Гидролазная активность как показатель состояния микробного сообщества вермикомпоста Текст научной статьи по специальности «Промышленные биотехнологии»

УДК 579.26:631.95

ГИДРОЛАЗНАЯ АКТИВНОСТЬ КАК ПОКАЗАТЕЛЬ СОСТОЯНИЯ МИКРОБНОГО СООБЩЕСТВА ВЕРМИКОМПОСТА1

А.В. Якушев, Б.А. Бызов

Показана возможность применения метода определения гидролазной активности с помощью диацетата флюоресцеина для анализа готовности вермикомпоста и контроля процесса вермикомпостирования.

Ключевые слова: вермикомпост, диацетат флуоресцеина, бактерии, грибы.

Введение

Вермикомпостирование — это получение компоста с использованием дождевых червей, когда бактерии и грибы производят частичное разложение и гумификацию органических остатков [3, 5, 10, 11]. Вер-микомпосты стимулируют рост растений [3, 5, 10], подавляют фитопатогенные организмы [5].

Для определения вредных и полезных микроорганизмов, оценки степени зрелости вермиком-поста, а также для биоиндикации интегрального понятия — плодородия применяются разные микробиологические методы. Исследование состава и активности микробных сообществ помогает понять, как формируются и с чем связаны свойства верми-компостов. Знание микробиологии вермикомпости-рования необходимо для контроля за производством высококачественных вермикомпостов и создания высокоэффективных их форм с заданными свойствами (борьба с фитопатогенами, очистка почвы от полютантов и т.д.). Несмотря на многочисленные исследования, до сих пор не существует общепринятых и теоретически обоснованных микробиологических методов оценки качества и определения стандартов вермикомпостов.

Гидролазы, участвуя в реакциях гидролитического распада высокомолекулярных соединений, играют важную роль в снабжении микроорганизмов легкоусвояемыми продуктами гидролиза и во многом определяют скорость созревания вермикомпоста. Среди различных методов определения гидролазной активности метод, основанный на реакции ферментативного гидролиза диацетата флюоресцеина (ФДА), привлекает простотой, экспрессностью и наглядной положительной корреляцией с активной микробной биомассой. Показана зависимость между биомассой микроорганизмов в субстрате и скоростью гидролиза ФДА [2].

Гидролиз ФДА осуществляют липазы, ацилазы, неспецифические эстеразы и протеазы. Поскольку образование флюоресцеина в растворе связано с активностью не только экзоферментов и мембран-

но-закрепленных ферментов микроорганизмов, но и отчасти внутриклеточных ферментов живых полноценных клеток [13], скорость гидролиза может служить характеристикой общей гидролитической активности микробной биомассы в почвах.

Известно, что микробные сообщества почв и органических субстратов изменчивы, и, следовательно, их параметры необходимо исследовать в динамике в стандартных условиях. Эти проблемы позволяет преодолеть анализ изменений параметров микробных сообществ в ходе микробной сукцессии [1]. В связи с этим мы считаем, что лабораторный сукцессионный анализ, проводимый в одинаковых условиях, позволит сравнивать промышленные партии вермикомпостов с разными физико-химическими свойствами и условиями хранения (например, различная влажность готового вермикомпоста и температура хранения) и изучать их на основе микробиологических свойств. Это открывает путь к поиску микробиологических стандартов качества вермикомпоста. Сукцессия может быть наиболее просто инициирована увлажнением сухого компостного образца. Данный вариант и был принят в настоящей работе.

Предполагается, что готовый вермикомпост обладает характерными микробиологическими параметрами, которые могут быть положены в основу микробиологических стандартов вермикомпостов.

Цель — проследить сукцессионные изменения гидролазной активности и ее связи с биомассой грибного и актиномицетного мицелия как показателя изменений состояния микробного сообщества вермикомпоста.

В задачи исследования вермикомпоста входило:

• проследить методом стекол обрастания Рос-си—Холодного изменение длины мицелия грибов и актиномицетов в ходе сукцессии;

• определить гидролазную активность (гидролиз ФДА);

• определить численность грибов и бактерий в готовом промышленном образце;

• установить корреляцию между исследуемыми микробными признаками.

1 Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ (гранты № 08-04-00786-а, № 07-04-90835-Моб_ст) и гранта Президента РФ по поддержке ведущих научных школ НШ-2227.2008.4.

Объекты и методы исследования

Для исследования использовали готовый промышленный вермикомпост марки «Русский биогумус», любезно предоставленный А.Б. Абдуразаковым (Подмосковное хозяйство ООО «Русский биогумус»). Процесс вермикомпостирования осуществляли грядовым способом с использованием червя Eisenia foetida andrei (Bouche, 1972) породы «Русский Московский гибрид» в течение 6 мес. Субстрат вермикомпостирования — перепревший в буртах в течение 6 мес. подстилочный навоз крупного рогатого скота. Готовый вермикомпост хранили во влажном состоянии (влажность 100%). Для подготовки к сукцессионному анализу его высушивали при комнатной температуре до воздушно-сухого состояния и хранили в сухом виде две недели до запуска сукцессии.

Модельное вермикомпостирование проводили в лабораторных условиях. Процесс представляет собой микробную сукцессию. В качестве модельных субстратов вермикомпостирования и компостирования использовали: 1) перепревший навоз крупного рогатого скота; 2) смесь равных частей по массе свежеопавших листьев ольхи черной (Alnus glutinosa (L.) Gaertn.), ивы козьей (Salix caprea L.) и березы пушистой (Betula pubescens Enrh.); 3) низинный торф.

Принятые в работе сокращения для компостов: ВКТ — вермикомпост из торфа; КТ — компост торфяной; ВКН — вермикомпост из навоза; КН — компост навозный; ВКЛ — вермикомпост листовой; КЛ — компост листовой.

В листовой и навозный вермикомпосты вносили дождевых червей Eisenia foetida andrei в количестве 100 ос./кг сухого вещества [5]; в торф — смешанную культуру червей Aporrectodea caliginosa и A. rosea, отобранную на осушенном низинном торфянике, в количестве 75 ос./кг сухого вещества.

Для получения исходной компостной смеси на основе листового опада к нему предварительно добавляли мелкий речной песок (36%) и карбонат кальция (5%) и компостировали на протяжении 30 сут.; только после этого в компост добавляли червей. Масса сухого вещества в микрокосме составляла 200 г для навозного и листового и 400 г для торфяного ком-постов. Были заложены варианты с внесением и без внесения (контроль) червей в 3-кратной повторности. Субстраты инкубировали при температуре 16—19° и постоянной влажности (150% — для навозных и листовых, 100% — для торфяных компостов).

Методы, использованные в работе, направлены на интегральную характеристику микробного сообщества. Это прежде всего метод определения гидролазной активности по реакции ферментативного гидролиза ФДА [9], суть которого заключается в определении скорости ферментативной реакции: бесцветный 3',6'-диацетат-флюоресцеин в результате гидролиза переходит во флюоресцеин желтого цвета.

В основе метода лежит модель ферментативной кинетики Михаэлиса—Ментен вида

E + S ^

,[ES ]-

Л3_

>E + P,

где Е — концентрация фермента; — концентрация субстрата; [Е5] — концентрация субстрат-ферментного комплекса; Р — концентрация продукта реакции; к] — константа скорости образования субстрат-ферментного комплекса; к2 — константа скорости его распада на исходные составляющие; к3 — константа скорости распада субстрат-ферментного комплекса с образованием продукта реакции. В реальных растворах вместо концентрации в модели используется химическая активность компонентов (цит. по [6]).

Уравнение Михаэлиса—Ментен, описывающее зависимость скорости ферментативной реакции от концентрации субстрата (ФДА), имеет вид:

V =

1 + Km 1 + S

где Vmаx — максимальная скорость реакции, мкмоль флюоресцеина/г-ч; Кт — константа Михаэлиса, мкмоль ФДА/л, 5 — концентрация субстрата, мкмоль ФДА/л; V — скорость реакции при определенной концентрации субстрата. Константа Михаэлиса рассчитывается по формуле:

Km =

k 2 + k^

Таким образом, чем выше Кт, тем меньше устойчивость комплекса субстрат—фермент и сродство фермента к субстрату, т.е. эффективность работы ферментов ниже. Это дает возможность оценить, какая группировка микроорганизмов вносит основной вклад в пул активных гидролитических ферментов: К- или г-стратеги [1].

^ах = к2йф = ^ГОф

где ^ах — максимальная скорость реакции (функция от активности ферментов); к2 — константа скорости распада комплекса фермент—продукт; йф — средняя активность ферментов в исследуемом объекте; у — коэффициент активности ферментов; Сф — суммарная концентрация ферментов, гидролизующих ФДА [6].

Для оценки скорости процесса в реальных условиях, когда наблюдается лимитация скорости реакции по субстрату, представляется более показательным, чем Vmаx и Кт, параметр, учитывающий оба параметра уравнения Михаэлиса—Ментен:

Vm

k1 ' k 2 ' a -

Km

Чем выше значения данного параметра, тем больше скорость процесса в ненасыщенных субстратом условиях [12].

2

Методика модифицирована для объектов с высоким содержанием органического вещества. Новое — уникальная комбинация параметров различных методик. Увеличен диапазон концентраций ФДА, подобрано оптимальное соотношение компост:бу-фер, время инкубации. Компосты анализируют при естественной влажности с учетом содержания воды. Навеску (1 г) заливают 0,1 М фосфатным буфером Серенсена с рН 7,6 [7] в соотношение компост: буфер=1:10, добавляют ФДА, предварительно растворенный в ацетоне, и встряхивают пробирку. Суспензию инкубируют 1 ч при +30°, центрифугируют и надосадочную жидкость колориметрируют при 490 нм. Раствором сравнения служит надосадочная жидкость, полученная в ходе холостого опыта. В случае, если сразу после инкубации колориметрировать нельзя, гидролиз останавливают добавлением ацетона (50% объема суспензии) и хранят при +5° [2]. Скорость гидролиза ФДА рассчитывается по формуле:

V =

С ■ V

I ■ т

где V — скорость реакции, мкмоль флюоресцеина/г-ч; с — концентрация флюоресцеина, мкмоль/л; V — объем приливаемого к навеске буфера, л; t — время инкубации, ч; m — навеска исследуемого компоста в пересчете на абсолютно сухое вещество, г. Концентрацию флюоресцеина определяют по калибровочному графику ее зависимости от оптической плотности раствора. Следует отметить, что окраска раствора зависит от рН, поэтому растворы для калибровки надо готовить при рН 7,6. Для их получения гидролизуют ФДА при +60°.

Максимальную скорость реакции (^ах) и константу Михаэлиса (Km) получают в результате аппроксимации экспериментальных данных уравнением Михаэлиса—Ментен [9]. Для определения параметров уравнения устанавливали скорость реакции V при пяти концентрациях ФДА (8): 4,80; 19,23; 33,65; 48,07; 96,15 мкмоль/л.

Поиск параметров уравнения осуществляли с помощью программы 81а1М1са 6.0 методом наименьших квадратов. Для упрощения процедуры аппроксимации уравнение приводили к линейному виду

1 V

1

1 Кт

V Б V

' тах " ' тах

Микробные свойства вермикомпоста изучали с помощью авторской модификации метода Росси—Хо-лодного [8]. Особенность нашей работы — прижизненная окраска микроорганизмов акридином оранжевым. Микроскопию проводили на люминесцентном микроскопе. Число полей зрения 30.

Численность основных морфологических групп микроорганизмов в вермикомпосте определяли с помощью люминесцентной микроскопии суспензий исследуемых образцов [4].

Промышленную партию готового вермикомпоста, хранящегося во влажном состоянии и принимаемого

за климаксную микробную систему, сравнивали с вермикомпостом, высушенным до воздушно-сухого состояния, а затем увлажненным до исходного 100%-го уровня.

Результаты и их обсуждение

В промышленных, модельных вермикомпостах и компостах зависимость скорости ферментативного гидролиза от концентрации субстрата (ФДА) описывается гиперболической функцией Михаэли-са—Ментен с высоким коэффициентом корреляции (г2 = 0,96). Такая же зависимость обнаружена ранее и для почв [9]. Таким образом, для характеристики процессов гидролиза в вермикомпостах можно использовать параметры этого уравнения.

Анализ промышленного вермикомпоста. Значения константы насыщения Михаэлиса, которая характеризует эффективность ферментов — сродство к субстрату, представлены в таблице. Ожидалось, что будет иметь место динамика эффективности ферментов по ходу сукцессии. На ее ранних стадиях, когда преобладают г-стратеги с неэффективными ферментными системами, значение Кт будет выше, чем на поздних стадиях. Однако достоверных различий по срокам не наблюдалось. Вместе с тем происходило достоверное снижение эффективности после высушивания—увлажнения (Кт = 28,6 ± 23,7 мкмоль ФДА/л) в сравнении с нативным вермикомпостом (Кт = 144,2 ± 57,2 мкмоль ФДА/л). Таким образом, можно констатировать необратимое увеличение эффективности гидролаз после данного стрессового воздействия, приводящего к омоложению микробной биомассы.

В изменении максимальной скорости ферментативной реакции (таблица) прослеживается закономерность — всплеск активности в первые сутки после увлажнения и затем постепенное угасание. Это совпадает с представлениями о всплеске активной биомассы на ранних этапах микробной сукцессии [1]. Вместе с тем наблюдается достоверное снижение после высушивания—увлажнения (Р^ = 0,13±3,6 мкмоль флюоресцеина/г-ч) в сравнении с нативным вермикомпостом (^ах = 0,87+0,57 мкмоль флюоресцеина/г-ч).

В изменении параметра Vmax/Кm прослеживается снижение по ходу сукцессии (таблица). Это означает, что реальная гидролитическая активность на ранних этапах сукцессии возросла. Интересно, что величина Vm¡x/Кm не изменилась после омоложения микробной биомассы вследствие высушивания—увлажнения. Это означает, что реальная скорость гидролитических процессов во вновь установившемся климаксном микробном сообществе (60 сут. инкубации) не изменилась.

Анализ модельного вермикомпостирования. Примерно на 50-е сутки компостирования наблюдается существенное повышение значения Кт во всех трех

Изменение максимальной скорости реакции (Ктах), константы Михаэлиса (Кт) и параметра Утах/Кт в ходе сукцессии, инициированной увлажнением сухого промышленного вермикомпоста

Время, сут. Km, мкмоль ФДА/л Vmax, мкмоль флюоресцеина/г-ч Vmax/Km, мкмоль флюоресцеи-на/л: мкмоль ФДА/гч

0 (воздушно-сухой) 29,5 ± 16,2 0,16 ± 0,01 0,005

1 4,5 ± 2,5 0,20 ± 0,01 0,044

2 10,87 ± 11,3 0,19 ± 0,005 0,018

4 7,4 ± 4,2 0,15 ± 0,01 0,020

8 35,9 ± 74 0,13 ± 0,06 0,003

23 3,6 ± 3,5 0,10 ± 0,01 0,029

30 43,6 ± 61 0,11 ± 0,02 0,002

60 28,6 ± 23,7 0,13 ± 0,02 0,004

Нативный 144,2 ± 57,2 0,87 ± 0,57 0,006

Примечание. Доверительные интервалы даны для р = 0,95.

модельных вермикомпостах по сравнению с компос-тами (рис. 1). Это указывает на селекцию дождевыми червями микроорганизмов с неэффективной гидролизной ферментной системой (r-стратеги). Значения Кгп в модельных вермикомпостах на поздних этапах созревания близки к таковым в нативном промышленном вермикомпосте. По параметру Vmax вермиком-посты от компостов не отличаются (рис. 2), хотя прослеживается временная динамика, аналогичная сукцессионным изменениям в промышленном вермикомпосте после увлажнения сухого образца.

Значение Vmax/Кт вырастает на ранних стадиях сукцессии и затем падает, как и в ходе сукцессии готового промышленного вермикомпоста (рис. 3). Таким образом, по данному параметру можно судить о ходе микробной сукцессии в процессе вермикомпостирования. Следует обратить внимание на то, что

Рис. 2. Изменение параметра Vmax в ходе вермикомпостирования (Условные обозначения см. на рис. 1.)

Рис. 1. Изменение параметра Km в ходе вермикомпостирования: КН — компост навозный, ВКН — вермикомпост из навоза, КЛ — компост листовой, ВКЛ — вермикомпост листовой, КТ — компост торфяной, ВКТ — вермикомпост из торфа; сплошная линия — ком-посты, пунктирная линия — вермикомпосты

Рис. 3. Динамика параметра Vmax/Km в процессе компостирования (Условные обозначения см. на рис. 1.)

вермикомпост листовой (ВКЛ) (исходный субстрат, наименее разложенный из исследуемых) созревает раньше, чем компост листовой (КЛ).

Стекла обрастания

Анализ промышленного вермикомпоста. В нативном (климаксном) промышленном вермикомпосте стекла изымались на 1-, 2-, 4-, 8- и 18-е сутки. Поверхность их просматривалась при увеличении х100, повторность опыта 3-кратная. Ни на одном стекле не был зафиксирован грибной мицелий. Актиномице-ты встречались крайне редко и были представлены короткими слабо ветвящимися гифами, на стеклах обрастания они практически не образовывали спор. Среди бактерий преобладали кокковидные формы, образующие микроколонии из 2—4 клеток. Споры грибов к стеклам практически не прилипали (имелись лишь единичные случаи).

Прямой микроскопический метод не выявил мицелиальных организмов. В готовом нативном вермикомпосте грибы находятся преимущественно в неактивной форме (споры) в числе 109 ± 19 млн/г сухого субстрата. Среди спор грибов доминируют три морфотипа: шарообразные (диаметр около 3 мкм — 103,5 млн/г), овальные (2,6 на 1,7 мкм — 3,3 млн/г), круглые автофлюоресцирующие (светятся желтым светом без окраски красителем) (около 8 мкм — 2,2 млн/г) (3 мазка на 50 полей зрения).

Бактерии в основном кокковидной формы, их численность — 2,3 ± 0,2 млрд/г, что соответствует таковой в гумусовом горизонте плодородных почв [4].

Микробный пейзаж на стеклах обрастания после высушивания—увлажнения существенно меняется. Уже начиная с четвертых суток и до конца эксперимента (30 сут.) численно регистрируется грибной и актиномицетный мицелий (рис. 4). Динамика роста грибного мицелия имеет волнообразный характер, причем минимумы Кт совпадают с двумя максимумами грибной биомассы на стеклах обрастания. Корреляция между параметром Кт и длиной грибного мицелия имеет вид обратной степенной функции: длина гиф (мм/см2 стекла)=91/Кт0'52. Это указывает на наличие трех зон. Когда грибного мицелия мало, Кт определяется прокариотами. По мере увеличения биомассы грибов наблюдается зона зависимости Кт от грибной биомассы. Когда она доминирует в микробном пуле, ее дальнейшее увеличение не влияет на величину константы насыщения.

Заключение

Вермикомпост отличается от компоста пониженной эффективностью гидролаз, что связано с подавлением развития грибного мицелия и стимуляцией микробов г-стратегов.

Обычно в почвенной энзимологии используют один параметр — ¥тах — максимальную скорость реакции, отражающую потенциал ферментативной активности [7]. Однако информативно употреблять все параметры, получаемые из уравнения Михаэли-са—Ментен, поскольку с их помощью описывается поведение пула гидролитических ферментов в вер-микомпостах и компостах с высокой точностью. Это

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Кожевин П.А. Микробные популяции в природе. М., 1989.

2. Кожевина Л.С., Кожевин П.А., Кофф Г.Л. О возможностях микробиологической характеристики почв и грунтов сейсмоопасных территорий для геодинамической и санитарно-эпидемиологической оценки и прогноза // Прикладная геоэкология, чрезвычайные ситуации, земельный кадастр и мониторинг. Вып. 1. М., 1995.

3. Кузьмина Н.В. Комплексная оценка вермикомпоста в агроценозе с овощными культурами: Автореф. канд. дис. М., 2005.

80

70

■10 u-'-'-'-'-1-1-'-1-'-'-'-1-1-'-ü

0 3 6 9 12 15 18 21 24 27 30

Время инкубации, сут.

Рис. 4. Динамика длины грибного мицелия на стеклах обрастания в ходе сукцессии, инициированной высушиванием—увлажнением готового вермикомпоста: 1 — грибной мицелий, 2 — актиноми-цетный мицелий

Vmax — функция от активной микробной биомассы, Km — состав ферментов, Vmax/Km — отражающее реальную скорость протекания процесса (в ненасыщенных субстратом реакции условиях). Константа Михаэлиса характеризует не столько стадию микробной сукцессии (отношение г/К стратеги в микробной биомассе), сколько отношение грибы/ прокариоты. В готовом вермикомпосте, не подвергнутом полному высушиванию, подавляется развитие грибного мицелия. Процесс омоложения микробной биомассы (на примере высушивания—увлажнения) приводит к его развитию, что, в свою очередь, вызывает необратимое повышение эффективности гидролитических ферментов. Наблюдаемые необратимые изменения в микробном сообществе отчасти объясняют, почему производители полностью не высушивают готовый вермикомпост, считая это вредным для его качества.

Можно рекомендовать метод определения гидро-лазной активности по реакции гидролиза диацетата флюоресцеина для проверки готовности вермикомпоста, контроля за процессом вермикомпостирования и качеством готового вермикомпоста, а также для характеристики состояния микробного сообщества.

4. Методы почвенной микробиологии и биохимии / Под ред. Д.Г. Звягинцева. М., 1992.

5. Терещенко Н.Н. Эколого-микробиологические аспекты вермикомпостирования. Новосибирск, 2003.

6. Филиппович Ю.Б. Основы биохимии. М., 1999.

7. Хазиев Ф.Х. Методы почвенной энзимологии. М., 2005.

8. Холодный Н.Г. Методы непосредственного наблюдения почвенной микрофлоры // Микробиология. 1935. Т. 4, вып. 2.

9. Carrasco-Leteliera L, Eguren G., Castineira C. et al. Preliminary study of prairies forested with Eucalyptus sp. at the

north-western Uruguayan soils // Environmental Pollution. 2004. N 127.

10. Haimi J., Huhta V. Comparison of composts produced from identical wastes by "vermistabilization" and conventional composting // Pedobiol. 1987. Vol. 30.

11. Hand P., Hayes W.A., Frankland J.C., Satchell J.E. Ver-micomposting of cow slurry // Pedobiol. 1988. Vol. 31.

12. Healey F.P. Slope of the Monod Equation as an Indicator of Advantage in Nutrient Competition // Microb. Ecol. 1980. N 5.

13. Tsuji T., Kawasaki Y., Takeshima S. et al. A new fluorescence staying assay for visualizing living microorganisms in soil // Applied and Environmental Microbiol. 1995. Vol. 61. N 9.

Сведения об авторах Поступила в редакцию 15.03.08

Якушев А.В., аспирант, кафедра биологии почв. Бызов Б.А., докт. биол. наук, кафедра биологии почв

HYDROLASES AS A MEASURE OF MICROBIAL ACTIVITIES

OF VERMICOMPOSTING SUBSTRATES

A.V. Yakushev, B.A. Byzov

Hydrolase's activities as measured by fluorescein diacetate (FDA) assay was used to quantify microbial activity in composts and vermicomposts using the earthworms, Eisenia fetida andrei, Apor-rectodea caliginosa and A. rosea made of cattle manure, leaves and turf. It was found that effectiveness of hydrolases (the Michaelis—Menten constant, Km) was lower in the vermicomposts as compared to composts which correlated to a decrease in fungal hyphal length. It is proposed to use measurement kinetics of FDA activity along with fungal hyphal length to characterize vermicomposting process by functional (activities) and structural (microbial biomass) approaches.

Key words: vermicomposts, fluorescein diacetate assay, bacteria, fungi.