. Wittmann-Liebold B., Greuer B. // FEBS Lett. 1978. V. 95.
P. 91-98.
35. Janda I., Kitakawa M., Isono K. // Mol. Gen. Genet. 1985.
V. 201. P. 433-436.
36. Yoshikawa A., Isono S., Sheback A., Isono K. // Mol. Gen. Genet. 1987. V. 209. P. 481-488.
37. Poot R.A., Jeeninga R.E., Pleij C.W., van Duin J. // FEBS Lett. 1997. V. 401. P. 175-179.
38. Cumberlidge A.G., Isono K. // J. Mol. Biol. 1979. V. 131.
P. 169-189.
39. Roy-Chaudhuri B., Kirthi N., Kelley T., Culver G.M. // Mol. Microbiol. 2008. V. 68. P. 1547-1559.
40. White-Ziegler C.A., Black A.M., Eliades S.H., Young S., Porter K. // J. Bacteriol. 2002. V. 184. P. 4334-4342.
41. Yaguchi M. // FEBS Lett. 1975. V. 59. P. 217-220.
42. Isono K., Isono S. // Mol. Gen. Genet. 1980. V. 177. P. 645-651.
43. Recht M.I., Williamson J.R. // J. Mol. Biol. 2001. V. 313.
P. 35-48.
44. Terhorst C., Moller W., Laursen R., Wittmann-Liebold B. // Eur. J. Biochem. 1973. V. 34. P. 138-152.
45. Tanaka S., Matsushita Y., Yoshikawa A., Isono K. // Mol.
Gen. Genet. 1989. V. 217. P. 289-293.
46. Isono S., Isono K. // Mol. Gen. Genet. 1981. V. 183. P. 473-477.
47. Ramagopal S., Subramanian A.R. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1974. V. 71. P. 2136-2140.
48. Gordiyenko Y., Deroo S., Zhou M., Videler H., Robinson C.V. // J. Mol. Biol. 2008. V. 380. P. 404-414.
49. Vetting M.W., de Carvalho L.P., Roderick S.L., Blanchard J.S. // J. Biol. Chem. 2005. V. 280. P. 22108-22114.
50. Funatsu G., Yaguchi M., Wittmann-Liebold B. // FEBS Lett. 1977. V. 73. P. 12-17.
51. Post L.E., Nomura M. // J. Biol. Chem. 1980. V. 255. P. 46604666.
52. Kowalak J.A., Walsh K.A. // Protein. Sci. 1996. V. 5. P. 16251632.
53. Anton B.P., Saleh L., Benner J.S., Raleigh E.A., Kasif
5., Roberts R.J. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2008. V. 105.
P. 1826-1831.
54. Booker S.J., Cicchillo R.M., Grove T.L. // Curr. Opin. Chem. Biol. 2007. V. 11. P. 543-552.
55. Fontecave M., Mulliez E., Atta M. // Chem. Biol. 2008. V. 15.
P. 209-210.
56. Lee K.H., Saleh L., Anton B.P., Madinger C.L., Benner J.S., Iwig D.F., Roberts R.J., Krebs C., Booker S.J. // Biochemistry.
2009. V. 48. P. 10162-10174.
57. Strader M.B., Costantino N., Elkins C.A., Chen C.Y., Patel
1., Makusky A.J., Choy J.S., Court D.L., Markey S.P., Kowalak J.A. // Mol. Cell. Proteomics. 2011. V. 10. M110.005199.
58. Arragain S., Garcia-Serres R., Blondin G., Douki T., Clemancey M., Latour J.M., Forouhar F., Neely H., Montelione G.T., Hunt J.F., et al.// J. Biol. Chem. 2010. V. 285. № 8. P. 57925801.
59. Asatryan L.S., Spirin A.S. // Mol. Gen. Genet. 1975. V. 138.
P. 315-321.
60. Hitz H., Schafer D., Wittmann-Liebold B. // FEBS Lett. 1975. V. 56. P. 259-262.
61. Hitz H., Schafer D., Wittmann-Liebold B. // Eur. J. Biochem. 1977. V. 75. P. 497-512.
62. Schnier J., Kitakawa M., Isono K. // Mol. Gen. Genet. 1986.
V. 204. P. 126-132.
63. Reeh S., Pedersen S. // Mol. Gen. Genet. 1979. V. 173.
P. 183-187.
64. Kang W.K., Icho T., Isono S., Kitakawa M., Isono K. // Mol. Gen. Genet. 1989. V. 217. P. 281-288.
65. Kade B., Dabbs E.R., Wittmann-Liebold B. // FEBS Lett. 1980. V. 121. P. 313-316.
66. Kitakawa M., Blumenthal L., Isono K. // Mol. Gen. Genet. 1980. V. 180. P. 343-349.
67. Koonin E.V., Bork P., Sander C. // Nucl. Acids Res. 1994. V. 22. P. 2166-2167.
