CC BY
46
УДК 579.835:57.083.334
ИММУНОХИМИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ АНТИГЕННЫХ СВОЙСТВ ПОЧВЕННЫХ РОСТСТИМУЛИРУЮЩИХ БАКТЕРИЙ РОДА AZOSPIRILLUM
ЮА Филипьечева, А.Е. Беляков*, Г.Л. Бурыгин*, С.А. Коннова
Саратовский государственный университет E-mail: [email protected]
* Учреждение Российской академии наук Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН, Саратов E-mail: [email protected]
В статье представлены результаты иммунохимического анализа 63 штаммов ассоциативных ризобактерий рода Azospirillum. Показаны значительная гетерогенность О-антигенов штаммов видов A. lipoferum и A. brasilense, а также высокое сходство антигенных свойств ЛПС штаммов A. irakense. Серологически обособленным оказался штамм A. amazonense. Продемонстрирована высокая консервативность мажорных белковых антигенов данных бактерий.
Ключевые слова: Azospirillum, липополисахариды, серотипиро-вание.
Immunochemical Study of Antigenic Properties of Soil Plant-Growth-Promotion Bacteria of the Genus Azospirillum
Yu.A. Filipecheva, A.E. Belyakov, G.L. Burygin, S.A. Konnova
The results of immunochemical analysis of 63 strains of associative rhizobakteria genus Azospirillum presented in this paper. Significant heterogeneity of O-antigens of strains of A. lipoferum and A. brasilense have been demonstrated, as well as the high similarity of the antigenic properties of LPS strains of A. irakense. Serologically proved isolated strain A. amazonense. High conservatism of major protein antigens of these bacteria have been showed.
Key words: Azospirillum, lipopolysaccharides, serotyping.
Бактерии рода Azospirillum относят к группе ростетимулирующих ризобактерий, которые могут быть перспективными компонентами бактериальных консорциумов -микробных удобрений для инокуляции сельскохозяйственных растений [1]. При этом ряд штаммов азоспирилл могут быть использованы при биоремедиации почвы от загрязнения нефтепродуктами и гербицидами [2]. Азоспириллы обнаруживаются в ризосфере сельскохозяйственных и различных дикорастущих растений, на листьях мангровых растений, а также в почвах тундры [3 -5]. Эго дает основание утверждать, что они являются весьма широко распространенными ассоциативными бактериями, а их поликсенноеть указывает на отсутствие жесткой специфичности к растению-хозяину [6].
На сегодняшний день отсутствует оптимальный специфический метод детекции и мониторинга численности почвенных ризо-сферных бактерий. Одним из методов, используемых при изучении колонизации микроорганизмами растений, является иммуно-химическое выявление. Однако большинство работ, выполняемых с помощью этого метода (по имеющимся литературным сведениям), посвящены изучению взаимодействия растений с фитопатогенами или представителями рода Rhizobium. Очень мало подобных работ, посвященных азотфиксирующим бактериям, вступающим во взаимодействие с небобовыми растениями.
В ИБФРМ РАН были проведены подробное исследование антигенных свойств и хемотипирование азоспирилл, но в основном модельных штаммов. Наша работа направлена на исследование разнообразия поверхностных антигенов азоспирилл коллекционных штаммов с целью построения системы серологической классификации данных бактерий.
В работе были использованы 63 штамма бактерий рода Azospirillum из коллекции ри-зосферных микроорганизмов ИБФРМ РАН, относящихся к 4 видам; A. amazonense, A. brasilense,, A. irakense и A. lipoferum. Бактерии культивировали при 30°С на синтетической малатной среде [7].
Препараты ЛПС (О-Аг) для иммунохи-мических экспериментов получали модифицированным методом экстракции ЭДТА-содер-жащим буфером [8].
Для получения препарата полярного жгутика бактерии выращивали на жидкой малатной среде до логарифмической фазы роста, осаждали центрифугированием и ре-
© ЮА Фтппьечева, А.Е, Беляков, Г.А. Бурыгин, СА. Коннова, 2010
суспендировали в достаточном количестве физиологического раствора. Полученную суспензию гомогенизировали блендером (1200 об/мин) в течение 90 с. Суспензию клеток дважды центрифугировали в течение 15 мин при 3000g. Полученный супернатант подвергали ультрацентрифугированию в течение 1 ч при lOOOOOg.
В работе использовали кроличьи поликлональные антитела (Ат), обладающие О-анти-генной специфичностью, полученные: на обработанные 2%-ным раствором глутарово-го альдегида клетки модельных штаммов A. brasilense [9]: Sp7 (Ат1), Sp245 (Ат2), JM125A2 (АтЗ), А. lipoferum Sp59b (Ат4), A. amazonense Am 14 (Ат8); на хроматографически очищенный липополисахарид (ДПС) штаммов A brasilense S-17(At5) и A. irakense КВС-1 (Атб); Ат, полученные на интактные клетки A. brasilense Sp7 (Ат7), и Ат - на фла-геллин полярного жгутика A. brasilense Sp7 (Ат9).
Иммунодиффузионный анализ осуществляли по стандартной методике в 1%-ном агарозном геле с последующим выявлением преципитата красителем Кумасси синимR-250[ 10].
Твердофазный иммуноферментный анализ (ИФА) выполняли, как описано в статье А.И.Красова с соавт. [11].
Денатурирующий электрофорез в ПААГ [12] с последующим Вестерн-блотом проводили в 10%-ном концентрирующем ПААГ.
Полученные результаты подвергали статистической обработке. Доверительные интервалы определяли для 95% уровня значимости. Эксперименты проводились минимум в трех повторностях.
В результате проведенных экспериментов выявлено, что все 63 исследованных штамма взаимодействовали с родоспецифичными Ат. При этом штаммы видов A. brasilense и A. lipoferum в иммунодиффузии образовывали несколько полос преципитации (исключением являлся штамм A. brasilense KR77) (рис. 1, а), в то время как штаммы видов A. irakense и A. amazonense продемонстрировали образование лишь одной преципи-тационной полосы (рис. 1, б, в).
JMI25A2
JM6B2
Ат 7 ■'1ШЖ
Sp24G
KR77
Рис. 1. Иммунодиффузионный анализ экстрактов клеток штаммов А. ЬгаэЦеме М125А2, Ш6В2, 5Я32, КК77, 8р246 (а); А. макете КВС-1, КА-3 (б); А. атагопеюе Аш14 и А. Нро/егит 8р59Ь (в) с родоспецифичными антителами (Ат7)
Биология
65
При изучении свойств флагеллинов полярного жгутика (Н-антигена) бактерий рода АгояртПыт иммунодиффузионным методом и проведением денатурирующего электрофореза в ПААГ с последующим Вестерн-бло-
том было выявлено, что жгутиковый антиген азоспирилл не является вариабельным и у всех исследованных штаммов он реагирует с Ат на флагеллин полярного жгутика типового штамма A brasilense Sp7 (рис. 2).
Sp245 Sp 107 SR75 SRI 5
SR8
SR64
BR14
SR41
Рис. 2. Результат Вестерн-блота препаратов флагеллииа штаммов Sp245, Sp 107, SR75, SRI5, SR8, SR64, BR14 и SR41 с Ат на флагеллин полярного жгутика A. brasilense Sp7 (Ат9)
Проведенные эксперименты свидетельствуют о высокой консервативности белковых антигенов у всех исследованных штаммов азоспирилл, что подтверждает возможность использования данных Ат для родовой идентификации.
Анализ результатов изучения разнообразия ЛПС (О-антигенов) азоспирилл позволил
разделить на 4 группы штаммы вида A. brasilense и на 3 группы штаммы A. lipoferum (таблица). При этом в каждом из этих видов выявлены штаммы, не имеющие антигенных перекрестов с О-антигенами модельных штаммов, но взаимодействующие с родоспецифичными антителами.
Результаты серотипирования бактерий Л. brasilense и A. lipoferum
Серотип Серовариант Характеристика сероварианта Штаммы, отнесенные к сероварианту .. .
Ат 1 Ат 2 Ат 3 Ат 4 Ат 5 Ат 7
A. brasilense
I А + - - - ++ + SR80, Sp7
В + - - - + SR55
С 4 - - - - + SR14
И D - - - + + SR75, Sp 107, Sp245
Е - + - - + + SR81, S-27
F - ++ - - - + SRI 5
III G - - + - + + JM125A2, JM6B2, Sp246
Н - - + - 4-+ + SR32
I - + - - + KR77, SRI 15
Штаммы, не отнесенные к выделенным серотипам J - - - + + SR7, SR37, SR57, SR88, SR92, SR96, SR100, SRI03, S-17, SR59, SR74, SR120
К - - - - ++ + SR50, SR56, SRI 11, SR87,SR79
L + SR8, SR64, SR72, SR41, BR14
A. lipoferum
I А - + - - - + RG20a
И В - - - + - + SR4, SR38, SR61, SR85, SR98, SR99, Sp59b, SR65, SR62, SR35
С - - - ++ - + SR33
Штаммы, не отнесенные к выделенным серотипам D - - - - + + SR 42, SR 94, SR77
Е - - - - ++ + SR 46, SR 47
F + SR5, SR44, SR54, SRI6
Примечание. «+» - одна полоса преципитации; «++» - две полосы преципитации; «—» - отсутствие взаимодействия.
64 Научный отдел
Полученные данные во многом совпадают с таковыми работы [13], в которой были описаны антигенные свойства ЛПС нескольких штаммов видов A. brasilense и А. Про-ferum. Авторы указанной работы отмечают также высокую консервативность антигенных детерминант, выявляемых Ат к ЛПС A. brasilense S-17 (Ат5), что объясняется участием рамнозы в формировании эпитопов ЛПС азоспирилл. В отличие от препаратов ЛПС [13], ЭДТА-экстракт клеток А. brasilense Sp7 не реагировал с Ат4, что требует дальнейшего изучения.
Два исследованных штамма A, irakense оказались иммунохимически близкими между собой, но отличались от представителей других видов. При этом по результатам и иммунодиффузионного анализа, и ИФА взаимодействие штамма КВС-1 с гомологичными Ат было более интенсивно, нежели для клеток штамма КА-3, что указывает на имеющиеся различия в строении поверхностных антигенов изученных штаммов. Наши данные несколько расходятся с результатами, полученными в работе [13] для ЛГ1С A. irakense КВС-1 и Атб. Возможно, это связано с различиями в экспонированности антигенных детерминант, находящихся в составе ЭДТА-экстракта клеток и в виде очищенного препарата ЛПС.
Серологически обособленным оказался штамм A. amazonense Am 14, выявляемый только гомологичными и родоспецифичными Ат. Следует отметить, что ни один из исследованных штаммов других видов азоспирилл не взаимодействовал с Ат8, что может свидетельствовать об антигенной обособленности данного вида.
Библиографический список
1. Mamopa Л.Ю., Богатырев В.А., Дыкман Л.А., Щеголев С.Ю. Иммунохимическая идентификация азоспирилл и исследование их антигенных структур // Молекулярные основы взаимоотношений ассоциативных микроорганизмов с растениями / Под ред. В.В. Игнатова. М.. 2005. С.209-237.
2. Муратова А.Ю., Туркове кая О. В., Антонюк О.Е. и др. Нефтеокисляющий потенциал ассоциативных ризобакте-рий рода Azospirilium // Микробиология. 2004. №6. С. 1-7.
3. Agarwala-Dutt R., Tilak K.V.B.R., Rana J.P.S. Isolation of Azospirilium from interior of various parts of some graminaceous plants HZ. Mikrobiol. 1991. Bd.146. S.217-219.
4. Chaudhury S., Sengupta A. Association of nitrogen fixing bacteria with leaves of Avicennia officinalis L. a tidal mangrove tree of Sandarban // Indian. J. Microbiol. 1991. Vol.31. P.321-322.
5. Nosko P., Bliss L.C., Cook F.D. The association of free-living nitrogen-fixing bacteria with the roots of High Arctic graminoids // Arct. Alp. Res. 1994. Vol.26. P. 180 -186.
6. Bashan )'., Holguin G, Azospirilium-plant relationships; environmental and physiological advances (1990-1996) 11 Can. J. Microbiol. 1997. Vol.43. P.103-121.
7. Dobereiner J., Day J.M. Associative symbiosis in tropical grasses: characterization of microorganisms and dinitrogen-fixing sites // Proc. Intern. Symp. on N2-Fixation. Washington. 1976. P.518-537.
8. Leive L., Shovlin I.K., Mergemhagen S.E. Physical, chemical and immunological properties of lipopolysaccharides released from Escherichia coli by ethylenediaminetetraacelate // J. Biol. Chem. 1968. Vol.243. P.6384-6391.
9. Bogatyrev V.A., Dykman LA., Matora L.Yu., Schwartsburd B.l The serotyping of Azospirilium spp. by cell-gold immuno-blotting // FEMS Microb. Lett. 1992. Vol.96. P. 115-118.
10. Mamopa Л.Ю., Шварцбурд Б.И., Щеголев С.Ю. Имму-нохимический анализ О-специфических полисахаридов почвенных азогфиксирующих бактерий Azospirilium brasilense II Микробиология. 1998. T.67, JVL'6. С.815-820.
11. Красов А.И., Попова И.А., Фшипьечева Ю.А., Бурыгын ГЛ., Mamopa Л.Ю. Применение иммуноферментного анализа для выявления азотфиксирующих бактерий рода Azosp'h rillum в почвенных суспензиях // Микробиология. 2009. Т.78, №5. С.662-666.
12. Hitchcock P.J., Brown Т.М. Morphological heterogeneity among Salmonella polysaccharide chemotypes in silver-stain polyacrylamide gels // .1. Bacteriol. 1983. Vol. 154. P.269-277.
13. Коннова O.H., Бойко А.С., Бурыгин Г.Л., Федоненко Ю.П., Mamopa Л.Ю., Коннова С.А., Игнатов В В. Химические и серологические исследования липополисахаридов бактерий рода Azospirilium // Микробиология. 2008. Т.77. №3. С.350- 357.
Бполотя
65
