CC BY
65
8. Simon P.M., Schwartzstein R.M., Weiss J.W. et al. Distinguishable types of dyspnea in patients with shortness of breath. Am. Rev. Respir. Dis. 1990; 142: 1009—14.
9. Chikina S.Yu., Trushenko N.V. How to understand «language of dyspnea?». Atmosfera. Pul'monologiya i allergologiya. 2012; 4: 35—7.
10. Dronov S.V. Multivariate statistical analysis. Barnaul: Izdatel'stvo Altayskogo gos. universiteta; 2006. (in Russian)
11. Lynn J., Fly E.W., Zhong Z. et al. Living and dying with chronic obstructive pulmonary disease. J.Am. Geriatr. Soc. 2000; 48 (5): 91—100.
Поступила 09.03.14 Received 09.03.14
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2014 УДК 616.248-053.2-07
ГИПЕРЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ БРОНХОВ У ДЕТЕЙ С НЕЙТРОФИЛЬНЫМ ФЕНОТИПОМ БРОНХИАЛЬНОЙ АСТМЫ ПРИ ПОЛИМОРФИЗМЕ ГЕНОВ вЭГМИ И вЗГТ1
Безруков Л.А., Колоскова Е.К., Галущинская А.В.
Буковинский государственный медицинский университет, г. Черновцы, Украина
Введение. Взаимоотношение гиперчувствительности бронхов как ключевого феномена бронхиальной астмы с полиморфизмом генов детоксикации GSTM1 и GSTT1 при нейтрофильном фенотипе этого заболевания является недостаточно изученным.
Материал и методы. Проведены бронхопровокационные тесты с гистамином и дозированной физической нагрузкой (бег), а также генотипирование GSTM1 и GSTT1 у 33 детей с нейтрофильным фенотипом бронхиальной астмы. По результатам бронхопровокационной пробы с гистамином выраженная гиперчувствительность бронхов к этому прямому фармакологическому стимулу (ПК20Г < 0,3 мг/мл) у детей с делецией GSTM1 и/или GSTT1 определялась в 30,7% случаев, а при их отсутствии — в 12,5% (Рф < 0, 05). Относительный риск развития выраженной чувствительности бронхов к гистамину при делеционном полиморфизме GSTM1 и/или GSTT1 составил 3,1 (95% доверительный интервал 1,4—6,4), при отношении шансов 2,4 (95% доверительный интервал 1,8—3,1) и АР = 0,18. Заключение. При наличии делеций в системе генов GSTT1 и GSTM1 у детей с нейтрофильным фенотипом бронхиальной астмы чаще отмечалась повышенная гиперчувствительность бронхов к гистамину и дозированной физической нагрузке.
Ключевые слова: гиперчувствительность бронхов; нейтрофильный фенотип бронхиальной астмы; полиморфизм генов GSTT1 и GSTM1.
BRONCHIAL HYPERSENSITIVITY IN CHILDREN WITH THE NEUTROPHILIC PHENOTYPE OF BRONCHIAL ASTHMA AND GSTM1 AND GSTT1 GENE POLYMORPHISM
Bezrukov L.A., Koloskova E.K., Galushchinskaya A.V.
Bukovinian State Medical University, Chernivtsi, Ukraine
Introduction. The relationship between bronchial hypersensitivity as the key phenomenon of bronchial asthma and detoxication GSTM1 or GSTT1 gene polymorphism in children with neutrophilic phenotype of this disease remains unclear. Materials and methods. 33 children with bronchial asthma of neutrophilc phenotype were examined in histamine and dosed physical exercise (running) tests. In addition GSTM1 and GSTT1 genotyping was performed.
Results. Histamine test revealed bronchial hypersensitivity (HTC <0.3 mg/ml) in 30.7% of the children with GSTM1 and/or GSTT1 deletions versus 12.5% of those without deletions (Рф<0.05). The relative risk of hypersensitivity to histamine (HTC <0.3 mg/ml) in the presence of deletions was estimated as 3.1 (95% CI 1.4-6.4), at OR 2.4 (95% CI 1.08-3.1) and AR = 0.18. Conclusion. Children with the neutrophilic phenotype of bronchial asthma having deletions in the GSTT1/GSTM1 system are characterized by bronchial hypersensitivity to histamine and dosed physical exercises.
Key words: bronchial hypersensitivity; neutrophilic phenotype of bronchial asthma; GSTM1 and GSTT1 gene polymorphism.
Гиперчувствительность бронхов у больных бронхиальной астмой (БА) рассматривается как характерная особенность заболевания, которая обычно определяет его тяжесть и частоту обострений [7]. Предполагается, что в основе этого феномена лежит хроническое воспаление дыхательных путей, которое нередко имеет нейтрофильный характер [10]. Считается, что нейтрофильный фенотип БА возникает в результате неэффективности механизмов защиты бронхов в процессе ок-сидативного стресса, одной из причин которой может служить делеционный полиморфизм генов детоксика-ции ОБТМ1 и ОБТТ1 в эпителии [2, 8].
В то же время следует признать, что вопрос о взаимоотношении гиперчувствительности бронхов у де-
тей с нейтрофильным фенотипом БА и полиморфизма указанных генов остается открытым [1]. Решение этой задачи, возможно, позволит повысить эффективность контролирующей терапии за счет ее индивидуальной направленности у больных с установленной характеристикой этих генов предрасположенности.
Цель работы — определить показатели неспецифической гиперчувствительности бронхов у детей с ней-трофильным фенотипом БА при полиморфизме генов ОБТМ1 и ОБТТ1.
Материал и методы
Обследованы 33 ребенка школьного возраста с нейтрофильным фенотипом БА. Нейтрофильный характер
воспаления дыхательных путей определяли при количестве нейтрофильных гранулоцитов 59% и более и эозинофильных — менее 3% при цитологическом анализе мокроты. Кроме общеклинического комплексного обследования, у всех детей в послеприступном периоде проводили бронхопровокационные тесты с гиста-мином и дозированной физической нагрузкой (бег) [5, 9]. При повышении гиперчувствительности бронхов к гистамину отмечалось снижение провокационной концентрации гистамина (ПК20Г, мг/мл), а при повышении их гиперреактивности — увеличение значения дозозависимой кривой (ДЗК, усл. ед.). Чувствительность бронхов к дозированной нагрузке определялась индексом бронхоспазма, который наряду с реакцией на ингаляцию сальбутамола (индекс бронходилатации) характеризовал их общую лабильность, обозначаемую в виде индекса лабильности бронхов.
У всех детей проведено генотипирование GSTM1 и GSTT1. Общую геномную ДНК выделяли из крови в соответствии со стандартным протоколом с использованием протеиназ К и додецилсульфата натрия в качестве детергента [3, 6].
Выявление делеций в генах GSTM1 и GSTT1 осуществляли методом мультиплексной полимеразной цепной реакции, анализ результатов которой проводили методом электрофореза в 2% агарозном геле. Ожидаемую длину фрагментов ДНК (431 н.п. для GSTT1 и 120 н.п. для GSTM1) рассчитывали с помощью пакета программ компьютерной обработки данных DNASTAR с использованием последовательностей генов GSTM1 и GSTT1, имеющихся в базе данных Genbank. Гомозиготные формы с делецией обеих копий генов GSTM1 и GSTT1 идентифицировали при отсутствии соответствующего фрагмента на электрофореграмме. Такие генотипы обозначали как M1del и T1del. Соответственно наличие этих фрагментов на электрофореграммах свидетельствовало о гомо- или гетерозиготности по нормальной копии гена. Генотип таких пациентов обозначали как М1+ и Т1+.
Исходя из результатов генотипирования сформированы 2 клинические группы наблюдения: 1-ю группу составили 14 детей, у которых ферментативная активность GSMT1 и GSTT1 была сохранена, так как они имели как минимум по одной копии неповрежденных аллелей соответствующих генов (генотип М1+ Т1+), 2-ю группу — 19 детей, у которых отсутствует активность одной или одновременно обеих исследуемых изоформ GSTM1 или GSTT1 (генотипы M1delT1+, M1+T1del и M1delT1del). По основным клиническим признакам (пол, возраст, место жительства, тяжесть
и длительность заболевания) группы сравнения были сопоставимы.
Полученные результаты анализировали с использованием параметрических и непараметрических методов статистики, учитывая оценку достоверности различия показателей по коэффициенту Стьюдента и вычисляя значимость качественных различий по угловому преобразованию Фишера (критерий ф), Вилкоксо-ну—Манну—Уитни (критерий и). Диагностическую ценность теста определяли с учетом его специфичности, чувствительности, отношения правдоподобия положительного (ОП+) и отрицательного (ОП-) результатов, а также посттестовой вероятности положительного (ПТВ+) и отрицательного (ПТВ-) результатов. О вероятности реализации события судили по величине относительного риска (ОР) и атрибутивного риска (АР), а также отношения шансов (ОШ).
Результаты и обсуждение
В таблице приведены показатели неспецифической гиперчувствительностьи бронхов у больных с нейтро-фильным фенотипом БА в зависимости от генотипной характеристики ОБТМ1 и ОБТТ1.
Приведенные данные дают основание считать, что у детей с делецией фрагментов ОБТМ1 и/или ОБТТ1 отмечается тенденция к более выраженной неспецифической гиперчувствительности бронхов, чем у больных группы сравнения. У этих детей чаще определяли выраженные показатели лабильности бронхов и их гиперчувствительности к гистамину. Так, индекс бронхоспазма более 17% при генотипе М1+Т1+ определялся у 9% пациентов, а в группе сравнения — у 38% (Рф = 0,03). Индекс лабильности бронхов более 23% у больных с делецией в исследуемых генах выявлялся в 61,1% случаев, а при отсутствии полиморфизма этих генов — в 18,1% (Рф = 0,01).
По результатам бронхопровокационной пробы с гистамином (ПК20Г) выраженная гиперчувствительность бронхов к этому прямому фармакологическому стимулу (ПК20Г < 0,3 мг/мл) у детей с делецией ОБТМ1 и/или ОБТТ1 определялась в 30,7% случаев, а при ее отсутствии — в 12,5% (Рф < 0, 05).
При использовании делеционного полиморфизма генов ОБТМ1 и ОБТТ1 в качестве диагностического теста отмечено, что при наличии в них делеции ОР развития выраженного бронхоспазма физического напряжения (индекс бронхоспазма более 17%) составил 6,1 (95% доверительный интервал (ДИ) 2,7—13,7) при ОШ 4,2 (95% ДИ 3,3—5,3) и АР 0,29. Диагностическая ценность этого теста как косвенного показателя такого
Показатели гиперчувствительности бронхов у детей с нейтрофильным фенотипом БА при разных генотипах вЗГМ1 и вЗГТ1
Генотип GSTM1 и GSTT1 Число больных Индекс бронхоспазма,% Индекс бронходилатации, % Индекс лабильности бронхов, % ПК20Г, мг/мл ДЗК, усл. ед.
М1+Т1+ 14 8,2 8,5 16,8 2,3 1,6
M1+T1del; M1delT1+; M1delT1del 19 18,8 10,6 29,4 1,0 1,7
Критерий U > 0,05
бронхоспазма составляла: чувствительность 80% (95% ДИ 66—90%), специфичность 59% (95% ДИ 51—67%), ОП(+) 2, ОП(-) 0,3. При этом ПТВ(+) повышалась на 16,6%, ПТВ(-) снижалась на 26%.
У этих же больных ОР наличия выраженной чувствительности бронхов к гистамину (ПК20Г < 0,3 мг/мл) составил 3,1 (95% ДИ 1,4—6,4) при ОШ 2,4 (95% ДИ 1,8—3,1) и АР 0,18. Диагностическая ценность теста: чувствительность 71%, специфичность 55%, при ОП(+) 1,6, ОП(-) 0,5. Посттестовая вероятность наличия указанной гиперчувствительности бронхов к гистамину при полиморфизме генов ОБТМ1 и ОБТТ1 повышалась на 12%, ПТВ(-) снижалась на 16%.
Полученные данные показывают, что при нейтро-фильном фенотипе БА чаще отмечается повышенная гиперчувствительность бронхов при наличии делеций в системе генов детоксикации по сравнению с группой детей, у которых отсутствует делеционный полиморфизм ОБТМ1 и ОБТТ1. Следует отметить, что усиление гипервосприимчивости бронхов происходит за счет их гиперчувствительности (ПК20Г), но не гиперреактивности (ДЗК). Возможно, это связано с изменением скорости деградации ксенобиотиков и эндогенных субстратов в дыхательных путях у этих больных, что спо-
собствует их повышенной чувствительности к агентам окружающей среды [2,4].
Таким образом, отмечен существенный риск наличия повышенной гиперчувствительности бронхов у детей с нейтрофильным фенотипом БА при генотипах Т1+М1М; Т1Се1М1+; Т1Се1М1Се1. Выводы
1. При наличии делеций в системе генов ОБТТ1 и ОБТМ1 у детей с нейтрофильным фенотипом бронхиальной астмы чаще отмечалась повышенная гиперчувствительность бронхов к гистамину и дозированной физической нагрузке.
2. Наличие делеционного полиморфизма ОБТТ1 и ОБТМ1 у детей с нейтрофильным фенотипом бронхиальной астмы увеличивает риск развития повышенной гиперчувствительности бронхов (отношение шансов 4,2, 95% доверительный интервал 3,3—5,3).
3. Диагностическая ценность наличия делеций в генах детоксикации в качестве маркера подтверждения выраженной гиперчувствительности бронхов у детей с нейтрофильным фенотипом бронхиальной астмы характеризовалась чувствительностью теста 80%, специфичностью 59%, при этом посттестовая вероятность положительного результата повышалась на 16,6%.
Сведения об авторах:
Буковинский государственный медицинский университет
Кафедра педиатрии и детских инфекционных болезней
Галущинская Алла Владимировна — аспирант кафедры; e-mail: [email protected] Колоскова Елена Константиновна — д-р мед. наук, проф., зав. кафедрой. Безруков Леонид Алексеевич — д-р мед. наук, проф. кафедры.
ЛИТЕРАТУРА
1. Асанов А.Ю., Намазова Л.С. Генетические основы бронхиальной астмы. Педиатрическая фармакология. 2008; 5 (4): 31—7.
2. Брагина Е.Ю., Фрейдин М.Б., Тен И.А., Огородова Л.М. Полиморфизм генов ферментов биотрансформации ксенобиотиков GSTT1, GSTM1, CYP2E1 и CYP2C19 у больных бронхиальной астмой. Бюллетень СО РАМН. 2005. 3 (117): 128—32.
3. Выделение ДНК из крови. Практическая молекулярная биология. http://molbiol.edu.ru/
4. Дедков А.А. Структурный полиморфизм кандидатных генов при алергических заболеваниях (бронхиальная астма, аллергический ринит, атопический дерматит) у детей: Дисс. 2012.
5. Новик Г.А., Боричев А.В. Спирометрия и пикфлуометрия при бронхиальной астме у детей (практика оценки и мониторинга): Учебное пособие. СПб.: ГПМА; 2007.
6. Beckett G.J., Hayes J.D. Glutathione S-transferases: biomedical applications. Adv. Clin. Chem. 1993; 30: 281—38.
7. Brannan J. Airway hyperresponsiveness in asthma: Its measurement and clinical significance. Chest. 2010; 138: 11—7.
8. Haldar P., Pavord I. Noneosinophilic asthma: a distinct clinical and pathologic phenotype. J. Allergy Clin. Immunol. 2007; 119 (5): 1043—52.
9. Juniper E.F., Cockcroft D.W., Hargeave F.E. Histamine andMetha-choline ingalation tests. Lund; 1994.
10. Pavord I.D. Non-eosinophilic asthma and the innate immune response. Thorax. 2007; 62: 193—4.
REFERENCES
1. Asanov A.Yu., Namazova L.S. Geneticheskiye osnovy bronkhialnoy astmy. Pediatricheskaya farmakologiya. 2008; 5 (4): 31—7. (in Russian)
2. Bragina Ye.Yu., Freydin M.B., Ten I.A., Ogorodova L.M. Polimorfizm genov fermentov biotransformatsii ksenobiotikov GSTT1, GSTM1, CYP2E1 i CYP2C19 u bolnykh bronkhialnoy astmoy. Byulleten' SO RAMN. 2005; 3 (117): 128—32. (in Russian)
3. Vydeleniye DNK iz krovi. Prakticheskaya molekulyarnaya biologiya. http://molbiol.edu.ru/ (in Russian)
4. Dedkov A.A. Strukturnyy polimorfizm kandidatnykh genov pri alergicheskikh zabolevaniyakh (bronkhialnaya astma, allergicheskiy rinit, atopicheskiy dermatit) u detey: Diss. 2012. (in Russian)
5. Novik G.A., Borichev A.V. Spirometriya i rikfluometriya pri bronkhialnoy astme u detey (praktika otsenki i monitoringa): Uchebnoe posobie / Pod red. I.M. Vorontsova. St. Peterburg: GPMA; 2007. (in Russian)
6. Beckett G.J., Hayes J.D. Glutathione S-transferases: biomedical applications. Adv. Clin. Chem. 1993; 30: 281—38.
7. Brannan J. Airway hyperresponsiveness in asthma: Its measurement and clinical significance. Chest. 2010; 138: 11—7.
8. Haldar P., Pavord I. Noneosinophilic asthma: a distinct clinical and pathologic phenotype. J. Allergy Clin. Immunol. 2007; 119 (5): 1043—52.
9. Juniper E.F., Cockcroft D.W., Hargeave F.E. Histamine andMetha-choline ingalation tests. Lund; 1994.
10. Pavord I.D. Non-eosinophilic asthma and the innate immune response. Thorax. 2007; 62: 193—4.
Поступила 25.02.14 Received 25.02.14
