CC BY
3УДК: 616-002.182:616-091 DOI: 10.29039/2224-6444-2024-12-1-5-9
ГИСТОПАТОЛОГИЧЕСКИЕ ИЗМЕНЕНИЯ НА ФОНЕ СУПЕРОКСИДДИСМУТАЗА-А ИНДУЦИРОВАННОГО ГРАНУЛЕМАТОЗНОГО ВОСПАЛЕНИЯ
Аблякимов Э. Т., Кривенцов М. А.
Ордена Трудового Красного Знамени Медицинский институт имени С. И. Георгиевского федерального государственного автономного образовательного учреждения высшего образования «Крымский федеральный университет имени В. И. Вернадского» (Медицинский институт им. С. И. Георгиевского ФГАОУ ВО «КФУ им. В. И. Вернадского»), 295051, бул. Ленина, 5/7, Симферополь, Россия
Для корреспонденции: Аблякимов Эльмар Тофикович, аспирант, ассистент кафедры патологической анатомии с секционным курсом Медицинский институт им. С.И. Георгиевского ФГАОУ ВО «КФУ им. В. И. Вернадского», e-mail: ablyakimov1995@bk.ru
For correspondence: Ablyakimov Elmar Tofikovich, post-graduate student, assistant of the Department of Pathological Anatomy with a Sectional Course, Order of the Red Banner of Labor Medical Institute named after S. I. Georgievsky V. I. Vernadsky Crimean Federal University (Medical Institute named after S. I. Georgievsky of Vernadsky CFU), e-mail: ablyakimov1995@bk.ru
Information about authors:
Ablyakimov E. T., https://orcid.org/0000-0002-3665-997X Kriventsov M. A., https://orcid.org/0000-0001-5193-4311
РЕЗЮМЕ
Саркоидоз - идиопатическое мультисистемное гранулематозное заболевание, характеризующееся неказеозными гранулемами. В отличие от других гранулематозных заболеваний, таких как туберкулез или острая ревматическая лихорадка, до сих пор не существует общепринятой экспериментальной модели саркоидоза. Это затрудняет понимание этиологии и патогенеза саркоидоза и, что не менее важно, разработку и внедрение новых стратегий лечения. Целью данного исследования было воспроизвести модифицированную модель саркоидоз-подобного иммунного гранулематозного воспаления и изучить влияние супероксиддисмутазы А на морфогенез гранулематозного воспаления у крыс. Материал и методы. В пилотном эксперименте было использовано 24 крысы линии Вистар. Контрольная группа животных включала 6 крыс, а экспериментальная группа - 18 животных, которых выводили из эксперимента спустя 10, 20 и 30 дней после введения разрешающей дозы. Все животные экспериментальной группы подвергались сенсибилизации искусственно синтезированной супероксиддисмутазой А в сочетании с адъювантом Фрейнда. Полученные образцы тканей были подвергнуты описательному гистологическому анализу. Результаты и обсуждение. У всех животных экспериментальной группы (на сроках эксперимента 20 и 30 дней) при гистологическом исследовании было выявлено наличие неказеозного иммунного гранулематозного инфильтрата в интерстициальной ткани, а также периферическая лимфаденопатия. В гранулематозном инфильтрате определялись клетки лимфоцитарного и моноцитарно-макрофагального ряда, с примесью эозинофилов и нейтрофилов. Кроме того, было выявлено наличие эпителиоидных клеток и гигантских клеток по типу Пирогова-Лангханса. Таким образом, по результатам экспериментального исследования во всех случаях были выявлены характерные морфологические признаки саркоидоз-подобного гранулематозного воспаления с наличием неказеозных гранулем. Заключение. На основании выявленных характерных гистопатологических изменений в тканях, сенсибилизация животных супероксиддисмутазой А в сочетании с адъювантом Фрейнда с последующим введением разрешающей дозы может служить в качестве эффективной экспериментальной модели саркоидоз-подобного иммунного воспаления и других гранулематозных заболеваний для изучения особенностей их патогенеза.
Ключевые слова: супероксиддисмутаза А, иммунная гранулема, воспаление, крысы.
HISTOPATHOLOGICAL CHANGES AGAINST THE BACKGROUND OF SUPEROXIDE DISMUTASE-A INDUCED GRANULOMATOUS INFLAMMATION
Ablyakimov E. T., Kriventsov M. A.
Medical Institute named after S. I. Georgievsky of Vernadsky CFU, Simferopol, Russia
SUMMARY
Sarcoidosis is an idiopathic multisystem granulomatous disease characterized by non-caseous granulomas. Unlike other granulomatous diseases such as tuberculosis or acute rheumatic fever, there is still no generally accepted animal model of sarcoidosis. This makes it difficult to understand the etiology and pathogenesis of sarcoidosis and, equally important, to develop and implement new treatment strategies. The aim of this study was to reproduce a modified model of sarcoidosis-like immune granulomatous inflammation and to study the effect of superoxide dismutase A on the morphogenesis of granulomatous inflammation in rats. Material and methods. 24 Wistar rats were used in the pilot experimental model. The control group included 6 rats, and the experimental group - 18 animals, which were withdrawn from the experiment after 10, 20 and 30 days after the challenging dose. All animals of the experimental group were sensitized with artificially synthesized superoxide dismutase A with complete Freund's adjuvant. A
КРЫМСКИЙ ЖУРНАЛ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ И КЛИНИЧЕСКОЙ МЕДИЦИНЫ
descriptive histological analysis of the obtained rat tissue samples was performed. Results and discussion. Histological examination revealed the presence of non-caseous immune granulomatous infiltrate in interstitial tissue, as well as peripheral lymphadenopathy in all animals of the experimental group (20 and 30 days after the challenging dose). In the granulomatous infiltrate, lymphocytic and monocyte-macrophage cells were detected, with an admixture of eosinophils and neutrophils. In addition, the presence of epithelioid cells and giant Pirogov-Langhans cells was revealed. Thus, according to the results of an experimental study, characteristic morphological signs of sarcoidosis-like granulomatous inflammation with the presence of non-caseous granulomas and Pirogov-Langhans cells were revealed. Conclusion. Based on the identified characteristic histopathological changes in tissues, sensitization of animals with superoxide dismutase A in combination with Freund's adjuvant followed the introduction of the challenging dose can serve as an effective experimental model of sarcoidosis-like immune inflammation and other granulomatous diseases to study the features of their pathogenesis.
Key words: superoxide dismutase A, immune granuloma, inflammation, rats.
Саркоидоз - идиопатическое мультисистем-ное гранулематозное заболевание, характеризующееся неказеозными гранулемам, которые преимущественно поражают лимфатические узлы, легкие и кожу [1]. В его основе лежит гиперактивность клеточно-опосредованной иммунной системы с вовлечением CD4+ Т-хелперов 1 типа, а также, согласно последним данным Т-хелперов 17 типа [2, 3]. Тем не менее, этиология и патогенез иммунных гранулем остается недостаточно изученными. Одним из триггеров, который может вызвать саркоидоз-подобные изменения является супероксиддисмутаза-А (sodA), которая представляет собой металлофермент и особый фактор патогенности, секретируемый в больших количествах патогенными видами Mycobacterium и Nocardia, которая, с одной стороны, преобразует свободные радикалы кислорода, генерируемые макрофагами хозяина, в перекись водорода и кислород, с другой стороны, стимулирует клеточный иммунный ответ в поврежденных тканях и органах [4]. Используя особый пептид sodA, ассоциированный с саркоидозными гранулемами, мы разработали периферическую (внутрикожную) модель гранулематозного воспаления саркоидоза путем модификации более ранней модели саркои-доза легких [5]. Использованный в эксперименте пептид sodA, специфичный для саркоидоз-подоб-ных изменений, продемонстрировал характерный гистопатологический и иммунофенотипический профиль на мышиных моделях, который хорошо коррелировал с морфологическими профилями при саркоидозе у человека [6]. Таким образом, данная экспериментальная модель саркоидоз-подобного иммунного гранулематозного воспаления является основой для возможных исследований патогенеза гранулематозных заболеваний, включая саркоидоз, особенностей распределения клеточных субпопуляций и их взаимодействия, а также методов иммунокоррекции.
В этой связи, целью данного исследования было воспроизвести модифицированную модель саркоидоз-подобного иммунного гранулематоз-ного воспаления и изучить влияние супероксид-дисмутазы А на морфогенез гранулематозного воспаления у крыс. было изучить влияние супе-
роксиддисмутазы А на морфогенез гранулематоз-ного воспаления у крыс.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
Исследование было проведено на 24 восьминедельных самцах крыс (масса тела 180-200 г) линии Вистар без внешних патологических признаков, которых содержали в стандартных условиях вивария. В основе работы с лабораторными животными (крысами) при проведении эксперимента неукоснительно соблюдались этические принципы (принципы «3R»), предусматривающие подходы «replacement» (замена лабораторных животных в эксперименте на альтернативные модели), «reduction» (уменьшение числа животных) и «refinement» (усовершенствование методики эксперимента: обезболивание, обеспечение благополучия животных). Соблюдение этических принципов в рамках научной работы обеспечивалось биоэтической комиссией ФГАОУ ВО «КФУ им. В.И. Вернадского». Экспериментальная часть исследования была проведена в специализированных помещения вивария Медицинского института им. СИ. Георгиевского ФГАОУ ВО «КФУ им. В.И. Вернадского», которые предназначены для содержания лабораторных животных в стандартных и надлежащих условиях с удовлетворением физиологических и экологических потребностей экспериментальных крыс.
Пептид sodA (аминокислотная последовательность AAAIAGAFGSFDKFR) был синтезирован искусственно (AtaGenix Laboratories, Ухань, КНР). Степень чистоты синтезированного пептида составляла не менее 80%. Идентичность подтверждали методом масс-спектрометрии, а чистоту оценивали по данным жидкостной хроматографии.
В соответствии с поставленной целью и задачами, изучалось влияние супероксиддисмутазы-А (sodA) на развитие и морфогенез иммунного воспаления у крыс. Все животные были разделены на контрольную группу (6 крыс по 3 крысы в каждой подгруппе) и экспериментальную группу (18 крыс по 6 крыс в каждой подгруппе по срокам эксперимента). В первый день эксперимента все крысы экспериментальной группы были
парентерально (подкожно, в область наружной поверхности бедра) сенсибилизированы искусственно синтезированной супероксиддисмутазой А из расчета 50 мкг sodA, растворенной в 0,25 мл полного адъюванта Фрейнда. На 10 день эксперимента всем крысам вводили разрешающую дозу супероксиддисмутазы А в контрлатеральную конечность - 50 мкг в 0,25 мл физиологического раствора на каждого животного. Животным 1-й контрольной подгруппы вводили в аналогичной дозе и кратности физиологический раствор, а животным 2-й контрольной подгруппы - 0,25 мл полного адъюванта Фрейнда без супероксиддис-мутазы А. На 10, 20 и 30 день после введения разрешающей дозы всех животных выводили из эксперимента под наркозом (с использованием 0,1% раствора медетомидина гидрохлорида). Животных контрольной группы выводили из эксперимента на 30-е сутки после второй инъекции.
После эвтаназии и декапитации крыс выделяли патологическое образование (гранулематоз-ный инфильтрат) с последующим визуальным, макроскопическим описанием. Исследуемые ткани фиксировали в 10% нейтральном забуфе-ренном формалине с последующей обработкой в спиртах восходящей концентрации, заливкой в парафиновые блоки (кассеты) и изготовлением гистологических препаратов толщиной 3-4 мкм, согласно общепринятым гистологическим методикам с использованием гибридного гистологического процессора Logos (Milestone Medical, Италия) и модуля Leica EG1150 (Leica Biosystems, Германия). Серийные гистологические срезы толщиной 3-4 мкм получены с использованием автоматического ротационного микротома Leica RM2255 (Leica Biosystems, Германия). В дальнейшей гистологические срезы окрашивали по стандартной методике с использованием гематоксилина и эозина для проведения качественной оценки гистопатологических преобразований с последующей морфологической оценкой иммунного воспаления. Гистологические срезы сканировали с помощью гистосканера Aperio CS2 (Leica Biosystems, Германия) с последующим анализом цифровых изображений с использованием программного обеспечения Aperio ImageScope и ImageJ [7].
Морфологическая часть исследования проведена в центральной научно-исследовательской лаборатории Ордена Трудового Красного Знамени Медицинский институт им. С.И. Георгиевского ФГАОУ ВО «Крымский федеральный университет имени В.И. Вернадского» на сертифицированном оборудовании, прошедшем метрологическую поверку.
При проведении исследования были соблюдены принципы Хельсинкской декларации, приня-
той Генеральной ассамблеей Всемирной медицинской ассоциации (2000). Животных выводили из эксперимента в соответствии с «Международных рекомендациях (этический кодекс) по проведению медико-биологических исследований с использованием животных Международного совета медицинских научных обществ (CЮMS) (1985) и правилами лабораторной практики в Российской Федерации (Приказ Минздрава России № 267 от 19.06.03).
РЕЗУЛЬТАТЫ
По результатам проведенного эксперимента по моделированию аутоиммунного гранулематоз-ного воспаления и определения потенциальных эффектов лиганд-ассоциированной активации рецепторов витамина D установлено, что сенсибилизация и последующее введение разрешающей дозы супероксиддисмутазы вызывает значительное по своей выраженности гранулематозное воспаление с формированием типичных смешанно-клеточных и эпителиоидно клеточных гранулем. Полученные результаты продемонстрировали, что парентеральное введение искусственно синтезированного пептида sodA в дозе 50 мкг приводит к развитию нарушений в иммунной системе у экспериментальных животных по типу аутоиммунного воспаления. Спустя 20 и 30 дней достоверно определялось диффузное неспецифическое иммунное гранулематозное воспаление с неказеозными гранулемами, а также увеличение периферических паховых лимфатических узлов. При микроскопии обнаружены пролиферативные воспалительные изменения с увеличением количества различных воспалительных клеток в очаге с образованием гигантских клеток. Наличие лим-фаденопатии, клеток лимфоидного и моноцитар-но-макрофагального ряда, а также многоядерных гигантских клеток по типу Пирогова-Лангханса в составе неказеозного гранулематозного воспаления морфологически коррелирует с саркоидозом. В отличие от крыс, получавших sodA, у интакт-ных крыс и контрольных крыс (не сенсибилизированных или сенсибилизированных только полным адъювантом Фрейнда) гранулематозного воспаления выявлено не было.
При рутинном гистологическом исследовании препаратов окрашенных стандартным методом (гематоксилин и эозин) определялись фрагменты фиброзно-жировой ткани и пучки поперечнополосатой мышечной ткани, содержащие множественные липидные вакуоли различного размера. Часть вакуолей формировала крупные кистозные полости, без эпителиальной выстилки (псевдокисты). Стенки псевдокист обильно инфильтрированы лимфоцитами, макрофагами, сегментоядер-ными нейтрофильными гранулоцитами и единичными эозинофилами (рис. 1А).
2024, т. 14, № 1
КРЫМСКИЙ ЖУРНАЛ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ И КЛИНИЧЕСКОЙ МЕДИЦИНЫ
В строме определялось гранулематозное воспаление с неказеозными иммунными гранулемами, находящимися на разных стадиях развития. В центральной части гранулемы видны макрофаги и эпителиоидные клетки со слабо-эозинофиль-ной цитоплазмой и центрально расположенными ядрами (овоидной или удлиненной формы). Центральные области были окружены лимфоцитами, моноцитами и фибробластами (рис. 1В).
В эндомизии, между пучками поперечнополосатой мышечной ткани отмечается диффузная инфильтрация лимфоцитами, гистиоцитами, гигантскими клетками, единичными плазмоцитами
и адипоцитами. Гигантские клетки имели выраженную эозинофильной цитоплазму и множество овальных, хаотично расположенных ядер по периферии клетки (рис. 1С).
Большая часть гранулематозного воспаления представляла собой центральную липид-ную вакуоль (по типу кольцевидной гранулемы), окруженную кольцом лимфоцитов, макрофагов, эпителиоидных клеток и фибробластов с примесью гигантских клеток. Кроме того, в тканях определялся диффузный слабовыражен-ный фиброз и явления интерстициального отека (рис. Ш).
Рис. 1. Гистопатологические изменения в тканях с явлениями иммунного гранулематозного воспаления (гематоксилин и эозин, описание представлено в тексте). А. Псевдокисты с обильной воспалительной инфильтрацией, ув. х200. В. Неспецифическая гранулема без центрального некроза, ув. х200. С. Гранулематозная инфильтрация в эндомизии, ув. х600. D. Кольцевидная гранулема по типу «пончика», с центральным липидным ядром, окруженным воспалительным клеточным валом, ув. х600. Е и F. Гигантская клетка в стенке псевдокисты, ув. х800. Обозначения: звездочка — полость псевдокисты; указатель — гигантские клетки по типу Пирогова-Лангханса; стрелки - гранулема; овальная область - лимфоцитарная инфильтрация.
Fig. 1. Histopathological changes in tissues with symptoms of immune granulomatous inflammation (hematoxylin and eosin, description is presented in the text). A. Pseudocysts with abundant inflammatory infiltration, мagnification x200. B. Nonspecific granuloma without central necrosis, мagnification x200. C.
Granulomatous infiltration in endomysium, мagnification x600. D. Annular granuloma of the «donut» type, with a central lipid nucleus surrounded by an inflammatory cell shaft, мagnification x600. E and F. A giant cell
in the pseudocyst wall, мagnification x800.
Designations: аsterisk - pseudocyst cavity; index - giant cells of the Pirogov-Langhans type; arrows -
granuloma; oval area - lymphocytic infiltration.
ОБСУЖДЕНИЕ
С момента первого описания саркоидоза в 1889 году [8], этиология и патогенез данного патологического состояния до сих пор не до конца изучены. Во многом это связано с отсутствием качественной воспроизводимой экспериментальной модели саркоидоза. Выявленная морфологическая картина диффузного неказеозного гранулематоз-ного инфильтрата, состоящего из клеток лимфо-идного и моноцитарно-макрофагального ряда, а также многоядерных гигантских клеток по типу Пирогова-Лангханса, качественно соответствует хорошо описанным гистопатологическим изменениям, наблюдающимся при саркоидоз-подобном гранулематозном воспалении [9]. Гистопатология саркоидоза является отличительной, но не патог-номоничной, так как подобные результаты могут быть обнаружены и при других гранулематозных заболеваниях [10]. Соответственно, данную модель саркоидоз-подобного гранулематозного воспаления можно использовать для изучения патогенеза других гранулематозных заболеваний.
В качестве перспектив дальнейших исследований может выступать изучение на описанной экспериментальной модели течения иммунного гранулематозного воспаления на фоне лиганд-ассоциированной активации рецепторов к витамину D, в том числе с позиций распределения субпопуляций антиген-представляющих клеток (дендритных клеток и клеток макрофагального ряда), а также различных субпопуляций клеток лимфоидного ряда, в том числе Т-хелперов, что позволит выявить закономерности развития гра-нулематозного воспаления и определить потенциальные точки приложения возможных средств коррекции, включая подходы иммунотерапии.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
На основании выявленных характерных ги-стопатологических изменений в тканях, сенсибилизация животных супероксиддисмутазой А в сочетании с адъювантом Фрейнда с последующим введением разрешающей дозы может служить в качестве эффективной экспериментальной модели саркоидоз-подобного иммунного воспаления и других гранулематозных заболеваний для изучения особенностей их патогенеза.
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Conflict of interest. The authors have no conflict of interests to declare.
Финансирование. Данное исследование выполнено за счет гранта Российского научного фонда № 23-25-00161.
Financing. This research has been supported by the grants the Russian Science Foundation, RSF 2325-00161.
ЛИТЕРАТУРА / REFERENCES
1. Brito-Zeron P, Pérez-Alvarez R, Ramos-Casals M. Sarcoidosis. Med Clin (Bare). 2022 Aug 26;159(4):195-204. doi:10.1016/j. medcli.2022.03.009.
2. Broos C. E., Koth L. L., van Nimwegen M., In 't Veen JCCM., Paulissen S. M. J., van Hamburg J. P., Annema J. T., Heller-Baan R., Kleinjan A., Hoogsteden H. C., Wijsenbeek M. S., Hendriks R. W., van den Blink B., Kool M. Increased T-helper 17.1 cells in sarcoidosis mediastinal lymph nodes. Eur Respir J. 2018 Mar 1;51(3):1701124. doi:10.1183/13993003.01124-2017.
3. Sakthivel P, Bruder D. Mechanism of granuloma formation in sarcoidosis. Curr Opin Hematol. 2017 Jan;24(1):59-65. doi:10.1097/ MOH.0000000000000301.
4. Harth G., Horwitz M. A. Export of recombinant Mycobacterium tuberculosis superoxide dismutase is dependent upon both information in the protein and mycobacterial export machinery. A model for studying export of leaderless proteins by pathogenic mycobacteria. J Biol Chem. 1999 Feb 12;274(7):4281-92. doi:10.1074/jbc.274.7.4281.
5. Huang Y., Lu CZ., Wang CC., Jiang Y., Wang XY., Duan YY. [Establishment and identification of a C57B/6 mouse sarcoidosis granuloma model]. Zhonghua Jie He He Hu Xi Za Zhi. 2013 Aug;36(8):587-91.
6. Swaisgood C. M., Oswald-Richter K., Moeller S. D., Klemenc J. M., Ruple L. M., Farver C. F., Drake J. M., Culver D. A., Drake W. P. Development of a sarcoidosis murine lung granuloma model using Mycobacterium superoxide dismutase A peptide. Am J Respir Cell Mol Biol. 2011 Feb;44(2):166-74. doi: 10.1165/rcmb.2009-03500C.
7. Schroeder A. B., Dobson E. T. A., Rueden C. T., Tomancak P., Jug F., Eliceiri K. W. The ImageJ ecosystem: Open-source software for image visualization, processing, and analysis. Protein Sci. 2021 Jan;30(1):234-249. doi: 10.1002/pro.3993.
8. Besnier E. H. Lupus Pernio de La Face; Synovites Fongueuses (Scrofulo-Tuberculeuses) Symétriques Des Extrémités Supérieures. Ann. Derm. Syph. 1889;10:333-336.
9. Grunewald J., Grutters J. C., Arkema E. V., Saketkoo L. A., Moller D. R., Müller-Quernheim J. Sarcoidosis. Nat Rev Dis Primers. 2019 Jul 4;5(1):45. doi: 10.1038/s41572-019-0096-x.
10. Tana C., Donatiello I., Caputo A., Tana M., Naccarelli T., Mantini C., Ricci F., Ticinesi A., Meschi T., Cipollone F., Giamberardino MA. Clinical Features, Histopathology and Differential Diagnosis of Sarcoidosis. Cells. 2021 Dec 26;11(1):59. doi:10.3390/cells11010059.
