CC BY
18
ГИБРИДИЗАЦИЯ ТУРЕЦКИХ И СЕВЕРОКАВКАЗСКИХ МОРФОТИПОВ СКУРНОЫЕСТША РАКАБШСА (МиЯШЬ) М-Е-БАЯЯ. - ВОЗБУДИТЕЛЯ РАКА КОРЫ КАШТАНА ПОСЕВНОГО
Гринько Нина Николаевна
Доктор биологических наук, главный научный сотрудник, Адлерская опытная станция - филиал ФГБНУ «ФИЦ Всероссийский институт генетических ресурсов растений имени Н.И.Вавилова», г. Сочи
Прогрессирующая деградация естественной популяции и порослевого молодняка в границах искусственного ареала каштана посевного (Castanea sativa Mill.) -ценной древесной, орехоплодной, декоративной, таннино-, витамино-, пыльце- и нектароносной лесной культуры в различных эколого-географических регионах мира, обусловлена эпифитотийным развитием рака, «некроза» или «ржавчины» коры. Возбудитель заболевания - раневой гриб Cryphonectria parasitica (MurriU) M. E. Barr., сохраняясь на растительных остатках и мертвой древесине, инфицирует поврежденные механически или насекомыми участки коры. Раком поражаются все надземные органы за исключением листьев. Вначале болезнь появляется на одной из ветвей кроны, а затем путем вторичных заражений распространяется по окружности ствола вниз дерева. Мицелий патогена, развиваясь в живой коре, камбиальном слое и тканях заболони, колонизирует сосуды. Происходит некротизация, гипертрофия, разрушение и отслаивание коры, с обратной стороны которой формируются бледно-бурые веерообразные сплетения мицелия C. parasitica. В некротических трещинах коры образуются многочисленные плодовые тела гриба в виде желтых или буровато-красных стром [10]. Существенное влияние на патогенез оказывают токсические метаболиты гриба, нарушающие водный потенциал растительных тканей и функции мембран клеток. Недостаточное водоснабжение, наряду с пробуждением спящих почек и обильным образованием «водяных побегов» по всей длине ствола, вызывает массовое отмирание кроны и боковых ветвей. Пораженное дерево погибает до момента распространения мицелия паразита в комлевую часть ствола.
Формированию новых очагов инфекции способствует вариабельность паразитических свойств и накопление агрессивных морфотипов в популяции гриба [4, с. 30; 6, с. 49]. Планетарный мониторинг микроэволюционных процессов в природных популяциях C. parasitica позволил выделить изоляты белой морфологии, содержащие в геноме плазмиды dsRNA. Гиповирулентные изоляты, отличающиеся медленным ростом, пониженной споруляцией и ослабленной агрессивностью, представляют практический интерес для биологического контроля рака коры каштана путем эволюции толерантности паразита к гипо-вирусу [12, с. 866]. Поскольку, варьирующий по штаммо-вому составу Cryphonectria hypovirus встречается в каштановых лесах спорадически, для инокуляции пораженных раком участков коры используют тестерные гиповирулентные изоляты [11, с. 378; 15, с. 200]. Успешная конверсия гиповируса возможна между вегетативно совместимыми изолятами паразита в популяциях с преобладанием бесполого типа размножения [13, с. 311; 15, с.192; 16, с. 279]. Оптимальная результативность достигается при многократной интродукции гиповируса, поскольку dsRNA в естественных популяциях паразита распространяется незначительно, а продуцируемые гиповирулент-ными изолятами пикноспоры формируют типичные высокоагрессивные клоны [13, с. 338; 14, с. 55].
В каштановых лесах Северокавказского региона нами обнаружены гиповирулентные изоляты C. parasitica
alb-морфотипа [4, с. 30], инвазированные штаммом гиповируса CHV1-EP713 [1, с. 10, 16]. В серии скрещиваний aur - агрессивных с alb - гиповирулентными изолятами установлена несовместимая реакция барраж [3; 4, с. 31]. На этом основании сделан вывод о блокировании трансмиссии гиповируса CHV1-EP713 из alb-гиповирулентных изолятов в aur-агрессивные системой вегетативной несовместимости [4, с. 32].
Цель исследований - гибридизация и выделение вегетативно совместимых групп морфотипов C. parasitica из причерноморского ареала каштана посевного Турции как ближайшего природно-климатического аналога Северного Кавказа.
Материалы и методы
В 2010-2012гг. поэтапно скрещивали 31 число изолятов C. parasitica: Турция -21 и Северный Кавказ -10. В первой серии опытов гибридизировали изоляты, выделенные из каштана посевного на севере Турции в Бартынской (Амасрынский, Бартынский, Хасанкадынский районы) и Зонгулдакской (Алаплынский район) областях. Изоляты, полученные из Московского государственного областного университета в процессе творческих контактов [1, с. 6], дифференцировали на высокоагрессивные aur-оранже-вые; среднеагрессивные lut- золотисто-желтые; гиповиру-лентные alb-беловатые [5, с. 46; 9]. Обозначили изоляты согласно территориально - географическим границам, в пределах которых осуществлялся сбор инфекционного материала: aur - Bal, Ba2, Bb3, Bh4, Bh5, Sa6, Sa7, Sa8, Sa9; lut - Ba10, Ball, Bb12, Sa13, Sa14, Sa15; alb - Bh16, Bh17, Sa18, Sa19, Sa20, Sa21. Во второй серии опытов попарно скрещивали турецкие и выделенные нами северокавказские изоляты, обозначенные начальными буквами локальных популяций (А- Адлерская, С- Сочинская, Кп-Краснополянская, Л- Лазаревская, Кр- Краснодарская) в соответствии с порядковыми коллекционными номерами: aur - А47, С32, Кп42, Л79, Кр61; lut - А12, С25, Кп14; alb - А2, А9 [2; 4, с. 29]. В опытах использовали картофельно-глюкозный агар, чашки Петри инкубировали в течение 30 сут. при 24-26°С. Типы взаимодействия изолятов классифицировали как антагонизм (барраж и бордюр), совместимость [7, с. 5-13]. Для распределения изолятов по типам взаимодействия использовали показатель частоты (p), рассчитанный от суммарного числа скрещиваемых комбинаций, принятого за 1. Частоту распределения морфотипов по анализируемым признакам оценивали с помощью индекса разнообразия Шеннона (Н) по формуле: H= - £pi ln pi, где pi - частота i-го морфотипа. Экспериментальные данные обрабатывали методами статистического анализа [8, с. 251] с использованием пакетов прикладных программ Excel и Statistica.
Результаты и обсуждение
Гибридизация морфотипов C. parasitica из Турции. Скрещивание изолятов выявило доминирование антагонистических реакций - барраж и бордюр. Барраж - разграничительная линия из мертвых клеток в зоне контакта двух колоний, фиксировался при сокультивировании изо-лятов независимо от их территориальной принадлежности. Перитеции в зонах барража не формировались, что
позволило отнести тестируемые изоляты к МАТ-1 типу спаривания. Наши данные не противоречат известным сведениям об отсутствии полового размножения в популяциях C. parasitica некоторых провинций Турции [12, с. 866]. Между показателями частоты распределения (p) изо-лятов по типам взаимодействия и индексом разнообразия Шеннона обнаружена высокая положительная корреляционная связь (Cr=0,97±0,08; P<0,001). Частота морфотипов с реакцией барраж достигала максимального уровня (p=0,88±0,04; Н=1,44), причем оказалась относительно выше в Зонгулдакской популяции по сравнению с Бартын-ской (Рис. 1). В комбинациях суммарных скрещиваний изолятов из обеих выборок выявлена предельно высокая частота индивидуумов (p=0,46±0,04) с реакцией барраж, при среднем значении индекса разнообразия Шеннона
(Н=0,52). Бордюр (отталкивание) - торможение роста изо-лятов к центру чашки Петри с отсутствием мицелия на границе между колониями, наблюдался при гибридизации изолятов из Бартынской популяции, а также в сочетаниях из обеих выборок. Вегетативная совместимость - сращивание колоний и отсутствие разграничительных линий, обнаружена в 14 сочетаниях морфотипов (p= 0,07±0,04; Н=0,37).
При гибридизации изолятов равнозначных и разнокачественных морфотипов во всех анализируемых сочетаниях формировался барраж. В комбинациях однотипных индивидуумов частота и индекс разнообразия Шеннона достигали максимального уровня среди высокоагрессивных морфотипов aur - aur (p=0,11±0,02; Н=0,35), а минимального - слабовирулентных alb-alb (Рис. 2).
0,8 -, 0,7 -0,6 -0,5 -0,4 -0,3 -0,2 -0,1 -0 -
J [J 1
а I б 1
б
б
а
а
2
3
0 IB II □ III
Рисунок 1. Типы реакций при гибридизации морфотипов Cryphonectria parasitica из Турции Условные обозначения: а - частота (p) морфотипа, б - индекс Шеннона. Реакции взаимодействия: I - барраж, II - бордюр, III - совместимость. Комбинации скрещивания морфотипов по популяциям: 1- Бартынская,
2 - Зонгулдакская, 3 - Бартынская + Зонгулдакская
В рознящихся группах морфотипов, превалировали комбинации aur - lut и aur - alb (p= 0,26±0,02; Н=0,51). Бордюр проявлялся в парах морфотипов aur - aur из обеих выборок при гибридизации изолятов Ba1+Ba2+Ba3, а также каждого из них с Bh4, Bh5 и Sa6. Совместимыми оказались сочетания морфотипов: lut-lut (Н=0,07) и albalb (Н=0,22). Характерно, что в комбинации морфотипов alb-alb выявлено сращивание изолятов: Bh16+Bh17 и каждого из них с Sa18; Sa18 + Sa19 с Sa20 и Sa21; Sa19 + Sa20 0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0
и Sa21; Sa20+Sa21. Можно предположить, что отсутствие совместимых комбинаций и наличие барража между некоторыми изолятами alb - морфотипа из Турции, свидетельствует в пользу их интерстерильности. Итак, линия барража предотвращает конверсию гиповирусов CHV1-EP721 и CHV1-euro7, идентифицированных в геноме Bh16 и Sa19 alb - морфотипа [1, с. 16], в aur - агрессивные изоляты C. parasitica.
aur-aur
aur-lut
aur-alb
lut-lut
alb-alb
0 I ЕВ II □ III
Рисунок 2. Типы реакций при гибридизации равнозначных и разнокачественных морфотипов
Cryphonectria parasitica из Турции Условные обозначения: а - частота (p) морфотипа, б - индекс Шеннона. Реакции взаимодействия:
I - барраж, II - бордюр, III - совместимость
б
а
а
а
Перекрестная гибридизация морфотипов из Турции и Северного Кавказа [2]. Сокультивирование равнозначных и разнокачественных морфотипов выявило преобладание реакции барраж (p=0,90±0,03; Н=2,17). Бордюр обнаружен в сочетаниях морфотипов lut - lut и alb - alb (Рис. 3). При этом в комбинациях морфотипов lut - lut антагонизм проявили изоляты: Ba10 + А12, Ba10 + С25 и Bb12 + С25. Совместимыми оказались только изоляты Ball, Sa13 и Sa15 с Кп14 из Краснополянской выборки. Нашими предыдущими исследованиями подтверждена вегетативная совместимость lut-lut морфотипов из северокавказской популяции [3]. Следовательно, lut - морфотипы из Турции и Северного Кавказа относятся к генетически различным индивидуумам. Не исключено, что вегетативная
несовместимость обусловлена также инфицированием изолятов lut-морфотипа Cryphonectria hypovirus, не относящимися к подтипу CHV1 и ранее не обнаруженными в Европе.
Таким образом, инвазия гиповируса CHV1-EP713 из alb - морфотипов северокавказской популяции в турецкие aur - агрессивные изоляты блокируется линией барража. Конверсия гиповирулентности возможна лишь при вегетативной гибридизации alb - морфотипов А2 и А9 из Северного Кавказа со среднеагрессивными lut - Ball, Sa13 и Sa15 и слабовирулентными alb - Sa20 и Sa21 из Турции.
0,6 -, 0,5 -0,4 -0,3 -0,2 -
0,1 -0
aur-aur
Ю I Я II □ III
Рисунок 3. Типы реакций при гибридизации равнозначных и разнокачественных морфотипов Cryphonectria
parasitica из Турции и Северного Кавказа Условные обозначения: а - частота (p) морфотипа, б - индекс Шеннона. Реакции взаимодействия:
I - барраж, II - бордюр, III - совместимость.
Анализ типов взаимодействия изолятов выявил наличие 9 VC-групп (Н=2,37) в локальных популяциях C. parasitica из Турции, среди которых вегетативно совместимыми оказались 2. Ранее, в скрещиваемых комбинациях турецких изолятов с европейскими гиповирулентными тестерами EU-1 и EU-2 выделено 2 VC-группы [11, с. 380]. Перекрестная гибридизация изолятов из Турции и Северного Кавказа подтвердила наличие 15VC-групп (Н=2,68), а совместимостью отличались 3. В локальных популяциях C. parasitica Северного Кавказа нами идентифицировано 38 мелких VC-групп, агрегированных в 6 VC-групп более высокого ранга, различающихся числом изолятов и типом вегетативной несовместимости. Варьирование числа VC-групп, вероятно, обусловлено штаммовыми различиями гиповирусов. Исследованиями подтверждена идентичность турецких и европейских штаммов CHV1-ЕР721 и CHV1-Euro7, незначительно влияющих на морфологические и паразитические признаки C. parasitica [1, с. 16; 15, с. 202]. Напротив, существенно преобразующий геном патогена высокоагрессивный гиповирус CHV1-ЕР713 [14, с. 60], обнаружен только в выделенных нами гиповирулент-ных изолятах alb - морфотипа на Северном Кавказе [3].
Результаты исследований объяснимы с точки зрения высокого уровня полиморфизма C. parasitica по генам вегетативной несовместимости. Функция вегетативной несовместимости у природных изолятов гриба контролируется шестью несцепленными vic - локусами, генетика которых сложна и недостаточно изучена [7, с. 112]. Определенное сочетание аллелей специфических локусов двух взаимодействующих изолятов обусловливает вегетатив-
ную несовместимость. Опытами in vitro доказано, что конверсия агрессивных штаммов в гиповирулентные обусловлена числом VC - локусов, по которым отличаются тестируемые изоляты. Различия изолятов по одной паре аллелей снижают, но не препятствуют миграции dsRNA, а по многим локусам - полностью предотвращают трансмиссию гиповирулентности. Показано, что не только географически удаленные популяции C. parasitica, но и формирующиеся на одной раковой опухоли, распадаются на значительное число вегетативно несовместимых VC-групп. Изолированность соседних колоний друг от друга обеспечивает внутривидовую дивергенцию, а накопление в геноме гиповируса [12, с. 866] препятствует половому скрещиванию изолятов паразита [7, с. 113]. В частности, азиатские популяции гриба по сравнению с европейскими и североамериканскими генетически более полиморфны, что подтверждает наличие выделенных в Японии и Китае нескольких десятков VC - групп. При этом VC- группы из Японии проявили совместимость с 64 VC- группами из Европы [16, с. 280].
Таким образом, нами впервые проведена вегетативная гибридизация морфотипов C. parasitica из Турции и Северного Кавказа. Доказано, что в турецкой популяции паразита трансмиссия гиповирусов CHV1-EP721 и CHV1-euro7 из alb-гиповирулентных в aur-агрессивные изоляты ингибируется наличием барьера вегетативной несовместимости - барраж или бордюр. Подтверждена возможность распространения фактора гиповирулентности путем конверсии штамма CHV1-EP713 из генома А2 и А9 alb -морфотипа Северного Кавказа в среднеагрессивные lut-изоляты C. parasitica Турции.
Список литературы
1. Белов А.А. Внутривидовой полиморфизм фитопа-тогенного гриба Cryphonectria parasitica в причерноморской части ареала каштана посевного (Castanea sativa)/ А.А. Белов // Автореф. дис. ... канд. биол. наук. М., 2010. - 19с.
2. Гибридизация изолятов C. parasitica (Северный Кавказ # Турция) - режим доступа к изд.: https://www.facebook.com/nina.grinko/photos_album s#
3. Гибридизация морфотипов Cryphonectria parasitica: Северный Кавказ - режим доступа к изд.: https:// www.facebook.com/nina.grinko/photos albums#
4. Гринько Н.Н. Внутривидовое разнообразие возбудителя рака каштана съедобного на Северном Кавказе/ Н.Н. Гринько// Вестник РАСХН, 2009. - №4. - С. 29 - 33.
5. Гринько Н.Н. Морфологическая изменчивость гриба Cryphonectria parasitica (МштШ) M.E.Barr. из Турции/ Н.Н. Гринько// Вюник Харьшвського нац. аграр. ун-ту iм. В.В.Докучаева: сер. «Фггопатолопя та ентомолопя». - Харшв, 2011. - №9. - С. 44-50.
6. Гринько Н.Н. Агрессивность внутривидовых структур гриба Cryphonectria parasitica (Murrill) M.E.Barr. из Турции/ Н.Н. Гринько // Вюник Харьшвського нац. аграр. ун-ту iм. В.В.Докучаева: сер. «Фггопатолопя та ентомолопя». - Харшв, 2012 -№11. - С. 46-51.
7. Дьяков Ю.Т. Вегетативная несовместимость у фи-топатогенных грибов/ Ю.Т. Дьяков, А.В. Долгова // М.: МГУ, 1995. - 161с.
8. Зайцев Г.Н. Математическая статистика в экспериментальной ботанике/ Г.Н. Зайцев// М.: Наука, 1984. - 424с.
9. Полиморфизм гриба Cryphonectria parasitica: Турция - режим доступа к изд.: https://www.facebook .com/nina.grinko/photos albums#
10. Рак коры каштана (Castanea sativa) - режим доступа к изд.: https://www.facebook. com/nina. grinko/ photos albums#
11. Çeliker N.M. Evalution of hypovirulent isolates of Cryphonectria parasitica for the biological control of chestnut blight in Turkey/ N.M. Çeliker, E. Onogur // Forest Snow and Landscape Res., 2001. - Vol. 76. - № 3. - C. 378 - 382.
12. Doken M.T. Chestnut blight and evalution of the feasibility of its biological control in the Aydin province, Turkey by using hypovirulence: I European Congress on chestnut castanea/ M.T. Doken, S. Açikgoz, O. Erincik //Acta Hortical, 2009. - P. 866.
13. Milgroom M. G. Biological control of chestnut blight with hypovirulence: A critical analys/ M. G. Milgroom, P. Cortesi // Ann. Reviem of Phytopathol.: Palo Alto (Calif.), 2004. - Vol. 42. - P. 311 - 338.
14. Robin C. Dominance of natural over released biological control agents of the chestnut blight fungus Cryphonectria parasitica in south - casters France is associated with fitness - related traits/ C. Robin, S. Lanz, A. Souteron, D. Rigling // Biol. Control., 2010. -Vol. 53. - № 1. - P. 55 - 61.
15. Linder-Basso D. Genome analysis of Cryphonectria hypovirus 4, the most common hypovirus species in North America /D. Linder-Basso, J. N. Dynek, B. I. Hillman // Virology, 2005. -Vol. 1. - № 337. -P. 192 -203.
16. Liu Y. C. High diversity of vegetative compatibility types in Cryphonectria parasitica in Japan and China/ Y. C. Liu, M. G. Milgroom // Mycologia, 2007. - Vol. 99. - № 2. - С. 29 - 33.
АНАЛИЗ ВИДОВОГО СОСТАВА МИЦЕТОФИЛЬНЫХ НАСЕКОМЫХ В ЛЕСАХ ТЮЛЬГАНСКОГО РАЙОНА ОРЕНБУРГСКОЙ ОБЛАСТИ
Калабкина Анастасия Ивановна
Аспирант кафедры общей биологии, Оренбургский Государственный Университет, г. Оренбург
Насекомые и грибы - неотъемлемый и существенный компонент лесных биогеоценозов. Роль их в жизни леса велика и многогранна, сложны их взаимосвязи между собой и с другими составляющими биоценозов.
Насекомые - наиболее богатый видами класс не только беспозвоночных животных, но и живых организмов вообще. В настоящее время известно более 1 млн. видов насекомых.
Мицетофильные насекомые - обитатели плодовых тел грибов.
До сегодняшнего дня группа мицетофильных насекомых остается малоизученной в Оренбургской области, что и предопределило актуальность данного исследования.
Большое разнообразие мицетофильных насекомых и их представленность в различных филогенетических ветвях отряда жесткокрылых указывают на выдающееся значение грибов в эволюции этих насекомых. Грибы, как отмечает Н.П. Кривошеина (1986) - уникальный пищевой субстрат, по биохимическому составу близкий скорее к продуктам животного, чем растительного происхождения, в то же время обмен веществ в грибах очень специфичен
и не соответствует ни животному, ни растительному типу. Многие соединения, в том числе биологически активные вещества, синтезируются только грибами. Химический состав грибов видоспецифичен, что оказывает влияние на состав комплексов мицетобионтов [4, с. 15].
Плодовые тела грибов - это своеобразный и разнородный по размерам, консистенции, биохимическому составу, срокам существования субстрат, который обуславливает специфические особенности многовидовых экологических группировок мицетофильных насекомых. В кар-пофоре гриба могут одновременно развиваться личинки нескольких видов жуков. При этом личинки разных видов жесткокрылых нередко приурочены к определенным частям плодового тела [10, с. 8].
Исследования мицетофильных насекомых проводились на протяжении трех полевых сезонов, в 2012 -2014 годах. В результате было собрано 307 экземпляров насекомых, относящихся к 17 видам из 8 семейств.
Сбор образцов грибов и насекомых, а также последующее определение мицетофильных насекомых осуществлялись по методике Б.В. Красуцкого (2007).
Список обнаруженных видов насекомых
