CC BY
45
УДК 579.835: 577.114: 612
ГЛИКОПОЛИМЕРЫ БАКТЕРИЙ РОДА AZOSPIRILLUM КАК ПЕРСПЕКТИВНЫЕ АНТАГОНИСТЫ КЛАССИЧЕСКИХ ЭНДОДОКСИНОВ
А. К. Суркина1, С. А. Коннова12, Ю. П. Федоненко1, В. В. Игнатов1
1Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН E-mail: [email protected] 2Саратовский государственный университет E-mail: [email protected]
Проведено сравнительное исследование агонистических и антагонистических свойств, а также токсичности гликополимеров бактерий рода Azospirillum. Впервые для азоспирилл показано, что их гликаны обладают антагонистическими свойствами в отношении классических эндотоксинов. Установлено, что существенный вклад в реализацию этой активности вносят отдельные жирные кислоты в составе липидов А. Показано влияние конформации исследованных гликанов на их летальную токсичность и ингибирующее действие в отношении эндотоксина Escherichia coli O55:B5. Среди изученных препаратов наивысшую антагонистическую активность проявлял липополисахарид бактерий A. lipoferum Sp59b.
Ключевые слова: Azospirillum, гликополимер, фактор некроза опухоли альфа, летальная токсичность, антагонизм.
Glycopolymers from Bacteria of the Genus Azospirillum as Promising Antagonists of Classic Endotoxins
A. K. Surkina, S. A. Konnova, Y. P. Fedonenko, V. V. Ignatov
Comparison studies were made on the agonistic and antagonistic properties and on the toxicity of glycopolymers from bacteria of the genus Azospirillum. For the first time, it was shown that Azospirillum glycans act as antagonists of classic endotoxins. It was observed that certain fatty acids in the lipid A portions of these molecules contributed to the realization of their biological activity. The role of the conformation of the investigated glycans in their lethal toxicity and inhibitory effect on Escherichia coliO55:B5 endotoxin was shown. The lipopolysaccharide of A. lipoferum Sp59b had the highest antagonistic activity among the investigated polymers. Key words: Azospirillum, glycopolymers, tumor necrosis factor alpha, lethal toxicity, antagonism.
Введение
В настоящее время система врожденного иммунитета рассматривается как первая линия защиты от микробных инфекций, которая быстро реагирует на характерные для патогенов высококонсервативные структуры, патоген-ассо-циированные молекулярные паттерны (pathogen-associated molecular patterns - PAMP) [1]. К PAMP относятся липополисахариды (ЛПС) и капсуль-
ные полисахариды (КПС) грамотрицательных бактерий. Данные биополимеры способны запускать механизмы неспецифической защиты макроорганизма, связываясь с толл-подобным рецептором 4 (TLR4), который относится к семейству толл-подобных рецепторов (Toll-like receptors - TLRs) и экспрессируется на клеточной поверхности лейкоцитов [1, 2]. Однако TLR4 не способен вступать в непосредственное взаимодействие с эндотоксином, являясь молекулярной структурой, которая только передает сигнал возбуждения компонентам внутриклеточных сигнальных путей. Взаимодействие бактериальных гликополимеров с мембранными рецепторами моноцитов, макрофагов и нейтрофилов представляет собой сложный многоступенчатый процесс с вовлечением белков-посредников и образованием промежуточных молекулярных комплексов.
ЛПС являются амфипатическими молекулами, которые легко образуют мицеллярные агрегаты. Эти агрегаты очень слабо взаимодействуют с лейкоцитами и поэтому не способны вызвать выраженный клеточный ответ. Транспорт бактериальных гликополимеров от мицеллярных агрегатов к мембранам осуществляется с помощью вырабатывающегося в печени белка острой фазы, связывающего ЛПС (LBP - LPS-binding protein). LBP транспортирует ЛПС к секреторному или мембраносвязанному CD14, образуя комплекс ЛПС/CDM, который, в свою очередь, взаимодействует с белком MD-2. Взаимодействие комплекса ЛПС/CD14/MD-2 с эктодоменом TLR4 сопровождается его конформационными изменениями и запускает сигнальный каскад возбуждения. Эта активация приводит к экспрессии сотен генов, в результате чего синтезируется множество цитокинов и хемокинов, включая фактор некроза опухоли альфа (ФНО-а), ответственный за развитие острой воспалительной реакции [3, 4].
Развитие острого воспалительного ответа необходимо для локализации и уничтожения проникших патогенов и запуска механизмов, обеспечивающих активацию и регуляцию факторов специфической защиты макроорганизма. Однако избыточная активация данной реакции может привести к клиническим симптомам септического шока - одной из самых сложных проблем теоретической и практической медицины. Согласно данным мировой статистики, это осложнение по-прежнему является одной из ведущих причин летальности при острой хирургической патологии и гнойно-воспалительных инфекциях человека. Частота встречаемости сепсиса среди стационарных больных составляет 1%, а среди пациентов в различных отделениях реанимации и интенсивной терапии - 20-30%. Число заболеваний, осложненных сепсисом, возросло, а уровень смертности в течение последних 40 лет остался очень высоким: 25-35% для пациентов с сепсисом и 60-80% для пациентов с септическим шоком [5].
Одной из стратегий предотвращения подобных состояний является использование антагонистов эндотоксинов, ограничивающих токсичность или цитокинстимулирующую активность последних. Потенциальными кандидатами на роль антагонистов являются сами ЛПС, которые, прежде всего, нетоксичны или слаботоксичны в отношении макроорганизма, а также не вызывают неконтролируемый синтез лейкоцитами провоспалительных цитокинов. Известно, что ЛПС, обладающие высокой антагонистической активностью по отношению к эндотоксинам, часто встречаются у бактерий, филогенетически удаленных от семейства Enterobacteriaceae, основных возбудителей инфекций среди грамотри-цательных бактерий. Ранее нами показано, что ЛПС диазотрофных бактерий рода Azospirillum проявляют широкий спектр биологического действия в отношении эукариотических клеток [6]. В работе Komaniecka et al. показана низкая эндотоксическая активность ЛПС из A. lipoferum SpBr17 [7]. Однако исследования данных гликополимеров как потенциальных антагонистов ЛПС патогенных бактерий до настоящего времени не проводились. Поэтому целью нашей работы было сравнительное изучение токсичности и способности ЛПС азотфиксирующих микроорганизмов рода Azospirillum предотвращать вызванную ЛПС Escherichia coli O55:B5 (ЛПСе coii) индукцию синтеза ФНО-а мононуклеарами периферической крови человека.
Материалы и методы
В работе были исследованы ЛПС A. lipoferum Sp59b (ЛПС8р59Ь), ЛПС A. irakense KBC1 (ЛПСКВС1) и КА3 (ЛПСКАЗ), ЛПБК A. irakense KBC1 (ЛПБКкВС1) и его свободное от белка производное (ЛПБККВС1 ПрК), а также ЛПСЕ coli клинического штамма E. coli O55:B5 (Sigma). Все препараты использовались в концентрации 1 мкг/мл.
Анализ жирных кислот (ЖК), входящих в состав липида А исследуемых препаратов, проводили методом ГЖХ на хроматографе GC-2010 (Shimadzu, Япония) с капиллярной колонкой HP-5. Метилирование проводили по методу, описанному в работе Mayer [8].
Для избавления от белка к 0,5% раствору препарата ЛПБКквс1 в дистиллированной воде добавляли раствор протеиназы К (Sigma, 15 ед/мг), до конечной концентрации 100 мкг/мл. Реакционную смесь инкубировали 4 ч при 37 °С, 1 ч при 60 °С, затем центрифугировали 30 мин при 5 тыс. об/мин. Супернатант, содержащий ЛПБКквс1 ПрК, собирали, диализовали против дистиллированной воды в течение суток и лио-фильно высушивали.
Размер мицелл ЛПБК^с! и его модифицированного производного определяли в водном растворе при 25 °С на дзета-сайзере (Malvern, Великобритания).
Острую токсичность определяли экспресс-методом на белых нелинейных мышах, предварительно сенсибилизированных 3,2% D-галак-тозамингидрохлоридом, при однократном внутри-брюшинном введении гликополимеров. Наблюдение за животными проводили на протяжении 48 ч [9].
Мононуклеары выделяли из периферической крови условно здоровых доноров-добровольцев в градиенте плотности фиккол-урографин (1,077 г/л) стандартным методом [10]. Далее моноциты инкубировали с исследуемыми препаратами в среде 199 с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки в течение 24 ч при 37 °С. Для изучения антагонистических свойств за 2 ч до добавления ЛПСе соИ мононуклеарные клетки стимулировали исследуемыми препаратами. Также осуществляли совместную инкубацию гликополимеров бактерий Azospirillum и ЛПСе coii в соотношении 1:1. ФНО-а определяли в среде культивирования моноцитов с препаратами им-муноферментным методом с тест-системами на основе моноклональных антител производства
ЗАО «Вектор-Бест» (г. Новосибирск). Результаты эксперимента подвергали статистической обработке.
Результаты и их обсуждение
Как было сказано выше, гликополимеры, претендующие на роль антагонистов классических эндотоксинов, прежде всего, должны быть малотоксичными для человека и животных. В связи с этим мы определяли острую токсичность выбранных препаратов ЛПС азоспирилл на белых беспородных мышах (табл. 1).
Таблица 1
Определение острой токсичности исследуемых гликополимеров бактерий рода Azospirillum
Препарат (LD5o), мкг/мышь
ЛПС8р59Ь 8,9±1,1*
ЛПСКАЗ 5,5±0,5
ЛПСКВС1 4,5±0,5*
ЛПБККВС1 148,0±3,0
ЛПБККВС1 ПрК 340,0±11,2
Примечание. * - данные из работы [6].
LD50, рассчитанные для ЛПСКВС1, ЛПСкдз и ЛПС8р59Ь, были примерно одинаковы (59 мкг/мышь), что значительно (около 30 раз) превышало LD50 ЛПСЕ ^ (0.14 мкг/мышь).
Известно, что многие грамотрицательные микроорганизмы способны образовывать вокруг клеточной оболочки капсулу, в состав которой входят капсульные полисахариды, или синте-
зировать внеклеточные полисахариды - экзо-гликаны, играющие важную роль в инициации иммунологического ответа макроорганизма. Так, благодаря высокому отрицательному заряду, обусловленному КПС, энтеропатогенные бактерии обладают мощным разрушающим действием на комплимент и фагоциты. Кроме того, действие данных биополимеров усиливается энтеротоксинами белковой природы [11]. Ранее нами выделен и охарактеризован по химическому составу ЛПБК из капсульного материала A. irakense КВС1. Выяснено, что ЛПБК в капсуле является экстраклеточной формой ЛПС, и изолированный из него полисахарид идентичен О-специфическому полисахариду (ОПС) из ЛПСКВС1 и построен из разветвленных гексасахаридных повторяющихся звеньев, содержащих остатки D-галактозы, L-рамнозы и D-маннозы [12]. С целью установления вклада белковой составляющей в реализацию иммуностимулирующей активности гликополимера капсулы азоспирилл ЛПБКквс1 обрабатывали протеиназой К, после чего оценивали его имму-номодулирующий эффект.
Установлено, что ЛПБКквс1 был приблизительно в 33 раза менее токсичен (148 мкг/мышь) по сравнению с ЛПСквс1 Протеиназная обработка гликополимера капсулы привела к еще большему снижению токсичности относительно ЛПС того же штамма (340 мкг/мл).
Показано, что цитокининдуцирующая актив-
ность ЛПС ЛПБККВС1
абсолютно идентична таковой (рис. 1). Концентрация ФНО-а в
КВС1
140
120
100
80
5 60
5 40
20
контроль ЛПС КВС1 ЛПБК КВС1 ЛПБК КВС1 ЛПС КА3 ЛПС вр59Ь
ПрК
Рис. 1. Синтез ФНО-а человеческими мононуклеарами при добавлении исследуемых
препаратов
0
среде инкубирования при добавлении данных препаратов достигала 51 пг/мл. Стимулирующий эффект ЛПБККВС1 ПрК был слабее, к 24 ч содержание цитокина в супернатантах составило 40 пг/мл, что в 2 раза выше по сравнению с контролем (20 пг/мл). ЛПСказ индуцировал синтез ФНО-а мононуклеарами человека до 80 пг/мл. Среди исследованных гликополимеров азоспи-рилл наибольшим стимулирующим эффектом обладал ЛПС8р59Ь (115 пг/мл). Тем не менее, его цитокининдуцирующая активность была ниже почти в 3 раза в сравнении с действием ЛПСЕ соИ (300 пг/мл).
Согласно литературным данным, проявляемая эндотоксином биологическая активность зависит от особенностей его структуры и, прежде всего, от строения липидной составляющей данной молекулы [13]. В связи с этим нами был проведен анализ профилей ЖК исследуемых гликанов.
Методом ГЖХ после метанолиза в составе липидов А ЛПС и ЛПБК были идентифицированы предельные, непредельные алкановые и гидроксиалкановые кислоты с длиной цепи от С^ до С^ (табл. 2). Установлено, что состав и соотношение ЖК в гликополимерах А. ¡такете были практически идентичны, за исключением отсутствия в ЛПСКВС1 гексадекановой кислоты и наличия в ЛПБКквс1 2-гидрокситетрадекано-вой (8%) и октадеценовой (11%) кислот. Во всех исследованных препаратах штаммов А. ¡такете доминирующими по содержанию были доде-кановая (9-12%), 3-гидрокситетрадекановая (43-61%) и 3-гидроксигексадекановая (13-24%)
кислоты. Профиль ЖК ЛПС§р59Ь отличался как по качественному, так и по количественному содержанию от состава ЖК вышеуказанных препаратов. В липиде А ЛПС8р59Ь превалирующими были додекановая (21%) и 3-гидроксидодека-новая (31%) кислоты. Также в данном гликане приблизительно в равном количестве (8-13%) идентифицированы 2-гидроксидодекановая, 3-гидрокситетрадекановая, гексадекановая и октадеценовая жирные кислоты. Показанные вариации в структуре липидной компоненты исследуемых препаратов сделали их удобной моделью для изучения их структурно-функциональных свойств и установления вклада отдельных ЖК в реализацию гликополимерами азоспирилла биологической активности.
Известно, что для липида А классического эндотоксина ЛПС E. coli характерны жирные кислоты с 14 и 12 углеродными атомами, при этом преобладающей по содержанию является 3-OH-Cj4.0. Любое отклонение в сторону увеличения или уменьшения длины цепей ЖК, а также степени ацилирования липидного домена ЛПС приводит к значительному изменению его эндотоксической активности [13]. В гликополимерах штамма A. irakense, как и в ЛПС E. coli, обнаружена C^.q, а превалирующей по содержанию является 3-ОН-См.0. Однако присутствие в ЛПСКВС1, ЛПСказ и ЛПБКкдз жирных кислот с 16 и 18 углеродными атомами, вероятно, стало причиной снижения токсичности и цито-кининдуцирующей активности по сравнению с ЛПС
^E. coli'
Таблица 2
Соотношение жирных кислот в исследуемых препаратах гликополимеров бактерий рода Azospirillum
Жирные кислоты Содержание МЭЖК, % от суммы площадей всех пиков
ЛПС8р59Ь* ЛПСКАЗ ЛПСкво ЛПБККВС1
Додекановая (С^.д) 21,5±3,4 11,7±2,9 10,2±1,7 9,0±1,3
2-Гидроксидодекановая (2-OH-Ci2.0) 11,1±1,2 - - -
3-Гидроксидодекановая (З-ОН-С^.д) 31,9±0,7 - - -
2-Гидрокситетрадекановая (2-OH-C^.q) - - - 8,1±0,1
З-Гидрокситетрадекановая (З-ОН-С^.д) 11,5±2,5 68,9±2,0 61,4±2,4 42,5±0,3
Гексадекановая (С^.д) 12,8±0,4 6,9±0,9 - 5,6±0,2
З-Гидроксигексадекановая (3-OH-Ci6.0) - 12,6±2,2 28,5±2,0 23,7±0,1
Октадеценовая (Ci8_i) 8,4±2,2 - - 11,2±0,9
Примечание. «-» - ЖК отсутствовали; * - данные из работы [14].
Гликополимеры исследованных штаммов A. irakense характеризовались наличием идентичных ОПС и незначительными отличиями в составе и соотношении ЖК их липидов А. ЛПСквс1 и ЛПСказ реализовывали одинаковую токсичность в отношении теплокровных животных, однако ЛПСказ в 1,6 раза сильнее индуцировал синтез ФНО-а человеческими моно-нуклеарами. Данный результат свидетельствует о том, что присутствие в липиде А С^-о не оказывает влияние на токсичность, но, возможно, вносит вклад в агонистические свойства данного гликополимера. Рассчитанная для ЛПБК^с! LD5о была намного выше, по сравнению с LD5о, уста-новлеными для ЛПС A. irakense. Удаление белковой составляющей из ЛПБК^с! не приводило к восстановлению токсичных свойств до уровня ЛПСквс1 и ЛПСказ, но в то же время не оказывало существенного влияния на цитокинстимули-рующую активность производного, по сравнению с ЛПС того же штамма. Данный факт позволил выдвинуть предложение, что идентифицируемые в ЛПБКквс1 2-ОН-с140 и с18-1, вероятнее всего, определяют крайне низкую токсичность данного гликана, но не вносят существенных изменений в его цитокинстимулирующие свойства.
Неожиданным оказался факт снижения токсичности после обработки исследуемого ЛПБК протеиназой К. Возможно, что наблюдаемый эффект связан с изменением после протеиназной обработки специфической конформации молекулы ЛПБК и, как следствие, с интенсификацией мицеллообразования, затрудняющего взаимодействие ЛПБКкВС1 Прк с рецепторами клеточной поверхности моноцитов. Для подтверждения данной теории был проведен эксперимент по определению размера мицелл ЛПБК и его модифицированного производного. Полученные результаты свидетельствуют об уменьшении среднего диаметра мицелл с 104 до 79 нм и снижении гетерогенности частиц по размеру после модификации. Данный факт подтверждает наличие изменений в конформации молекулы ЛПБК, что, возможно, послужило причиной снижения токсичности препарата (увеличения в 2 раза LD5о ).
Различное влияние протеиназной обработки
на биологическую активность ЛПБК
компоненты из ЛПБК^С! приводило к снижению продукции N0 в 2 раза по сравнению с нативным препаратом [12]. Значительная стимуляция синтеза N0 может отражать развитие токсигенной реакции макроорганизма на эндотоксин, что может служить объяснением наблюдаемой корреляции между результатами по индукции N0 и значениями LD5о для ЛПБК^С! и
ЛПБККВС1 ПрК.
Сравнительное изучение способности стимулировать продукцию ФНО-а мононуклеар-ными клетками препарата ЛПС8р59Ь показало, что он является более сильным индуктором по сравнению с гликополимерами бактерий A. kense. Полученный результат был предсказуем, учитывая кардинальные отличия в профилях ЖК указанных гликанов. Кроме того, для ЛПС и ЛПБК представителей A. irakense было отмечено низкое содержание фосфора (0,3-0,5%) в отличие от ЛПС8р59Ь, содержание фосфора в котором достигает почти 3%. Согласно данным литературы, эндотоксическая активность зависит не только от состава и соотношения ЖК, но и от степени фосфорилирования ЛПС. Так, замена двух фосфатных групп на остатки галактозамина в липиде А Aquifex pyrophilus предположительно является одним из структурных факторов, определяющих низкую способность ЛПС этой бактерии активировать моноциты человека [15]. Химическая модификация ЛПС с помощью де-фосфорилирования плавиковой кислотой также приводит к существенному снижению его биологической активности [16].
Полученные результаты свидетельствовали о слабой токсичности и умеренной провоспали-тельной активности гликополимеров бактерий рода AzospirШum, что явилось предпосылкой для исследования антагонистических свойств данных препаратов.
Преинкубация мононуклеарных клеток с исследуемыми гликанами значительно снижала стимулируемую классическим эндотоксином продукцию ФНО-а (рис. 2). Следует отметить, что цитокинингибирующая активность ЛПСказ, ЛПСквс1 и ЛПБККВС1 ПрК была примерно на одном уровне (~60 пг/мл), а наибольшим ин-гибирующим эффектом обладали ЛПС8р59Ь и
КВС1
и in vitro можно объяснить тем, что ЛПС [6] и ЛПБК A. irakense КВС1 являются активными индукторами синтеза оксида азота в спленоци-тах мышей. Установлено, что удаление белковой
in vivo ЛПБКкВС1 (40 и 45 пг/мл соответственно). Ранее при исследовании динамики синтеза ФНО-а в процессе фагоцитоза E.coli Ca 53 нами показано, что содержание цитокина в культуральной среде в присутствии ЛПС некоторых штаммов
азоспирилл (в том числе и ЛПСквс1) возрастает уже к 2 ч инкубации. А ЛПС, выделенный из A. bтasilense Бр245,в концентрации 1 мкг/мл стимулировал синтез цитокина мононуклеарами периферической крови человека до 65 пг/мл уже к 1 ч процесса фагоцитоза [17]. Данный факт в совокупности с результатами эксперимента свидетельствуют о том, что гликаны бактерий рода AzospiriПum способны в короткие сроки эффективно связываться с рецепторами клеточ-
ной поверхности мононуклеаров, что, в свою очередь, препятствует взаимодействию ЛПСЕ ^ с клетками-мишенями и чрезмерной продукции ФНО-а. Однако простая маскировка рецепторно-го аппарата от эндотоксина-индуктора не является основным механизмом антагонистической активности биогликанов азоспирилл, что подтверждается в эксперименте по одновременной стимуляции исследуемых препаратов и ЛПСЕ соИ в соотношении 1:1 в культуре моноцитов.
350 300
ц s
1 250 О"
е 200
га 150 а
I-
х
ф
■I 100
х
о
50
300
163
120
116
57
20 20 M
■Фг
45
Й
138_
ЛПС E. coli контроль ЛПС КВС1 ЛПБК КВС1 ЛПБК КВС1 ЛПС КА3 ЛПС Sp59b (без ЛПС) ПрК
В преинкубация мононуклеаров с антагонистом с последующим добавлением ЛПС E.col □ совместное действие ЛПС E. coli и антагониста на мононуклеары
Рис. 2. Цитокинингибирующая активность гликополимеров бактерий рода Azospirillum в отношении
ЛПС E. coli O55:B5
Установлено, что гликополимеры азоспирилл при совместной инкубации с ЛПСЕ coli в среде культивирования мононуклеаров проявляли антагонистические свойства в отношении данного эндотоксина. При этом ЛПСКВС1 и ЛПБККВС1, как и в эксперименте по стимуляции синтеза ФНО-а, обладали идентичной активностью, а ингибирующий потенциал ЛПСказ был несколько ниже данных препаратов, что также коррелирует с его более высокой агони-стической активностью. Способность подавлять индуцированную ЛПСЕ coli продукцию цитоки-на при совместной инкубации увеличивалась
ЛПС
КАЗ
ЛПС
КВС
в ряду ЛПБККВС1 ПрК ЛПБКквс1^ЛПС§р59Ь. Наиболее слабым ингибитором ЛПСЕ шИ оказался ЛПБККВС1 ПрК, хотя в эксперименте по преинкубации он оказался одним из сильнейших антагонистов, что, однако,
можно объяснить его низкой цитокининдуцирую-щей способностью. При сохранении способности взаимодействовать с моноцитами и синтезировать ФНО-а данный гликополимер значительно уступает остальным препаратам в конкурирующих свойствах за рецепторный аппарат мононуклеаров периферической крови человека. Низкая активность ЛПБКквс! ПрК при совместной инкубации с индуктором может быть обусловлена «сбоем» на любом этапе его взаимодействия с рецепторами макроорганизма, начиная с первого звена - LBP.
Несмотря на наивысшую среди исследованных препаратов степень индукции синтеза цитокина, ЛПС8р59Ь показал самую высокую антагонистическую активность как в эксперименте по преинкубации, так и при совместной инкубации с ЛПСе со1;. Полученный результат не вызывает удивления, учитывая кардинальные
0
отличия в химическои структуре и прежде всего в жирнокислотном составе липидной компоненты ЛПС8р59Ь и гликанов представителей A. irakense. Из данных литературы известно, что липиды А, проявляющие высокий антагонизм по отношению к эндотоксинам, имеют низкую степень фосфорилирования и ацилирования [18]. Однако ЛПС§р59Ь характеризовался относительно высоким содержанием фосфора, в связи с чем проявляемый антагонизм можно объяснить его ЖК профилем. В работе Brandenburg et al. показано, что липид А Rhodobacter capsulatus, содержащий более короткие по сравнению с E. coli ЖК, включая одну непредельную карбоновую кислоту, проявляет антагонистические свойства [14]. В липиде А ЛПС§р59ь идентифицирована одна ненасыщенная кислота, а на долю ЖК с числом углеродных атомов меньше 14 в гидрофобном домене молекулы приходится ~65%. Возможно, подобное строение послужило структурным базисом для проявления гликополимером характерных для него активностей. Интересен тот факт, что концентрация ФНО-а в среде культивирования моноцитов при стимуляции ЛПС8р59ь за 2 ч до внесения ЛПСЕ соИ была в 3 раза ниже по сравнению с результатом, полученным при одиночном инкубировании ЛПС8р59ь с мононуклеар-ными клетками. Вероятно, присутствие ЛПС8р59ь и ЛПСЕ ü в равном соотношении способствует образованию в реакционной среде смешанных мицелл. Благодаря этому снижается доступность для LBP и скорость доставки к рецепторному аппарату клеток-мишеней макроорганизма, в результате чего снижается цитокининдуциру-ющая активность обоих препаратов. Данный факт, возможно, указывает на то, что ЛПС8р59ь осуществляет свою ингибирующую активность в отношении ЛПСЕ соИ не только по механизму конкурентного, но и неспецифического ингиби-рования. Изложенное свидетельствует о том, что на современном этапе изучения отличительных особенностей ЛПС бактерий предпочтение следует отдать методам установления их свойств, которые могут определятся не только химической структурой, но и конформацией молекулы.
Проведенное исследование гликанов представителей A. irakense позволяет сделать вывод о том, что незначительные вариации в их липи-дах А не оказывают существенного влияния на проявление данными биополимерами антагонистической активности. Тем не менее, изменения в конформации молекулы могут привести к значительному снижению ее ингибирующих
свойств, что показано на примере ЛПБКквcl и его модифицированного производного. Наблюдаемая биологическая активность гликанов азо спирилл в отношении ЛПCE coli, вероятно, осуществляется по механизму конкурентного ин-гибирования. Как было сказано выше, активация моноцитов липополисахаридами - это сложный многоступенчатый процесс с образованием промежуточных комплексов и вовлечением множества молекул-посредников. Ингибирование классического эндотоксина гликанами-антаго-нистами может осуществляться на основных этапах распознавания ЛПC клеткой-мишенью: 1) на этапе взаимодействия ЛПC с LBP; 2) при связывании с молекулой CD14; 3) и, наконец, при образовании рецепторного комплекса, способного к проведению сигнала. На каком из этапов реализуется антагонистическая активность исследуемых препаратов, предстоит выяснить в дальнейших исследованиях.
Полученные в ходе выполнения данной работы результаты свидетельствуют об умеренной иммуномодулирующей активности гликополи-меров ризобактерий. Изученные биополимеры безопасны для человека и животных и являются потенциальными антагонистами ЛПCE coli, что может быть применено в медицинской практике для создания на их основе препаратов коррекции иммунного ответа макроорганизма. Наиболее перспективным в данном плане является ЛПCsp59b, показавший низкую токсичность в эксперименте с лабораторными животными и наибольшую ингибирующую активность в отношении классического эндотоксина E. coli O55.B5.
Работа выполнена при поддержке РФФИ (грант 11-04-00533а).
Список литературы
1. Janeway C., Jr., Medzhitov R. Innate immune recognition // Annu. Rev. Immunol. 2002. Vol. 20. P. 197-216.
2. Moresco E., LaVine D., Beutler B. Toll-like receptors // Curr. Biol. 2011. Vol. 21, № 13. P. 488-493.
3. Heumann D., Roger T. Initial responses to endotox-ins and Gram-negative bacteria // Clin. Chim. Acta. 2002. Vol. 323. P. 59-72.
4. Alexander C., RietschelE. Bacterial lipopolysaccharides and innate immunity // J. Endotoxin. 2001. Vol. 7, № 3. P. 167-202.
5. Llewelyn M., Cohen J. Tracking the microbes in sepsis : advancements in treatment bring challenges for microbial epidemiology // Clin. Infect. Dis. 2007. Vol. 44, № 10. P. 1343-1348.
6. Фомина А. А., Петров А. В., Коннова С. А., Бойко А. С., Федоненко Ю. П., Тихомирова Е. И., Сим-бирцев А. С. Особенности строения и биологические
свойства липополисахаридов азоспирилл в отношении активации факторов неспецифической резистентности макроорганизма // Цитокины и воспаление. 2009. Т. 8, № 4. С. 23-27.
7. Komaniecka I., Zdzisinska B., Kandefer-Szerszen M., Choma A. Low endotoxic activity of lypopolysaccha-rides isolated from Bradyrhizobium, Mesorhizobium, and Azospirillum strains // Microbiol. Immunol. 2010. Vol. 54. P. 717-725.
8. Mayer H., Tharanathan R., Weckesser J. Analysis of lipopolysaccharides of gram-negative bacteria // Meth. Microbiol. 1985. Vol. 18. P. 157-207.
9. Прозоровский В. Б., Прозоровская М. П., Демченко В. М. Экспресс-метод определения средней эффективной дозы и ее ошибки // Фармакология и токсикология. 1978. № 4. С. 497-502.
10. Иммунология. Практикум : учеб. пособие / под ред. Л. В. Ковальчука, Г. А. Игнатьевой, Л. В. Ганковской. М. : ГЭОТАР-Медиа, 2010. 176 с.
11. Оводов Ю. С. К-антигены бактерий. Строение К-антигенов бактерий (обзор) // Биохимия. 2006. Т. 71, № 9. С. 1155-1174.
12. Fedonenko Y. P., Burygin G. L., Popova I.A., Sigi-da E. N., Surkina A. K., Zdorovenko E. L., Konnova S. A. Immunochemical Characterization of the Capsular Polysaccharide of Azospirillum irakense KBCl // Curr. Microbiol. 2013. doi: 10.1007/s00284-013-0346-1.
13. Rietschel E., Kirikae T., Schade F., Mamat U., Schmidt G., Loppnow H., Ulmer A., Zähringer U., Seydel U.,
Di Padova F., Schreier M., Brade H. Bacterial endotoxin: molecular relationships of structure to activity and function // FASEB J. 1994. Vol. 8. P. 217-225.
14. Смолькина О. Н., Качала В. В., Федоненко Ю. П., Бурыгин Г. Л., Здоровенко Э. Л., МатораЛ. Ю., Кон-нова С. А., Игнатов В. В. Капсульный полисахарид бактерии Azospirillum lipoferum Sp59b. Структура и антигенная специфичность // Биохимия. 2010. Т. 75, № 5. С. 707-716.
15. Кабанов Д. С., Прохоренко И. Р. Связь между физико-химическими характеристиками и биологической активностью липополисахаридов // Биологические мембраны. 2011. Т. 28, № 5. С. 323-338.
16. Brandenburg K., Andrä J., Müller M., Koch M. H., Garidel P. Physicochemical properties of bacterial gly-copolymers in relation to bioactivity // Carbohydr. Res. 2003. Vol. 338, № 23. P. 2477-2489.
17. Фомина А. А. Влияние бактериальных гликополи-меров на функционально-метаболический статус лейкоцитов и активность ключевых ферментов метаболизма мышей : дис. ... канд. биол. наук. Саратов, 2010. 149 с.
18. Воробьева Е. В., Красикова И. Н., Соловьева Т. Ф. Влияние липополисахаридов и липидов А из некоторых морских бактерий на индукцию спонтанного и индуцированного липополисахаридом из Escherichia coli синтеза ФНО-а клетками периферической крови человека // Биохимия. 2006. Т. 71, № 7. С. 936-944.
УДК 581.9 (470.44)
ВИДОВОЙ СОСТАВ РОДА SALIX L. НА АНТРОПОГЕННЫХ МЕСТООБИТАН1 САРАТОВСКОЙ ОБЛАСТИ
Е. В. Угольникова, М. А. Березуцкий, А. С. Кашин
УНЦ «Ботанический сад» СГУ, Саратов E-mail: [email protected]
Приводятся данные о видовом составе р. Salix L. на антропогенных местообитаниях Саратовской области. Ключевые слова: антропогенные местообитания, Salix.
Species Composition of Salix L. on Anthropogenic Habitats of Saratov Region
E. V. Ugolnikova, M. A. Berezutsky, A. S. Kashin
The information about species composition of Salix L. in anthropogenic
habitats of Saratov region is given.
Key words: the anthropogenic habitats, Salix.
В последние столетия территория Саратовской области подвергалась интенсивному и многофакторному антропогенному воздействию. Одним из важнейших проявлений этого воздействия явля-
ется резкое увеличение площади антропогенных биотопов. К настоящему времени площадь антропогенных биотопов на территории Саратовской области превышает площадь естественных. Только под землями прямого сельскохозяйственного назначения находится 85% её площади. В этих условиях на первый план выходит задача выяснения степени толерантности того или иного вида растений региона к антропогенному воздействию и способности его произрастать на антропогенных местообитаниях. На территории Саратовской области уже начата работа по выявлению степени антропотолерантности отдельных таксонов [1, 2]. Однако в отношении подавляющей части таксонов растений региона такие исследования еще не проведены.
