CC BY
89
Медицинская Иммунология 2005, Т. 7, Ms 5-6, стр 503-510 © 2005, СПб РО РААКИ
Оригинальные статьи
ГЕТЕРОСУБТИПИЧЕСКИЙ ИММУННЫЙ ОТВЕТ И ЗАЩИТА ОТ ВЫСОКОПАТОГЕННОГО ВИРУСА ГРИППА А (H5N1)
У МЫШЕЙ, ИММУНИЗИРОВАННЫХ ХОЛОДОАДАПТИРОВАННЫМ ВИРУСОМ ГРИППА А/ЛЕНИНГРАД/Ш/П^ЮЮ)
Рекстин А.Р., Дешева Ю.А., Лу Х.*, Александрова Г.И., Климов А.И.*, Кац Д.М.*, Руденко Л.Г.
НИИ экспериментальной медицины РАМН, Санкт-Петербург, Россия; * Центр по контролю за заболеваемостью, Атланта, США
Резюме. При изучении эффективности нового холодоадаптированного реассортантного штамма H5N2, кандидата в вакцинные штаммы, в отношении защиты от высоковирулентного вируса гриппа H5N1 на мышиной модели, была отмечена определенная степень перекрестной защиты после прививки самим донором аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (Лен/17 ca) (H2N2). Выживаемость животных, иммунизированных интраназально (и/н) в высокой дозе холодоадаптированным вирусом Лен/17 са составила 80% после интраназального заражения А/Гонконг/483/97 (Гк/483) (H5N1), проведенного через восемь недель после иммунизации. В то же время смертность среди контрольных животных, не подвергнутых вакцинации, составляла 100%. Изучены механизмы перекрестного иммунного ответа, которые могли объяснить выживание мышей после летальной инфекции Гк/483. Сыворотки от мышей иммунизированных и/н Лен/17 са не реагировали с вирусом H5N1 в реакциях нейтрализации и гемагглютинации. В то же время в сыворотках и бронхолаважной жидкости были обнаружены IgG и IgA антитела, которые реагировали в иммуноферментном анализе с гемагглютинином и нейраминидазой вирусов H5N1 1997 года выделения. Спленоциты мышей, иммунизированных и/н Лен/17 са продуцировали IL-2, IL-4, IL-5, IL-10 и IFNy после стимуляции in vitro инактивированным вирусом H5N1. Наши данные указывают на то, что перекрестный гуморальный и клеточный иммунитет, индуцируемый Лен/17 са может играть роль в выздоровлении после летальной H5N1 инфекции. Изучение механизмов гетеросубтипического иммунитета может помочь созданию новых вакцин против высоковирулентных щтаммов вирусов гриппа птиц.
Ключевые слова: гетеросубтипический иммунный ответ, живая гриппозная вакцина, вирусы гриппа птиц, пандемическая подготовка.
Rekstin A.R., DeshevaJ.A., Lu X., Alexandrova G.I., Klimov A.I., KatzJ.M., Rudenko L.G.
HETEROSUBTYPIC IMMUNE RESPONSE AND CROSS-PROTECTION AGAINST A HIGHLY PATHOGENIC A (H5N1) INFLUENZA VIRUS IN MICE IMMUNIZED WITH COLD-ADAPTED A/LENINGRAD/134/17/57 (H2N2) INFLUENZA VIRUS
Abstract. While investigating the efficacy of an H5N2 ca reassortant vaccine candidate in protecting against a lethal challenge with a highly pathogenic (HP) H5N1 virus in the mouse model, we observed a degree of cross_____________________________________________ protection provided by the ca Len/17 (H2N2) virus it-
Адрес для переписки:
Рекстин Андрей Роальдович,
197376, Санкт-Петербург, ул.Акад.Павлова, д.12, ГУ НИИ экспериментальной медицины РАМН. Тел.: (812)-234-42-92, факс (812)-234-94-89. E-mail: [email protected]
self. 80% of mice administered a high dose of attenuated Len/17 vaccine intranasally (i.n.) survived after a lethal challenge with A/Hong Kong/483/97 H5N1 virus. Therefore, we investigated the basis of the crossreactive immunity between H2N2 and H5N1 viruses that may have contributed to recovery from lethal HK/
503
Рекстин А.Р., Дешева Ю.А. и др.
Медицинская Иммунология
483 virus infection. Sera from mice immunized i.n. with Len/17 did not cross-react with HK/483 virus in neutralization or hemagglutination-inhibition assays, however IgG and IgA antibodies that cross-reacted with the hemagglutinin and neuraminidase of H5N1 1997 viruses were detected. Spleen cells from mice immunized i.n. with Len/17 vaccine showed enhanced production of IL-2, IL-4, IL-5, IL-10, and IFNy following in vitro stimulation with inactivated H5N1 virus. Our findings indicate that both cross-reactive humoral and cellular immunity induced by Len/17 H2N2 vaccine may plays a role in recovery from lethal H5N1 virus infection. A better understanding of the mechanisms of heterosubtypic immunity will improve vaccine design against HP avian influenza viruses. (Med. Immunol., 2005, vol.7, №5-6, pp503-510)
Введение
Высокопатогенные вирусы птичьего гриппа продолжают вызывать серьезное беспокойство с тех пор, как первые случаи тяжелого заболевания человека птичьим гриппом А(Н5Ш) со смертельным исходом были зарегистрированы в Гонконге в 1997 году [21]. В настоящее время создание безопасной и эффективной гриппозной вакцины для людей против высокопатогенных А(Н5Ш) вирусов является одним из приоритетов Всемирной Организации Здравоохранения и национальных Центров по контролю за гриппом. Для решения этой задачи были применены различные подходы, включая получение реассор-тантных вакцинных штаммов с генетически модифицированным гемагглютинином в составе живого или инактивированного донорского штамма, или использование антигенно близкого непатогенного вируса для производства инактивированной вакцины [7, 11, 17, 18, 20, 22]. Было показано, что живые гриппозные вакцины имеют ряд преимуществ в профилактике гриппа, так как обеспечивают более широкую и эффективную защиту, вероятно благодаря их способности формировать сбалансированный гуморальный и клеточный иммунный ответ [1, 2]. Живые гриппозные вакцины используются в России достаточно давно, безвредны даже для маленьких детей и высоко эффективны при вакцинации различных возрастных групп населения: детей, взрослых и престарелых лиц [14, 15]. Недавно было сообщено ещё об одном новом подходе к созданию живых вакцин против пандемически опасных вариантов вирусов гриппа. Был получен холодоадаптированный (са-cold-adapted) реассортантный штамм, содержащий ген ге-магглютинина от непатогенного вируса гриппа птиц А(Н5№), а остальные гены от донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) [4].
В процессе изучения эффективности указанного A(H5N2) реассортанта - кандидата в вакцинные штаммы - на мышиной модели против летальной инфекции высокопатогенным вирусом гриппа A(H5N1) наблюдалась определенная степень перекрестной защиты, формируемая после прививки самим донорским штаммом.
Целью настоящего исследования являлось изучение эффективности перекрестной защиты и гете-росубтипического иммунного ответа у мышей после иммунизации холодоадаптированным вирусом гриппа А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) к высокопато-
генному птичьему вирусу гриппа А/Гонконг/483/97 (H5N1).
Материалы и методы
Вирусы. В работе были использованы следующие вирусы гриппа: эпидемический вирус А/Ленинград/ 134/57 (H2N2) (Лен/wt) (wt-wild-type), холодоадаптированный А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) (Лен/ 17ca); апатогенный вирус А/утка/Потсдам/1402-6/ 86 (H5N2) (H5N2/wt) и высокопатогенные вирусы гриппа A(H5N1): А/Гонконг/483/97 (ГК/483), А/ Гонконг/156/97 (ГК/156) и А/Гонконг/213/03 (ГК/ 213). Вирусы выращивали в аллантоисной полости 10-дневных куриных эмбрионов при 34°С (для вирусов серотипа А(Н2№)) или при 37°С (для вирусов серотипов А(Н5№) и А(Н5Ш)). Вируссодержащие аллантоисные жидкости собирали спустя 26 (вирусы H5) или 48 часов (H2N2 вирусы). Инфекционные аллантоисные жидкости замораживали при -70°С. Пятидесяти процентную эмбриональную инфекционную дозу (ЭИД^) определяли путем титрования десятикратных разведений вирусов на куриных эмбрионах с последующим подсчетом результатов по методу Рида и Минча [12].
Животные и иммунизация. Для всех экспериментов использовали самок линейных мышей BALB/c в возрасте 6-8 недель. Мышей иммунизировали ин-траназально по 50 мкл на мышь под легкой анестезией в дозе 107, 106 ЭИД5(). Контрольные животные получали по 50 мкл фосфатно-солевого буфера инт-раназально. На третий и пятый день после заражения вирусами А(Н2№) у трех мышей из группы получали гомогенаты легких и носовых ходов. Инфекционную активность вирусов в образцах определяли путем титрования на куриных эмбрионах [9]. Каждый образец титровали отдельно. Титр вируса выражали как среднее арифметическое log ЭИД / мл ± стандартное отклонение.
Экспериментальная инфекция. Через восемь недель после иммунизации мышам вводили под легкой анестезией 50 мкл фосфатно-солевого буфера, содержащего 10 мышиных 50% летальных доз (LDso) вируса А/Гонконг/483/97 (H5N1). В течение 14 дней после инфицирования у животных проводили учет смертности и потери веса.
Серологические методы. Через четыре и шесть недель после иммунизации у мышей получали сы-
504
2005, Т. 7, № 5-6
Гетеросубтипический иммунный ответ
воротки и смывы нижних дыхательных путей [5]. Сыворотки прогревали 1 час при 56°С и обрабатывали экстрактом нейраминидазы авирулентного штамма холерного вибриона (Denka-Seiken, Со, Япония) для удаления термолабильных и термостабильных ингибиторов гемагглютинации. Реакцию торможения гемагглютинации (РТГА) проводили с использованием 4 ГАЕ вирусов и 0,5% суспензии эритроцитов индюка [6]. IgG и IgA антитела в сыворотках и смывах нижних дыхательных путей определяли в реакции твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА), как описано ранее [5], за исключением того, что для сорбции использовали 1мкг/мл рекомбинантного гемагглютинина H5 ГК/156 или рекомбинантной нейраминидазы N1 ГК/483 (Protein Sciences Co., США). Титр антител выражали в десятичных логарифмах величины обратной наибольшему разведению образца, оптическая плотность которого при длине волны 490 нм превышала среднюю оптическую плотность в контрольных образцах бо-
лее чем на три стандартных отклонения. Титр нейтрализующих антител определяли в тесте микронейтрализации, как описано ранее [13] и выражали как обратное наибольшему разведению образца, дающего 50% нейтрализации ста 50% тканевых цитопатических инфекционных доз (ТЦИД^) вируса.
Определение цитокинов. Спустя шесть недель после иммунизации, у пяти мышей из каждой группы были получены суспензии клеток селезенки. 5x106/мл спленоцитов стимулировали либо инактивированным формалином цельновирионным ГК/213 в дозе 5 гемагглютинирующих единиц, либо рекомбинантным гемагглютинином ГК/156 в дозе 250 нг. Надосадочные жидкости собирали после 5 дней культивирования и замораживали при -70°С. Интерлейкин 2 (IL-2), интерферон-у (IFN-y), интерлейкин-5 (IL-5) и интерлейкин-10 (IL-10) определяли в образцах с помощью тест-систем Bio-Plex и оборудования Bio-Rad Laboratories (США) в соответствии с инструкциями производителя.
с
2
-ъ
ОТ
<0
О)
8,00
7.00
6.00 5,00 4 3 2 1
0,00
,00
,00
,00
,00
3 5
Сутки после инокуляции
□ Лен/wt
□ Лен/17 са
Б
Рис.1. Репродукция эпидемического и холодоадаптированного вирусов гриппа A(H2N2) в респираторном тракте мышей: А) в верхних отделах; Б) в нижних отделах. Гомогенаты легких и носовых ходов получены от трех мышей из группы. Представлены средние величины инфекционной активности вирусов ± стандартное отклонение. Предел чувствительности метода 1015 ЭИД50/мл.
505
Рекстин А.Р., Дешева Ю.А. и др.
Медицинская Иммунология
■ Лен/1 7са H5N2/wt Контроль
Лен/17са
H5N2/wt
Контроль
А
Б
Рис.2. Выживаемость (А) и снижение веса (Б) у мышей после интраназального заражения 10 ЛД50 А/Гонконг/483/97 (H5N1).
Группы из пяти животных наблюдали в течение 14 дней.
Результаты
Репродукция вирусов А/Ленинград/134/57 (H2 N2)-wt и А/Ленинград/134/17/57 (H2N2)- ca в респираторном тракте мышей. Уровни репродукции вирусов в верхнем и нижнем отделах респираторного тракта мышей представлены на рис.1. Репродукция вирусов зависела от свойств вируса, заражающей дозы и времени после заражения. Эпидемический вирус Лен/wt активно и более длительное время (до 5 суток после инфекции) репродуцировался в легких мышей до уровней 4,5-6,0 ^ЭИД /мл. Репродукция температуро-чувствительного холодоадаптированного вируса Лен/^ca в легких мышей была значительно ниже по сравнению с уровнями репродукции дикого вируса и на 3, и на 5 сутки после инт-раназальной иммунизации. Этот факт объясняется сниженной способностью вируса Лен/17са к росту при повышенных температурах в легких мышей. Напротив, в верхних дыхательных путях (носовых ходах) вирус Лен/17са репродуцировался в одинаковой степени с эпидемическим вирусом.
Защита против летальной инфекции вирусом гриппа А(H5N1). Спустя 8 недель после иммунизации, мышам вводили интраназально высокопатоген-
ный вирус гриппа А/Гонконг/483/97 (H5N1) в дозе 10 ЛД . На рис.2 представлены выживаемость и потери веса животных в течение 14 суток после летальной инфекции. Несмотря на то, что мыши, иммунизированные Лен/17са демонстрировали определенное снижение веса, 80 % животных были защищены от смертельной инфекции и выживали. Напротив, все неиммунизированные контрольные животные погибали к 8 суткам после экспериментальной инфекции, в то время как интраназальное введение апатогенного вируса H5N2/wt полностью защищало животных от инфекции и смерти от ГК/483 (H5N1).
Системный и местный гуморальный иммунный ответ. Для изучения механизма защитного эффекта, обеспечиваемого прививкой Лен/17са, был предпринят анализ формируемого гуморального ответа по сравнению с иммунизацией H5N2/wt (ТаблЛ). Несмотря на то, что интраназальная иммунизация мышей Лен/17са индуцировала значительные уровни нейтрализующих антител к гомологичному вирусу, перекрестно-реагирующих антител к вирусам H5N1 в РТГА и реакции нейтрализации у этой группы животных выявлено не было. В то же время им-
506
2005, Т. 7, № 5-6
Гетеросубтипический иммунный ответ
А
Б
В
Рис.3. Продукция цитокинов (нг/мл) in vitro спленоцитами, стимулированными вирусами гриппа A(H5N1).
А) IL-2, Б) IL-5, В) IL-10, Г) IFNy.
Табл. 1. ХАРАКТЕРИСТИКА ПЕРЕКРЕСТНО РЕАГИРУЮЩИХ АНТИТЕЛ К ВИРУСАМ ГРИППА A(H2N2) И A(H5N1)
Г руппа Сыворотки * Смывы нижних дыхательных путей
Лен/17са ГК/156 rHA** rNA*** rHA
РТГА Нейтр. РТГА Нейтр. IgG IgA IgG IgA IgG IgA
Лен/17са 12 120 <10 <30 2,8 2,7 2,6 2,1 1,2 0,5
H5N2/wt <10 <30 16 480 5,4 4,0 3,1 <2 3,4 2,2
Контроль <10 <30 <10 <30 <2 <2 <2 <2 <0,3 <0,3
* В реакции торможения гемагглютинации и ИФА результаты представлены как средний титр в группе из пяти мышей. В реакции нейтрализации тестировали объединенные сыворотки от пяти мышей из каждой группы.
** рекомбинантный гемагглютинин H5 ГК/156.
*** рекомбинантная нейраминидаза N1 ГК/483
507
Рекстин А.Р., Дешева Ю.А. и др.
Медицинская Иммунология
мунизация мышей H5N2/wt индуцировала нейтрализующие антитела, которые реагировали с высокопатогенным H5N1 вирусом. Для дальнейшего изучения гуморального иммунного ответа, индуцируемого Лен/17са сыворотки и бронхолаважные смывы были изучены на наличие специфических IgG и IgA антител к рекомбинантным гемагглютинину H5 и нейраминидазе N1 в иммуноферментном анализе (ИФА). Как следует из данных табл.1, специфические IgG и IgA к гемагглютинину H5 были обнаружены в сыворотках мышей, иммунизированных Лен/17са, но в 400 и, соответственно, 20 раз меньших титрах, по сравнению с титрами, обнаруженными в сыворотках мышей, получивших H5N2/wt вирус. Специфические IgG, но не IgA антитела, к ней-раминидазе N1 были также обнаружены у мышей, привитых как Лен/17са, так и H5N2/wt.
Вирусиндуцированная продукция цитокинов. Для оценки клеточного иммунного ответа, формируемого иммунизацией вирусами Лен/17са и H5N2/wt, была изучена продукция цитокинов спленоцитами мышей после рестимуляции вирусными антигенами in vitro. Клетки мышей, иммунизированных Лен/17са продуцировали значительные количества IL-2, IFN-y, IL-5 и IL-10 после стимуляции in vitro инактивированным цельновирионным А/Гонконг/ 213/03 (H5N1), но в меньшей степени, чем лимфоциты мышей, получивших вирус H5N2/wt (Рис.3). Напротив, стимуляция тех же популяций лимфоцитов очищенным гемагглютинином H5 ГК/156 не вызывала заметного увеличения продукции указанных цитокинов у мышей, иммунизированных Лен/ 17са, в то время как клетки мышей, иммунизированных H5N2/wt отвечали значительной продукцией цитокинов. Эти данные указывают на то, что иммунизация мышей холодоадаптированным вирусом Лен/17са вызывала стимуляцию Т-лимфоци-тов, перекрестнореагирующих на эпитопы, присутствующие в целом вирионе, а не в очищенном ге-магглютинине H5.
Обсуждение
Заражение одним подтипом вируса гриппа А может вызывать частичную защиту против последующей инфекции вирусом другого подтипа. Это явление носит название гетеросубтипического или перекрестного иммунного ответа [3, 8]. У животных проявления гетеросубтипического иммунитета включают снижение титров инфекционного вируса в легких после экспериментальной инфекции, уменьшение тяжести инфекции и сокращение длительности выделения инфекционного вируса. Гетеросубти-пический иммунный ответ связывают, с одной стороны, с продукцией секреторных IgA в респираторном тракте, а с другой стороны, со стимуляцией CD8+ цитотоксических Т-лимфоцитов, которые могут рас-
познавать специфические эпитопы, общие для большинства вирусов гриппа А, внутренних белков ви-риона, таких как нуклеопротеин и матриксный белок [10, 19, 23, 24].
Отмечено, что иммунитет, формируемый после естественной инфекции, характеризуется большей перекрестной реактивностью и перекрестной защитой против вирусов одного подтипа, или же других подтипов, по сравнению с иммунитетом, формируемым после вакцинации [15, 21]. Применяемые в настоящее время для профилактики гриппа инактивированные вакцины, предназначенные для внутримышечного введения, индуцируют значительные уровни сывороточных антител, при минимальных изменениях местного мукозального иммунитета, и, таким образом, не предотвращают первоначальную репродукцию вируса в респираторном тракте. В экспериментах на животных показано, что инактивированные вакцины могут стимулировать гетеросубтипи-ческий иммунный ответ, в том числе против пандемически опасных вирусов гриппа, при условии инт-раназального пути введения и при применении различных адъювантов [19, 20].
Живые аттенуированные гриппозные вакцины представляют альтернативный и потенциально высокоэффективный способ стимуляции гетеросубти-пического иммунного ответа, поскольку имитируют естественную инфекцию в верхних отделах респираторного тракта. Эндогенный путь презентации антигена при вакцинации живым вакцинным вирусом способствует сбалансированной стимуляции как CD8+ цитотоксических Т-лимфоцитов, так и местного гуморального иммунного ответа.
В настоящем исследовании впервые была продемонстрирована перекрестная защита и гетеросубти-пический иммунный ответ к высопатогенному вирусу гриппа А/Гонконг/483/97 (H5N1) после интра-назальной иммунизации мышей холодадаптирован-ным аттенуированным вирусом А/Ленинград/134/ 17/57 (H2N2). Восемьдесят процентов животных, получивших прививку холодоадаптированным вирусом были защищены от последующей смертельной инфекции 10 ЛД А/Гонконг/483/97 (H5N1). Изучение механизмов гетеросубтипическиго иммунитета показало, что несмотря на то, что перекрестно-реагирующих антител в сыворотке к вирусу гриппа А(ШШ) в реакциях РТГА и нейтрализации выявлено не было, были обнаружены специфические антитела к гемагглютинину и в меньшей степени к нейраминидазе в сыворотках и смывах нижнего респираторного тракта. Кроме того, интраназальная иммунизация мышей вирусом Лен/17са (H2N2) приводила к стимуляции перекрестно-реагирующих T-лимфоцитов, выражающейся в продукции как Th1, так и Th2 цитокинов. Таким образом защита против летальной инфекции А(ЖШ) была связана с перекрестно-реактивным гуморальным и клеточ-
508
2005, Т. 7, № 5-6
Гетеросубтипический иммунный ответ
ным иммунным ответом, сформировавшимся после прививки аттенуированным холодоадаптированным вирусом А/Ленинград/134/17/57 (H2N2).
Список литературы
1. Александрова Г.И., Климов А.И. Живая вакцина против гриппа.- СПб, Наука, 1994.- 151с.
2. Belshe R.B., Mendelman P.M. Safety and efficacy of live attenuated, cold-adapted, influenza vaccine -trivalent// Immunol. Allergy Clin. North Am. - 2003. -Vol. 23.- P. 745-767.
3. Epstein S.L., Lo C., Misplon J.A., Lawson C.M., Hendrickson B.A., Max E.E., Subbarao K. Mechanisms of heterosubtypic immunity to lethal influenza A virus infection in fully immunocompetent, T cell depleted, в -microglobulin-deficient, and J chain-deficient mice//
J.Immunol. - 1997. - Vol.158. - P.1222-1230.
4. Desheva J.A., Rudenko L.G., Alexandrova G.I., Lu X., Rekstin A.R., Katz J.M., Cox N.J., Klimov A.I. Reassortment between avian apathogenic and human attenuated cold-adapted viruses as an approach for preparing influenza pandemic vaccines// Options for the Control of Influenza V/ International Congress Series 1263/ ed. Kawaoka Y. - 2004. - P.724-727.
5. Katz J.M., Lu X., Young S.A., Galphin J.C. Adjuvant activity of the heat-labile enterotoxin from enterotoxigenic Escherichia coli for oral administration of inactivated influenza virus vaccine// J.Infect.Dis. - 1997.
- Vol.175. - P.352-363.
6. Kendal A.P., Skehel J.J., Pereira M.S. Concepts and procedures for laboratory based influenza surveil-lance/ ed. US Public Health Service, Atlanta, CDC. -1982. - P.B17-35.
7. Li S., Liu C., Klimov A., Subbarao K., Perdue M.L., Mo D., Ji Y., Woods L., Hietala S., Bryant M. Recombinant influenza A virus vaccines for the pandemic human A/Hong Kong/97 (H5N1) viruses// J.Infec.Dis.
- 1999. - Vol.179. - P. 1132-1138.
8. Liang S, Mozdzanowska K., Pallandino G., Gerhard W. Heterosubtypic immunity to influenza type A virus in mice// J.Immunol. -1994. -Vol.152.- P.16531661.
9. Lu X., Tumpey T.M., Morken T., Zaki S.R., Katz
J.M. A mouse model for the evaluation of pathogenesis and immunity to influenza A(H5N1) viruses isolated from humans// J.Virol.-1999.- Vol.73.- P.5903-5911.
10. Nguyen H.H., Moldoveanu Z., Novak MJ. van Ginkel F.W., Ban E., Kiyono H., McGee J.R., Mestecky J. Heterosubypic immunity to lethal influenza A virus infection is associated with virus-specific CD8+ cytotoxic T lymphocyte responses induced in mucosa-associated tissues// Virology. - 1999. -Vol. 254. - P.50-60.
11. Nicholson K.G., Colegate A.E., Podda A., Stephenson I., Wood J., Ypma E., Zambon M.C. Safety and antigenicity of non-adjuvanted and MF59-adju-
vanted influenza A/Duck/Singapore/97 (H5N3) vaccine: a randomized trial of two potential vaccines against H5N1 influenza// Lancet. - 2001.- Vol. 357.- P.19371943.
12. Reed L.J., Munch H.A. A simple method of estimating fifty percent endpoints// Am.J.Hyg. -1938. -Vol.27. - P.493-497.
13. Rowe T., Aberharthy A.A., Hu-Primmer J., Thompson W.W., Lu X.H., Lim W., Fukuda K., Cox N.J., Katz J.M. Detection of antibody to avian influenza A(H5N1) virus in human serum by using a combination of serologic assays// J.Clin.Microbiol. - 1999. -Vol. 37. - P. 937-943.
14. Rudenko L.G., Arden N.H., Grigorieva E., Naychin A., Rekstin A., Klimov A.I., Donina S., Deshe-va J., Holman R.C., DeGuzman A.,Cox N.J., Katz J.D. Immunogenicity and efficacy of Russian live attenuated and U.S. inactivated influenza vaccines used alone and in combination in nursing home residents//Vac-cine.- 2001.- Vol.19.- P.308-318.
15. Rudenko L.G., Lonskaya N.I., Klimov A.I., Va-silieva R.I., Ramirez A. Clinical and epidemiological evaluation of live, cold-adapted influenza vaccine for 3-14 -years-olds// Bull.WHO. - 1996. - Vol.74.-P.77-84.
16. Schulman J.L., Kilbourne E.D. Induction of partial specific heterotypic immunity in mice by a single infection with influenza A virus// J.Bacteriol. - 1965. -Vol.89. -P.170.
17. Subbarao K., Chen H., Swayne D., Mingay L., Fodor E., Brownlee G., Xu X., Lu.X., Katz J., Cox N., Matsuoka Y. Evaluation of a genetically modified reas-sortant H5N1 influenza A virus vaccine candidate generated by plasmid-based reverse genetics// Virology.-2003.- Vol.305.- P. 192-200.
18. Takada A., Kuboki N., Okazaki K., Ninomiya A., Tanaka H., Itamura S., Nishimura H., Enami M., Tashiro M., Shortridge K.F., Kida H. Avirulent avian influenza virus as vaccine strain against a potential human pandemic// J.Virol. - 1999. - Vol. 73. -P.8303-8307.
19. Takada A., Matsushita S., Ninomiya A., Kawao-ka Y., Kida H. Intranasal immunization with formalin-inactivated virus vaccine induces a broad spectrum of heterosubtypic immunity against influenza A virus infection in mice//Vaccine. - 2003. - Vol.21. - P.32123218.
20. Tumpey T.M., Renshaw M., Clements J.D., Katz J.M. Mucosal delivery of inactivated influenza vaccine induces B-cell-dependent heterosubtypic cross-protection against lethal influenza A H5N1 virus infection// J.Virol. - 2001. - Vol.75. - P.5141-5150.
21. Webby R.J., Webster R.G. Are we ready for pandemic influenza?// Science.- 2004.- Vol.302.- P.15191522.
22. Webby R.J., Perez D.R., Coleman J.S., Guan Y., Knight J.H., Govorkova E.A., McClain-Moss
509
Рекстин А.Р., Дешева Ю.А. и др.
Медицинская Иммунология
L.R., Peiris J.S., Rehg J.E., Tuomanen E.I., Webster R.G. Responsiveness to a pandemic alert: use of reverse genetics for rapid development of influenza vaccines// Lancet.- 2004.- Vol. 363.- P.10991103.
23. Webster R.G., Askonas B.A. Cross-protection and cross-reactive cytotoxic T cells induced by influen-
za virus vaccines in mice // Eur.J.Immunol. - 1980.-Vol.10. -P.396-401.
24. Yap K.L., Ada G.L. The recovery of mice from influenza A virus infection: adoptive transfer of immunity with influenza virus-specific cytotoxic T lymphocytes recognizing a common virion antigen // Scand. J.Immunol.- 1978.- Vol.8.- P.413-420.
поступила в редакцию 20.03.2005 принята к печати 07.04.2005
510
