CC BY
22
Оригинальная статья / Original article
УДК 577.112, 661.124, 663.18, 636.085.13
DOI: http://dx.doi.org/10.21285/2227-2925-2019-9-2-288-301
Гетерологическая экспрессия и характеристика нового мутантного ДНК-связывающего белка из гипертермофильного микроорганизма Thermotoga naphthophila
© Д.В. Гришин, Д.Д. Жданов, Ю.А. Гладилина, М.В. Покровская, С.С. Александрова, Н.Н. Соколов
Научно-исследовательский институт биомедицинской химии им. В.Н. Ореховича, Москва, Российская Федерация
Резюме: Представлены данные по клонированию, гетерологической экспрессии и характеристике рекомбинантных гомологов ДНК-связывающего белка из гипертермофильного микроорганизма Thermotoga naphthophila (TnaDBP, TnaDBP-mut). Предварительно нуклеотидная последовательность исходного термостабильного белка TnaDBP подвергалась кодоновой оптимизации в соответствии с особенностями строения и работы системы нуклеинового обмена клеток мезофиль-ной бактерии Escherichia coli, использовавшейся в дальнейшем в качестве лабораторного штамма-продуцента. Сконструированы экспрессионные векторные конструкции, обеспечивающие эффективную продукцию белков TnaDBP и TnaDBP-mut в клетках E. coli. Подобраны оптимальные условия культивирования трансформированных штаммов для биосинтеза растворимой формы целевого белкового продукта. Проведено аэробное культивирование микроорганизмов в контролируемых условиях. Были изучены особенности кинетики роста трансформированных клеток E. coli BL21(DE3)[pET-TnaDBP-mut]. При этом продемонстрировано, что время выхода роста культуры E. coli BL21(DE3)[pET-TnaDBP-mut], продуцирующей мутантный ДНК-связывающий белок на стационарную фазу при культивировании в жидкой питательной среде, составляет до 10 ч после внесения индуктора. Предложена малостадийная схема очистки полученных белков с использованием процедуры термолизиса. Проведена предварительная оценка растворимости и термостабильности белка по его первичной аминокислотной последовательности. Рассмотрены потенциальные области применения рекомбинантных вариантов термостабильного ДНК-связываю-щего белка TnaDBP. По результатам работы стало очевидно, что благодаря уникальным физико-химическим свойствам подобные белки представляют большой интерес с биотехнологической точки зрения и могут найти применение в различных отраслях промышленности в качестве источников незаменимых L-аминокислот для культур эукариотических клеток в качестве основы для энтерального питания сельскохозяйственных животных, а также в качестве необходимой компонентной базы при разработке невирусных векторных систем и белков -носителей в области биомедицины и фундаментальной науки.
Ключевые слова: рекомбинантный белок, термостабильность, ДНК-связывающий белок, штамм-продуцент, экспрессия, биотехнология
Благодарности: Исследование выполнено при финансовой поддержке Российского научного фонда (проект № 16-16-04086).
Информация о статье: Дата поступления 7 ноября 2018 г.; дата принятия к печати 7 июня 2019 г.; дата онлайн-размещения 28 июня 2019 г.
Для цитирования: Гришин Д.В., Жданов Д.Д., Гладилина Ю.А., Покровская М.В., Александрова С.С., Соколов Н.Н. Гетерологическая экспрессия и характеристика нового мутантного ДНК-связывающего белка из гипертермофильного микроорганизма Thermotoga naphthophila // Известия вузов. Прикладная химия и биотехнология. 2019. Т. 9, N 2. С. 288-301. DOI: 10.21285/2227-2925-2019-9-2-288-301
Heterogeneous expression and characterization of a new mutant DNA-binding protein from the Thermotoga naphthophila hyperthermophilic microorganism
© Dmitry V. Grishin, Dmitry D. Zhdanov, Julia А. Gladilina, Marina V. Pokrovskaya, Svetlana S. Aleksandrova, Nikolai N. Sokolov
Institute of Biomedical Chemistry (IBMC) , Moscow, Russian Federation
Abstract: This paper presents data on cloning, heterogeneous expression and characterization of recombinant homologs of a DNA-binding protein contained in the Thermotoga naphthophila (TnaDBP, TnaDBP-mut) hyperthermophilic microorganism. Initially, the nucleotide sequence of the original thermostable TnaDBP protein was subjected to codon optimisation in accordance with the structural and operational features of the nucleic acid metabolism system of the Escherichia coli mesophilic bacterium subsequently used as a laboratory strain-producer. Expression vector constructs were designed to ensure efficient production of TnaDBP and TnaDBP-mut proteins in E. coli cells. Optimal conditions for the cultivation of transformed strains for the biosynthesis of the soluble form of the target protein product were selected. A trial aerobic cultivation of the microorganisms was carried out under controlled conditions. Specific features of the growth kine -tics for transformed E. coli BL21 (DE3) [pET-TnaDBP-mut] cells were studied. It shown that, under cultivation in a liquid nutrient medium, the E. coli BL21 (DE3) [pET-TnaDBP-mut] culture producing the mutant DNA-binding protein reaches the stationary growth phase 10 hours after the inducer has been administered. A scheme consisting of a few stages is proposed for purifying the obtained proteins using thermolysis. A preliminary assessment of the solubility and thermal stability of the protein according to its primary amino acid sequence was carried out. Possibilities for the practical application of recombinant variants of the thermostable TnaDBP DNA binding protein are considered. Our results evidently demonstrate that such proteins, due to their unique physicochemical properties, present great interest from a biotechnological point of view and can be used in various industries as sources of essential L-amino acids for cultures of eukaryotic cells as a basis for enteral nutrition of farm animals, as well as a necessary component base in the development of non-viral vector systems and carrier proteins in the field of bio-medicine and fundamental science.
Keywords: recombinant protein, thermal stability, DNA binding protein, producing strain, expression, biotechnology
Acknowledgements: The study was carried out with the financial support of the Russian Science Foundation (project no. 16-16-04086).
Information about the article: Received November 7, 2018; accepted for publication June 7, 2019; available online June 28, 2019.
For citation: Grishin D.V., Zhdanov D.D., Gladilina Ju.A., Pokrovskaya M.V., Aleksandrova S.S., Soko-lov N.N. Heterogeneous expression and characterization of a new mutant DNA-binding protein from the Thermotoga naphthophila hyperthermophilic microorganism. Izvestiya Vuzov. Prikladnaya Khimiya i Bio-tekhnologiya [Proceedings of Universities. Applied Chemistry and Biotechnology]. 2019, vol. 9, no. 2, pp. 288-301. (In Russian). DOI: 10.21285/2227-2925-2019-9-2-288-301
ВВЕДЕНИЕ
Объектом настоящего исследования является термостабильный ДНК-связывающий белок из Thermotoga naphthophila. Подобные полипептиды относятся к группе белков, связывающих одноцепочечную ДНК (single-strand binding protein - SSB). Они неспецифически взаимодействуют с одноцепочечными фрагментами ДНК, предотвращая комплементарное спаривание в процессе репликации и атаку со стороны внутриклеточных нуклеаз [1, 2.]. В большинстве слу-
чаев взаимодействие этих белков с ДНК носит стехиометрический характер.
Белки SSB обнаружены на всех уровнях таксономической организации - от вирусов до человека. По своей структуре они могут представлять собой как мономеры и димеры, так и гомотетрамеры [3-5].
В последние годы значительно возрос интерес к термостабильным полипептидам и белкам SSB. Фундаментально-научный интерес к термостабильным SSB связан с необходимостью
пополнения банка подобных молекул и углубления знаний об их функционировании и строении, что важно для понимания характера и динамики молекулярной эволюции. С другой стороны, их изучение может дать ответ на вопрос о причинах возникновения разных вариантов термостабильности белков, связанного, например, с особенностями расположения аминокислотных дуплексов в первичной структуре полипептида или с особенностями сложного фол-динга [6]. Данные исследования могут выявить причины утраты термостабильности у целого ряда белков термоустойчивых организмов и ее сохранения в некоторых белках у организмов, не относящихся к термофилам [7, 8].
Прикладной аспект изучения нативных и рекомбинантных ДНК-связывающих белков гипертермофилов обусловлен их большим потенциалом в различных областях аналитики и молекулярной биологии, разработкой на их основе невирусных векторных систем для адресной доставки функциональных фрагментов одноцепочечной ДНК [9], получением новых белков с заданными свойствами, упрощением технологической процедуры выделения белков, ценных с точки зрения кормовой и пищевой промышленности, и т.п. [10-12]. Всё это подчеркивает актуальность расширения библиотеки подобных полипептидов и углубления знаний об их строении и функционировании. Представленная работа посвящена биотехнологическим аспектам создания и характеристике рекомбинантных гомологов термостабильного ДНК-связывающего белка из Thermo-toga naphthophila как полипептида, потенциально ценного в качестве термостабильного белка для нужд биомедицины, сельского хозяйства и пищевой промышленности [12, 13], а также модельного белка, позволяющего расширить фундаментально-научные представления о молекулярной эволюции термостабильных и нуклеотидсвязывающих белков.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Биоинформационный анализ. Поиск гомологичных последовательностей, относящихся к целевым белкам, осуществляли в GenBank посредством BLAST-анализа с использованием интернет-ресурса NCBI (National Center for Biotechnology Information, США) [14]. Для выравнивания двух и более последовательностей мономеров ДНК или белков, а также для последующей визуализации гомологичных и негомологичных участков использовали программы DNASIS v 2.5 («Hitachi Software Endgineering Co., Ltd») и ClustalX v 1.8 [15]. Термодинамические характеристики структур комплементарных оли-гонуклеотидов рассчитывали с применением программ Oligo calculator [16] и DNASIS v 2.5. Рестрикционный анализ, вспомогательное виртуальное клонирование целевых генов и по-
строение карт рекомбинантных плазмид проводили с использованием программы Clone Manager 4.0. («Scientific & Educational Software», США). Для предварительной оценки термостбильности производили вычисления значений Tm Index (TI) [17] с помощью аналитической программы Tm Predictor (http://tm.life.nthu.edu.tw). Для предварительной оценки растворимости белков использовали программу Recombinant Protein Solubility Prediction (http://biotech.ou.edu/) [18].
Штаммы бактерий E. coli: BL21(DE3) (F- ompT gal dcm lon hsdSB(rB- mB-) A(DE3 [lacI lacUV5-T7 gene 1 indl sam7 nin5])) («Strata-gene», США). Культивирование клеток и их трансформацию осуществляли, как описано в работе [19].
Конструирование рекомбинантной ДНК. При конструировании за основу брали биоинформационно оптимизированные и аннотированные в GenBank нативные нуклеотидные и аминокислотные последовательности ДНК-свя-зывающих белков (KUK22843.1) из термофильного микроорганизма T. naphthophila. Генно-инженерные конструкции собирали и встраивали в коммерческие векторы серии pET («Novagen», США), как описано в [12, 20]. Правильность сборки кодирующих генов подтверждали ре-стрикционным картированием и ДНК-секвени-рованием (ЗАО «Евроген», Россия).
Выделение и элюция ДНК. Выделение плазмидной ДНК из бактериальных клеток проводили стандартным методом ДДС-щелочного лизиса [21]. Для элюции фрагментов ДНК из агарозного геля использовали набор «Gel Extraction Kit» («Qiagen», Германия) в соответствии с рекомендациями производителя.
Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) проводили на приборе Терцик («ДНК-технология», Россия). 25 мкл реакционной смеси содержали: 2,5 мкл 1X Phusion буфер («NEB», США), дНТФ в конечной концентрации 400 мкМ, 510-7 M каждого фланкирующего праймера (ForTna: 5'-ATGAGCTTCTTCAATAAAATCATTCTGATT-3', RevTna: 5-TTAGTGATGATACGGCGGTTCATCTTCGCTAA-3'), 1 мкл Phusion ДНК полимеразы («NEB»), 2-5 Е фермента на объем пробы. В качестве ДНК-матрицы использовали смеси олигонуклеотид-ных сборок. Параметры амплификации: 98 °C -30 с; (98 °C - 10 с, 65 °C - 30 с, 72 °C - 20 с)30; 72 °C - 5 мин; 10 °C - хранение. Режим амплификации - точный.
Аэробное культивирование микроорганизмов в контролируемых условиях. Глубинное культивирование проводили в биореакторах Bio-Flo110 («NBS», США), БИ0Р-0,1-0,25 (ОКБ ТБМ, г. Кириши) общим объемом 10-250 л (ЦКП ИБМХ, ЦКП ИБФМ РАН). Состав ростовой среды: трип-тон - 15 г/л; дрожжевой экстракт - 5 г/л; NaCL -5 г/л; ампициллин - 0,1 г/л; пеногаситель -0,1 мл/л. Оптимальный уровень рН всреднем составил 7,4, аэрации - 0,5 объема/об./мин, пере-
мешивания - 350 об./мин. При достижении культурой OD600 = 1-1,2 в качестве подпитки и индуктора асептически вносили смесь лактозы (2 г/л) и изопропил-8^-1-тиогалактопиранозид (ИПТГ) (0,02 г/л). После индукции температуру снижали до 28 °С. Динамику изменения морфологических характеристик клеток контролировали в фазово-контрастном микроскопе (*1000). Для определения накопления целевого продукта в биомассе клетки лизировали и проводили электрофорез в 15%-ном ДСН-ПААГ.
Получение целевых белков методом термолизиса. Осадки индуцированных клеток E.coli суспендировали в буфере «A» (20 mM Tris-HCl, pH (6,8-8,5), 50 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0,1% Triton X-100) из расчета 10% от объема культуры. Суспензию клеток в небольших объемах обрабатывали ультразвуком на приборе УЗДН2Т (Россия) в жестком режиме (22 кГц, 30-50 с), на льду. Разрушение больших объемов биомассы с целью выделения целевых белков проводили на гомогенизаторе высокого давления фирмы Bran&Luebbe модель SHL-05 (Германия). Применяли две ступени гомогенизации при рабочем диапазоне давлений 0-60 МПа (0-600 кг/см2) и производительности до 62 л/ч. За один цикл дезинтеграции процент разрушенных клеток составил более 95%. Затем пробы прогревали при 65-75 °С в течение 2030 мин, после чего клеточный дебрис и денатурировавшие белки удаляли центрифугированием. Для концентрирования термостабильных белков к супернатанту добавляли кристаллический сульфат аммония до концентрации 60-80% от насыщающей, смесь оставляли на 18-20 ч при +4 °С. Далее раствор осветляли центрифугированием, осадок передавали на лиофилизацию, либо растворяли в буфере «B» (20 mM Tris-HCl; pH = 7,5; 10 mM EDTA; 10% глицерин) и хранили при -20 °С. Концентрацию белка определяли по методу Бредфорда [22].
Определение молекулярной массы очищенного белка проводили с помощью электрофореза по методу Лэммли [23]. В качестве маркеров молекулярного веса использовали серию белковых стандартов производства «Thermo Fisher Scientific» (США).
Статистическая обработка результатов исследования проведена с использованием пакета стандартных программ Statistica 9.0 («StatSoft Inc.», США) и пакета программ, встроенных в платформу MEGA 6.0. Различия считали значимыми при р<0,05.
Питательные среды, растворы и реактивы. При проведении работы использованы коммерческие наборы для элюции, очистки и сборки фрагментов ДНК («Promega», США; «Qiagen», Германия; «NEB», США); коммерческие векторы серии pET («Novagen», США), синтетические фрагменты ДНК (ЗАО «Евро-ген», Россия), компоненты питательных сред и
реагенты для биохимии производства Sigma Aldrich, Panreac, Applichem, СибЭнзим и др.
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
Анализ исходных последовательностей. Первичная последовательность белка «дикого» типа TnaDBP (GenBank: KUK22843.1) содержала 141 минокислотный остаток с расчетной молекулярной массой 16,5 кДа. На рис. 1. представлено полноразмерное множественное выравнивание последовательностей SSB из различных термофильных микроорганизмов.
При множественном и попарном выравнивании последовательностей выявлены области максимальной гомологии, которые с наибольшей степенью вероятности вовлечены в обеспечение термостабильности белковой молекулы. Данная информация позволяет предсказать инвариантные участки и области, в которые при необходимости могут вноситься те или иные изменения. Очевидно, что белки SSB различных семейств термофилов обладают невысокой гомологией. Между тем наблюдается присутствие консервативных сайтов на всем протяжении последовательности. Следует отметить, что в середине молекулы и на С-конце выраженность гомологии несколько снижается, что указывает на возможность модификации полипептида в этой области без потери термостабильности и других важных нативных свойств.
Оптимизация нуклеотидных последовательностей термофильных белков. Нуклео-тидную последовательность исходного термостабильного белка TnaDBP подвергали кодоно-вой оптимизации [24-26] в соответствии с особенностями строения и работы системы нуклеинового обмена клеток мезофильной бактерии E. coli. При этом часть редких для данного микроорганизма минорных кодонов заменяли на синонимичные мажорные кодоны (рис. 2). Подобная оптимизация гена существенным образом не повлияла на конечный вид кодируемого им белка TnaDBP.
Помимо этого был спроектирован мутант-ный вариант белка TnaDBP, который в дальнейшем планировалось использовать в качестве кормового пептида и источника незаменимых L-аминокислот в культуральных средах при выращивании клеток эукариот. Суть данных модификаций сводилась к тому, чтобы, с одной стороны, сбалансировать некоторые ключевые нут-риентные L-аминокислоты, а с другой - избежать возможной утраты такого важного технологического параметра, как термостабильность (подробнее данная стратегия охарактеризована в [12]). В результате в первичной последовательности нативного белка были запланированы следующие изменения: 54 (N ^R); 65 (Т ^-А); 66 (G^R); 90 (S^ T); 112 (T^ A); 116 (S^N); 130 (S^C); 131 (G^C); 141 (F^Y).
10
IB—LIBSSFI ^gahSJEELV IB— -1ЛЗ8Я
¡JjEAVEEGKPY
IJeditkikdB ¡E—VDKVHS0 ÎÎS-FF®lB3 30-ffîSriBJ
60
SHS^kayE vhyiJatlwr îîBSipiBWr
QGPYLDGAIN
SevtigddtE
SEAWGDET^
ÏÎBSÎRfflSÎFS
110
10ЕНЙЗЫНЗ E^lj^EALAjS ЗИРРВЗПЬЕР
TLFj^AVRKG SLVj^GHIRLIJ T0YKGKVQLH
ИУВЗЗирВ
20 ¡o33vi
ьЕнУиШак ЯЙЗВЬШУН
L—FYDGLLA
------T05S
------K0GH
ПВЗПДШк ПВЗДДВ5|е
70
kh&WSÎRF рДИнмке-Я кШЗтсйынЯ QV—E0QG3Ï KV—105—0 RI—K0T—0 RIBBIFTCÎSBI RIBSIfarîCT 120
30
ТВьрКЫиМЦУ
IBHîpaBdaBl IBBsATOivfflBi SkSqeEket-Î3rvtiwgk2-euvïïitveE-
11Ш1МД
80
з1ЭЙуИ1Ш1»аИ
I®PBhihë КДЯтаЗЫЙ
ggda|Ekyip
WGDQASQ — WGNLAGT—
тДИИтЕИ
III
130
GAGEAS GY0
eert^M0Q3K
vßKYGSL^S A^SKS]
160
PBESeieklE ааш^З^СЕ
DFDÎ^FD0VF
—kdEqtvys —RSEPÜ—R
— GG^RG—E
13НИ------
13ИЭ------
170
KEEEKPFT—
lIJidqglddS 33lPEEFE0J PSIFAKKWV DH0—RÏ®T
rrSGERRSS I3B5sED—ifi BBfrrPD—T0
------SSGA
0ATPAA0RTQ
-------¡gSG
0WALDEEIAD D-EEVTEVH^ E-DHlII0EAj3
-------gPT
-------jgpV
180
—рЕШЭтВ PH—15ШРВЗ THIES^BDEB ЕДЯкЯ-ВЗ
ЕоЗЗГОЗ-ЕЕ rB335Isegee
----ЗВВЭРП
----зВВЭРП
40 SO
E5JL0Y3SRY KHQHßEFQEE SLSlfflEIJY 0DRQEQRQEK ВЯьИВЙЗ— NYVSQSGERP -0ELG^I¥A0 PLAHSVSENP -L5VGEPKT0 0TKFE3qRSV
-IEASEPj^ä BrKHEr-RTI ¡HJI^DI^P RraiAPj33AQT ¡EjI^DI^P RKHAPI33AQT 90 100
RLSQEKÜEKE -EK^fskvri
RLVWEGÜTDK D^hB^1^ SIQI^lftDDII ^NRHUYI^
I------QGE DE3D1®~I
А------RAG ETLAIGHGYfl
I------KS G IvijSlAlIAWT
ЕИШВДГР ЯВ355ЕВ5Р13В EMdiidMafro тШ^АШРЕИ
140 150
SJOA^E---------E|33VP
TAS@AARP-T 5EG0Q5QP5R
FGS@GN---------A&R
L0RKG(BlSv оДьДкИЕ DFDA5EKE0- EH1IFH-----
51ретЩз-- аВЗВЭ-----
ISrvBISB----------¡33el
ЭирЭЗо---------*L
190 200
E-..................
Y..................
s-..................
0т,J..................
ЕЁ..................
D0..................
В-..................
в-..................
50 50 50 50 50 50 50 50
00 00 00 00 00 00 00 00
50 50 50 50 50 50 50 50
200 200 200 200 200 200 200 200
Рис. 1. Множественное выравнивание аминокислотных последовательностей белков DBP (SSB) из различных термофильных микроорганизмов (затемненные области свидетельствуют о 100%-ной гомологии последовательности на данном отрезке)Л AaeDBP - Aquifex aeolicus; DraDBP - Deinococcus radiodurans; TinDBP - Thermoanaerobacter indiensis; TaqDBP - Thermus aquaticus; TacDBP - Thermoplasma acidophilum; SacDBP - Sulfolobus acidocaldarius; TneDBP - Thermotoga neapolitana; TnaDBP -Thermotoga naphthophila
Fig. 1. Multiple alignment of amino acid sequences of DBP (SSB) proteins from different thermophilic microorganisms (darkened bars mean 100% homology of the sequence at a given interval):
AaeDBP - Aquifex aeolicus; DraDBP - Deinococcus radiodurans; TinDBP - Thermoanaerobacter indiensis; TaqDBP - Thermus aquaticus; TacDBP - Thermoplasma acidophilum; SacDBP - Sulfolobus acidocaldarius; TneDBP - Thermotoga neapolitana; TnaDBP - Thermotoga naphthophila
Рис. 2. Выравнивание нуклеотидных последовательностей белка TnaDBP и оптимизированного варианта его мутантного гомолога TnaDBP-mut (затемненные области обозначают 100% идентичность последовательности на данном отрезке)
Fig. 2. Alignment of nucleotide sequences of TnaDBP protein and optimized variant of its mutant homologue TnaDBP-mut (darkened bars denote 100% identity of the sequence on this segment)
Конструирование экспрессионных векторов и молекулярное клонирование. Для оптимизации последующей процедуры субклонирования в начале гена был запланирован сайт узнавания для эндонуклеазы рестрикции NdeI (его частью в теле гена стал старт-кодон), в то время как на конце гена был добавлен сайт узнавания для рестриктазы HindIII, ставший частью стоп-кодона.
Внутренние и фланкирующие олигонуклео-тиды для получения целевых генов планировались на основе известной последовательности TnaDBP из T. Naphthophila, аннотированного в базе данных GenBank (No. KUK22843.1), и проведенных программных оптимизаций. Дизайн олигонуклеотидных праймеров для получения кодон-оптимизированной нуклеотидной последовательности гена de novo проведен с расче-
том перекрывания на 15-20 пар нуклеотидов. При этом планировали фрагменты ДНК размером 50-60 нуклеотидов из расчета один олиго-нуклеотидный дуплекс на каждые 100 п.н. целевого гена. Синтез олигонуклеотидов проводился ЗАО «Евроген» (Россия).
Синтетические гены TnaDBP и TnaDBP-mut были собраны из олигонуклеотидных дуплексов и клонированы в коммерческие векторы серии рЕТ. Для этого в состав экспрессионного вектора, содержащего высокоэффективные регуля-торные элементы - промотор фага Т7, специфично узнаваемый Т7-РНК-полимеразой, и Т7-терминатор транскрипции - вводили гены TnaDBP и TnaDBP-mut. В результате получали генно-инженерные конструкции pET-TnaDBP и pET-TnaDBP-mut (рис. 3).
(pET-TnaDBP)
Hindi II
I
Promoter T7SD TnaDBP Terminator
(pET-TnaDBP-mut) Ndel HindIII
I_
Promoter T7SD
TnaDBP-mut
Terminator
Рис. 3. Схемы генно-инженерных конструкций pET-TnaDBP и pET-TnaDBP-mut: Promoter T7 - промотор бактериофага T7; SD - сайт связывания рибосом или последовательность Шайна-Дальгарно; TnaDBP - нуклеотидная последовательность, кодирующая аутентичный ДНК-связывающий белок SSB T. naphthophila; TnaDBP-mut - нуклеотидная последовательность, кодирующая мутантный гомолог ДНК-связывающего белка SSB; Terminator - Т7-терминатор транксрипции
Fig. 3. Schemes of genetically engineered constructs pET-TnaDBP and pET-TnaDBP-mut: T7 Promoter - strong promoter from T7 bacteriophage; SD - ribosome-binding site or the Shine-Dalgarno sequence; TnaDBP - nucleotide sequence encoding a authentic DNA-binding protein SSB T. naphthophila; TnaDBP-mut - nucleotide sequence encoding a mutant homolog of the DNA-binding protein SSB; Terminator - T7 terminator of transcription
Компетентные клетки E. coli BL21 (DE3) трансформировали созданными экспрессион-ными плазмидами pET-TnaDBP и pET-TnaDBP-mut. Правильность субклонирования была проверена рестрикционным скринингом и ДНК-секвенированием.
Изучение экспрессии и определение молекулярной массы TnaDBP и TnaDBP-mut. Для культивирования трансформированных бактериальных клеток использовали среду Луриа-Бертани (LB). Индуцибельность рекомбинант-ных штаммов и уровень экспрессии целевых
белков были проверены после внесения в среду индуцирующей смеси ИПТГ и лактозы.
Анализ экспрессии конструкций в 15%-ом ДСН-ПААГ показал присутствие белковых зон ожидаемого молекулярного веса (16,5-17,5 кДа) в индуцированных клетках и их отсутствие в клетках без индукции (рис. 4). Концентрацию белка определяли по методу Бредфорда [23]. При этом выход мутантного белка TnaDBP-mut из 10-15-часовых культур клеток E. coli не уступал таковому для нативного гомолога (TnaDBP), составив около 20% от тотального белка клетки.
кДа
-— 40
--35
---25
-— 15
-— 10
Рис. 4. Контроль экспрессии белков TnaDBP и TnaDBP-mut в 15%-ом ДСН-ПААГ (объем проб, наносимых на один трек, - 5-6 мкл): 1 - E. coli BL21(DE3)[pETTnaDBP] (индукция, без прогрева);2 - E. coli BL21(DE3)[pETTnaDBP-mut-клон1] (индукция, без прогрева); 3 - E. coli BL21(DE3)[pETTnaDBP-mut-клон2] (индукция, без прогрева);4 - контроль E.coli BL21(DE3) (индукция, без прогрева);5 - маркер молекулярной массы Spectra Multicolor Broad Range Protein Ladder(«Thermo Scientific»)
Fig. 4. Control of TnaDBP and TnaDBP-mut protein expression in 15% SDS PAAG (the volume of the sample on one track was 5-6 yl): 1 - E. coli BL21(DE3)[pET TnaDBP] (induction, without heat treatment); 2 - E. coli BL21(DE3)[pETTnaDBP-mut-clone1] (induction, without heat treatment); 3 - E. coli BL21(DE3)[pETTnaDBP-mut-clone2] (induction, without heat treatment);4 - Control E.coli BL21(DE3) (induction, without heat treatment); 5 - Molecular weight marker Spectra Multicolor Broad Range Protein Ladder («Thermo Scientific»)
Изучение кинетики роста трансформированных клетокE coli BL21(DE3)[pET-TnaDBP-mut]. Время выхода роста культуры E. coli BL21(DE3)[pET-TnaDBP-mut], продуцирующей мутантный ДНК-связывающий белок на стационарную фазу при культивировании в жидкой питательной среде, составило около 10 ч после внесения индуктора (рис. 5).
Из данных, представленных в таблице, следует, что подобранные условия культивирова-
ния и индукции продуцента E. coli BL21(DE3) [pET-TnaDBP-mut] в биореакторах различного объема с использованием среды LB достаточно эффективны. Общее количество биомассы составляло до 21,5 г в пересчете на 1 л питательной среды. При этом выход очищенного TnaDBP-mut после применения методики термолизиса с осаждением сульфатом аммония и последующей лиофилизацией достигал 0,14 г с 1 г биомассы.
о о СО
cf О
9,0 8,0 7,0 6,0 5,0 4,0 3,0 2,0 1,0 0
3 5 7 9 12 15 18 Время культивирования, ч - ♦ - BL21 (DE3)[pET-TnaDBP-mut]
Рис. 5. Кинетика роста исследуемой культуры E. coli BL21(DE3)[pET-TnaDBP-mut]; p<0,05
Fig. 5. Growth kinetics of the studied culture of E. coli BL21(DE3)[pET-TnaDBP-mut], p<0,05
Результаты глубинного культивирования продуцентов и приготовления препаратов в ферментере с рабочим объемом 65 л
Results of submerged cultivation of producer strains and preparation of substances n the fermenter with a working volume of 65 liters
Продуцент Время роста, ч ОП600 Вес биомассы, г Вес целевого белка, г
BL21(DE3)[pET-TnaDBP-mut] 10,0 8,1 1400 200
Изучение растворимости и термостабильности рекомбинантных белков. Сайт-направленный мутагенез различным образом может отражаться на таких свойствах результирующего белка, как внутриклеточная растворимость, термостабильность и др. [27-29]. Ввиду этого целью данного этапа работ было изучение того, насколько сильно изменения, внесенные в нуклеотидную последовательность TnaDBP, отразились на некоторых важных свойствах му-тантного полипептида TnaDBP-mut.
Предварительная теоретическая оценка растворимости и термостабильности белка по его первичной аминокислотной последовательности была проведена при помощи аналитических программ Recombinant Protein Solubility
Prediction и Tm Predictor (TI). Для мутантного белка TnaDBP-mut расчетные значения растворимости превышали 95%, в то время как значения TI были выше единицы, что свидетельствует о потенциально высоких показателях внутриклеточной растворимости и термостабильности. Для проверки этих данных индуцированные клетки подвергали дезинтеграции и термолизису в буфере «А» в течение 20-40 мин при температуре 68-80 °С с последующим осаждением денатурировавших белков клетки-хозяина центрифугированием.
В результате исследований стало очевидно, что белок TnaDBP-mut, как и его природный аналог, имеет высокую цитозольную растворимость и термостабильность (рис. 6).
1 2 3 4 5 кДа
•• — 40
• — 35
m -— 25
16.5 —- mm e mm
Ш -—10
Рис. 6. Термостабильность белков TnaDBP и TnaDBP-mut в растворимой фракции в 15%-ом ДСН ПААГ (объем проб, наносимых на один трек, - 8-10 мкл): 1 - E. coli BL21(DE3)[pETTnaDBP] (индукция + прогрев 72 °С);
2 - E. coli BL21(DE3)[pETTnaDBP-mut-клон2] (индукция + прогрев 72 °С);
3 - E. coli BL21(DE3)[pET TnaDBP-mut-клон1] (индукция + прогрев 72 °С);
4 - контроль E.coli BL21(DE3) (индукция + прогрев 72оС); 5 - маркер молекулярной массы Spectra Multicolor Broad Range Protein Ladder(«Thermo Scientific»)
Fig. 6. Thermal stability of proteins TnaDBP and TnaDBP-mut in the soluble fraction in 15% SDS PAAG (the volume of the sample on one track was 8 - 10 yl): 1 - E. coli BL21(DE3)[pETTnaDBP] (induction, with heat treatment 72 °C);
2 - E. coli BL21 (DE3)[pETTnaDBP-mut-clone2] (induction, with heat treatment 72 °C);
3 - E. coli BL21(DE3)[pET TnaDBP-mut-clone1] (induction, with heat treatment 72 °C);
4 - Control E.coli BL21(DE3) (induction, with heat treatment 72 °C); 5 - Molecular weight marker Spectra Multicolor Broad Range Protein Ladder («Thermo Scientific»)
По данным, полученным при помощи программ Gel-Analysis (Helicon, Россия) и Adobe Photoshop cs2 (histogram option) (Adobe Systems, США), после термолиза более 90% белка концентрируется в растворимой фракции. Между тем внесенные в его структуру изменения привели к небольшому падению термостабильности: с 75-80 °С в нативном состоянии до 68-75 °С в мутантной форме. Указанные факты лишь незначительно расходятся с результатами предварительного биоинформатического прогнозирования.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
В настоящей работе представлены данные по получению и характеристике рекомбинант-ного ДНК-связывающего белка T. naphthophila (TnaDBP, 16,5 кДа) и его мутантного гомолога (TnaDBP-mut, 17,5 кДа). Показано, что внесенные изменения не оказали существенного воздействия на растворимость и термостабильность мутантного белка. Как и в случае белка дикого типа, для TnaDBP-mut наблюдались высокие показатели растворимости, сопоставимые с расчетными значениями. Термостабильность TnaDBP-mut по сравнению с исходным белком незначительно снизилась: белок без
потерь выдерживал прогревание в течение 20-30 мин в температурном диапазоне от 68 до 75 °С. Из картины электрофорезов следует, что процедура термолиза позволяет в диапазоне температур 68-75 °С избавиться более чем от 90% белков клетки-хозяина и добиться получения хорошо очищенного препарата целевого термостабильного белка (ТпаОВР-ти1). Была разработана малостадийная высокорентабельная методика выделения подобных белков с использованием стадии высокотемпературной обработки (термолизис). Данная методика приведена в виде блок-схемы на рис. 7.
Следует отметить, что полученный му-тантный белок обладает целым спектром свойств, важных для биомедицины, кормопроизводства и пищевой промышленности. К заявляемым ценным параметрам относятся: высокий уровень экспрессии (>20%), высокие показатели растворимости (>90%), простота очистки посредством термообработки (68-75 °С), наличие комплекса незаменимых Ь-аминокис-лот для человека и теплокровных животных и присутствие сайтов узнавания для большинства протеаз ЖКТ, что может определять его хорошую переваримость и усвояемость (рис. 8). Все сказанное свидетельствуют о возможности
его применения в качестве самостоятельного белка, имеющего биотехнологическую ценность, или «белка-носителя» для получения
важных для биомедицины полипептидов, ассоциированных с ним на генно-инженерном уровне.
Бионформационный дизайн и конструирование экспрессивного вектора
Е. со//экспрессия: трансформация, индукция
Наблюдаем кинетику роста
Термолизис
Осаждение белка из супернатаната сульфатом аммония
Диализ (при необходимости)
Изучение физико-химических и биологических свойств белка
Лиофилизация, получение белка в препаративных количествах
Рис. 7. Оптимизированная технологическая схема получения белка TnaDBP-mut с использованием этапа термолизиса
Fig. 7. Optimized technological scheme of the TnaDBP-mut protein obtaining with
the use of thermolysis stage
10 20 30 40 SO 60
HS FFNKIILIGRLVRD PEKRYTL S GTPVTTFTIAVDRVPRKNAPDDAQTTD FFRWTFCR
ChymoA Trypsin Trypsin ChymoA Trypsin ChymoA Trypsin ChymoA Trypsin
Trypsin Trypsin Trypsin
ChymoA ChymoA ChymoA Trypsin Trypsin
70
80
90
100
110
120
LAEFARTYLI^(jRLVLIEGEHRffi®IiffiTPT(jEHiVSPEWAIiVVRFM)FKPAETVHETE
ChymoA Trypsin Trypsin Trypsin Trypsin Trypsin Trypsin Trypsin ChymoA Trypsin
ChymoA
а л лл
Trypsin Chymosin ChymoA Trypsin
130 140
ELEIPEEDFCCDTFSEDEPPYHH
150
160
170
180
ChymoA ChymoA ChymoA
Рис. 8. Карта сайтов узнавания для различных протеолитических ферментов ЖКТ (трипсин, химотрипсин, химозин) в белке TnaDBP-mut (получена на основе расчетов в программе DNASIS v 2.5 («Hitachi Software Endgineering Co., Ltd»))
Fig. 8. Map of recognition sites for various proteolytic enzymes of the gastrointestinal tract (trypsin, chymotrypsin, chymosin) in the protein TnaDBP-mut, obtained on the basis of calculations in the program DNASIS v 2.5 («Hitachi Software Endgineering Co., Ltd»)
Таким образом, при использовании системы бактериальной экспрессии в клетках E. coli штамма BL21(DE3) получен мутантный гомолог природного ДНК-связывающего белка из гипертермофильного микроорганизма T. naphthophila. Подобраны оптимальные условия культивирования продуцента для биосинтеза растворимой
1. Alberts B., Johnson A., Lewis J., Raff M., Roberts K., Walter P. Molecular Biology of the Cell. Garland Science, 2008. 1392 p.
2. Perales C., Cava F., Meyer W.J.J., Berenguer J. Enhancement of DNA, cDNA synthesis and fidelity at high temperatures by a dimeric single-stranded DNA-binding protein // Nucleic Acids Research. 2003. Vol. 31. P. 6473-6480. DOI: 10.1093/nar/gkg865
3. Olszewski M., Grot A., Wojciechowski M., Nowak M., Mickiewicz M., Kur J. Characterization of exceptionally thermostable single-stranded DNA-binding proteins from Thermotoga maritima and Thermotoga neapolitana // BMC Microbiology. 2010. Vol. 10. P. 260. DOI: 10.1186/1471-2180-10-260.
4. Cernooka E., Rumnieks J., Tars K., Kazaks A. Structural Basis for DNA Recognition of a Single-stranded DNA-binding Protein from Enterobacter Phage Enc34 // Scientific Reports. 2017. Vol. 7. Issue 1. P. 15529. DOI: 10.1038/s41598-017-15774-y
5. Kur J., Olszewski M., Dtugotecka A., Filip-kowski P. Single-stranded DNA-binding proteins (SSBs) - sources and applications in molecular biology // Acta Biochimica Polonica. 2005. Vol. 52. Issue 3. P. 569-574.
6. Гришин Д.В., Покровская М.В., Подобед О.В., Гладилина Ю.А., Покровский В.С., Александрова С.С., Соколов Н.Н. Прогнозирование термостабильности белков по их первичной структуре: современное состояние и факторы развития // Биомедицинская химия. 2017. Т. 63. N 2. C. 124-131.
7. Sterner R., Liebl W. Thermophilic adaptation of proteins // Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 2001, vol. 36, issue 1, pp. 39106. DOI: 10.1080/20014091074174
8. Ming D., Hellekant G. Brazzein, a new high-potency thermostable sweet protein from Pen-tadiplandra brazzeana B // FEBS Letters. 1994. Vol. 355. Issue 1. P. 106-108.
9. Grishin D.V., Gudov V.P., Sergienko O.V., Lunin V.G., Kharchenko P.N. Creation of a protein vector construct including an SSBTne DNA-binding domain and VirD2 nuclear localization signal // Russian Agricultural Sciences. 2008. Vol. 34. Issue 5. P. 329-331. DOI: 10.3103/S1068367408050145
10. Cuadros C., Lopez-Hernandez F.J., Dominguez A.L, McClelland M., Lustgarten J. Flagellin fusion proteins as adjuvants or vaccines induce specific immune responses // Infection and Immunity. 2004. Vol. 72. Issue 5. P. 2810-2816. DOI: 10.1128/IAI.72.5.2810-2816.2004
11. Rizzuto R., Brini M., Pizzo P., Murgia M., Pozzan T. Chimeric green fluorescent protein as a
формы целевого продукта. Разработана малостадийная схема очистки, включающая термолизис, высаливание и лиофилизацию. При этом степень чистоты полученной субстанции была не менее 92%, а выход очищенного протеина составил 3,01 г в расчете на 1 л питательной среды.
КИЙ СПИСОК
tool for visualizing subcellular organelles in living cells // Current Biology. 1995. Vol. 5. Issue 6. P. 635-642. https://doi.org/10.1016/S0960-9822 (95)00128-X
12. Grishin D.V., Gladilina Y.A., Aleksandro-va S.S., Pokrovskaya M.V., Podobed O.V., Pokrov-skii V.S., Zhdanov D.D., Sokolov N.N. Creation of thermostable polypeptide cassettes for amino acid balancing in farm animal rations // Applied Biochemistry and Microbiology. 2017. Vol. 53. Issue 6. P. 688-698. DOI: 10.1134/S0003683817060072
13. Гришин Д.В., Подобед О.В., Гладили-на Ю.А., Покровская М.В., Александрова С.С., Покровский В.С., Соколов Н.Н. Биоактивные белки и пептиды: современное состояние и новые тенденции практического применения в пищевой промышленности и кормопроизводстве // Вопросы питания. 2017. Т. 86. N 3. C. 19-31.
14. Altschul S.F., Madden T.L., Schaffer A.A., Zhang J., Zhang Z., Miller W., Lipman D.J. Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs // Nucleic Acids Research. 1997. Vol. 25. Issue 17. P. 3389-3402. DOI: 10.1093/nar/25.17.3389
15. Thompson J.D., Gibson T.J., Plewniak F., Jeanmougin F., Higgins D.G. The CLUSTAL_X windows interface: flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools // Nucleic Acids Research. 1997. Vol. 25. Issue 24. P.4876-4882.
16. Kibbe W.A. OligoCalc: an online oligonucleotide properties calculator // Nucleic Acids Researh. 2007. Vol. 35. P. 43-46. DOI: 10.1093/ nar/gkm234
17. Ku T.H., Lu P.Y., Chan C.H., Wang T.S., Lai S.Z., Lyu P.C., Hsiao N.W. Predicting melting temperature directly from protein sequences // Computation Biology and Chemistry. 2009. Vol. 33. Issue 6. P. 445-450. DOI: 10.1016/j.compbiol chem. 2009.10.002
18. Diaz A., Tomba E., Lennarson R., Richard R., Bagajewicz M., Harrison R.G. Prediction of protein solubility in Escherichia coli using logistic regression // Biotechnology and Bioengineering. 2010. Vol. 105. Issue 2. P. 374-383. htts://doi.org/10. 1002/bit.22537.
19. Drury L. Transformation of bacteria by elec-troporation // Methods in Molecular Biology. 1996. Vol. 58. P. 249-256.
20. Gibson D.G. Enzymatic assembly of overlapping DNA fragments // Methods in Enzymology. 2011. Vol. 498. P. 349-361. DOI: 10.1016/B978-0-12-385120-8.00015-2.
21. Yadav P., Yadav A., Garg V., Datta T.K., Goswami S.L., De S. A novel method of plas-mid isolation using laundry detergent // Indian Journal of Experimental Biology. 2011. Vol. 49. Issue 7. P.558-560.
22. Bradford M.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding // Analytical Biochemistry. 1976. Vol. 72. Issue 1-2. P. 248-254. http://dx.doi.org/10.1016/0003-2697 (76)90527-3
23. Laemmli B.U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacterio-phage T4 // Nature. 1970. Vol. 227. No. 5259. P. 680-685. DOI: 10.1038/227680a0
24. Yang C., Xu Y., Jia R., Li P., Zhang L., Wang M., Zhu D., Chen S., Liu M., Yin Z., Cheng A. Prokaryotic expression of a codon-optimized cap-sid gene from duck circovirus and its application to an indirect ELISA // Journal of Virological methods. 2017. Vol. 247. P. 1-5. DOI: 10.1016/j.jviro-met.2017.05.003
25. Tanaka M., Tokuoka M., Gomi K. Effects of
codon optimization on the mRNA levels of heterologous genes in filamentous fungi // Applied Microbiology and Biotechnology. 2014. Vol. 98. No. 9. P. 3859-3867. DOI: 10.1007/s00253-014-5609-7
26. Gustafsson C, Govindarajan S, Minshull J. Codon bias and heterologous protein expression // Trends in Biotechnolody. 2004. Vol. 22. Issue 7. P. 346-353. DOI: 10.1016/j.tibtech.2004.04.006
27. Murashima K., Kosugi A., Doi R.H. Solubilization of cellulosomal cellulases by fusion with cellulose-binding domain of noncellulosomal cellulase engd from Clostridium cellulovorans // Proteins.
2003. Vol. 50. Issue 4. P. 620-628. DOI: 10.1002/prot.10298
28. Yuan H., Yang X., Hua Z.C. Optimization of expression of an annexin V-hirudin chimeric protein in Escherichia coli // Microbiological Research.
2004. Vol. 159. Issue 2. P. 147-156. DOI: 10.1016/ j.micres. 2004.02.002
29. Costa S., Almeida A., Castro A., Domin-gues L. Fusion tags for protein solubility, purification and immunogenicity in Escherichia coli: the novel Fh8 system // Frontiers in Microbiology. 2014. Vol. 5. 20 p. DOI: 10.3389/fmicb.2014.00063
1. Alberts B., Johnson A., Lewis J., Raff M., Roberts K., Walter P. Molecular Biology of the Cell. Garland Science, 2008, 1392 p.
2. Perales C., Cava F., Meijer W.J.J., Beren-guer J. Enhancement of DNA, cDNA synthesis and fidelity at high temperatures by a dimeric single-stranded DNA-binding protein. Nucleic Acids Research. 2003, vol. 31, pp. 6473-6480. DOI: 10.10 93/nar/gkg865
3. Olszewski M., Grot A., Wojciechowski M., Nowak M., Mickiewicz M., Kur J. Characterization of exceptionally thermostable single-stranded DNA-binding proteins from Thermotoga maritima and Thermotoga neapolitana. BMC Microbiology. 2010, vol. 10, pp. 260-360. DOI: 10.1186/1471-2180-10-260
4. Cernooka E., Rumnieks J., Tars K., Kazaks A. Structural Basis for DNA Recognition of a Single-stranded DNA-binding Protein from Enterobacter Phage Enc34. Scientific Reports. 2017, vol. 7, issue 1, pp. 15529-15539. DOI: 10.1038/s41598-017-15774-y
5. Kur J., Olszewski M., Dtugotecka A., Filip-kowski P. Single-stranded DNA-binding proteins (SSBs) - sources and applications in molecular biology. Acta Biochimica Polonica. 2005, vol. 52, issue 3, pp. 569-574.
6. Grishin D.V., Pokrovskaya M.V., Podobed O.V., Gladilina J.A., Pokrovskii V.S., Aleksandrova S.S., Sokolov N.N. Prediction of protein thermostability from their primary structure: the current state and development factors. Biomeditsinskaya khimiya. 2017, vol. 63, no. 2, pp. 124-131. (In Russian). DOI: 10.18097/PBMC20176302124
7. Sterner R., Liebl W. Thermophilic adaptation of proteins. Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 2001, vol. 36, issue 1, pp. 39-106.
DOI: 10.1080/20014091074174
8. Ming D., Hellekant G. Brazzein, a new high-potency thermostable sweet protein from Pentadi-plandra brazzeana B. FEBS Letters. 1994, vol. 355, issue 1, pp. 106-108.
9. Grishin D.V., Gudov V.P., Sergienko O.V., Lunin V.G., Kharchenko P.N. Creation of a protein vector construct including an SSBTne DNA-binding domain and VirD2 nuclear localization signal. Russian Agricultural Sciences. 2008, vol. 34, issue 5, pp. 329-331. DOI: 10.3103/S1068367408050145
10. Cuadros C., Lopez-Hernandez F.J., Dominguez A.L, McClelland M., Lustgarten J. Fla-gellin fusion proteins as adjuvants or vaccines induce specific immune responses. Infection and Immunity. 2004, vol. 72, isssue 5, pp. 2810-2816. DOI: 10.1128/IAI.72.5.2810-2816.2004
11. Rizzuto R., Brini M., Pizzo P., Murgia M., Poz-zan T. Chimeric green fluorescent protein as a tool for visualizing subcellular organelles in living cells. Current Biology. 1995, vol. 5, issue 6, pp. 635-642. https://doi.org/10.1016/S0960-9822(95)00128-X
12. Grishin D.V., Gladilina Y.A., Aleksandrova S.S., Pokrovskaya M.V., Podobed O.V., Pokrovskii V.S., Zhdanov D.D., Sokolov N.N. Creation of thermostable polypeptide cassettes for amino acid balancing in farm animal rations. Applied Biochemistry and Microbiology. 2017, vol. 53, no. 6, pp. 688-698. DOI: 10.1134/S0003683817060072
13. Grishin D.V., Podobed O.V., Gladilina Yu.A., Pokrovskaya M.V., Aleksandrova S.S., Pokrovskii V.S., Sokolov N.N. Bioactive proteins and pep-tides: current state and new trends of practical application in the food industry and feed production. Voprosy pitaniya. 2017, vol. 86, no. 3, pp. 19-31. (In Russian)
14. Altschul S.F., Madden T.L., Schaffer A.A., Zhang J., Zhang Z., Miller W., Lipman D.J. Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. Nucleic Acids Research. 1997, vol. 25, no. 17, pp. 3389-3402. DOI: 10.1093/nar/25.17.3389
15. Thompson J.D., Gibson T.J., Plewniak F., Jeanmougin F., Higgins D.G. The CLUSTAL_X windows interface: flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools. Nucleic Acids Research. 1997, vol. 25, no. 24, pp.4876-4882.
16. Kibbe W.A. OligoCalc: an online oligonucleotide properties calculator. Nucleic Acids Research. 2007, vol. 35, pp. 43-46. DOI: 10.1093/nar/gkm234
17. Ku T.H., Lu P.Y., Chan C.H., Wang T.S., Lai S.Z., Lyu P.C., Hsiao N.W. Predicting melting temperature directly from protein sequences. Computation Biology and Chemistry. 2009, vol. 33, issue 6, pp. 445-450. DOI: 10.1016/j.compbiol-chem.2009.10.002
18. Diaz A., Tomba E., Lennarson R., Richard R., Bagajewicz M., Harrison R.G. Prediction of protein solubility in Escherichia coli using logistic regression. Biotechnology and Bioengineering. 2010, vol. 105, issue 2, pp. 374-383. htts://doi.org/ 10.1002/bit.22537
19. Drury L. Transformation of bacteria by elec-troporation. Methods in Molecular Biology. 1996, vol. 58., pp.. 249-256.
20. Gibson D.G. Enzymatic assembly of overlapping DNA fragments. Methods in Enzymology. 2011, vol. 498, pp. 349-361. DOI: 10.1016/B978-0-12-385120-8.00015-2
21. Yadav P., Yadav A., Garg V., Datta T.K., Goswa-mi S.L., De S. A novel method of plasmid isolation using laundry detergent. Indian Journal of Experimental Biology. 2011, vol. 49, issue 7, pp. 558-560.
22. Bradford M.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities
Критерии авторства
Гришин Д.В., Жданов Д.Д., Гладилина Ю.А., Покровская М.В., Александрова С.С. и Соколов Н.Н. выполнили экспериментальную работу. На основании полученных результатов Гришин Д.В., Жданов Д.Д., Гладилина Ю.А., Покровская М.В., Александрова С.С. и Соколов Н.Н. провели обобщение и написали рукопись. Все авторы имеют на статью равные авторские права и несут равную ответственность за плагиат.
Конфликт интересов
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 1976, vol. 72, issue 1-2, pp. 248-254. http://dx.doi.org/10.1016/ 0003-2697(76)90527-3
23. Laemmli B.U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 1970, vol. 227, no. 5259, pp. 680-685. DOI: 10.1038/227680a0
24. Yang C., Xu Y., Jia R., Li P., Zhang L., Wang M., Zhu D., Chen S., Liu M., Yin Z., Cheng A. Prokaryotic expression of a codon-optimized capsid gene from duck circovirus and its application to an indirect ELISA. Journal of Virological methods. 2017, vol. 247, pp. 1-5. DOI: 10.1016/j.jviromet. 2017.05.003
25. Tanaka M., Tokuoka M., Gomi K. Effects of codon optimization on the mRNA levels of heterologous genes in filamentous fungi. Applied Microbiology and Biotechnology. 2014, vol. 98, no. 9, pp. 3859-3867. DOI: 10.1007/s00253-014-5609-7
26. Gustafsson C., Govindarajan S., Minshull J. Codon bias and heterologous protein expression. Trends in Biotechnolody. 2004, vol. 22, issue 7, pp. 346-353. DOI: 10.1016/j.tibtech.2004.04.006
27. Murashima K., Kosugi A., Doi R.H. Solubilization of cellulosomal cellulases by fusion with cellulose-binding domain of noncellulosomal cellulase engd from Clostridium cellulovorans. Proteins. 2003, vol. 50, issue 4, pp. 620-628. DOI: 10.1002/ prot.10298
28. Yuan H., Yang X., Hua Z.C. Optimization of expression of an annexin V-hirudin chimeric protein in Escherichia coli. Microbiological Research. 2004, vol. 159, issue 2, pp. 147-156. DOI: 10.1016/ j.micres.2004.02.002
29. Costa S., Almeida A., Castro A., Domin-gues L. Fusion tags for protein solubility, purification and immunogenicity in Escherichia coli: the novel Fh8 system. Frontiers in Microbiology. 2014, vol. 5, 20 p. DOI: 10.3389/fmicb.2014.00063
Contribution
Dmitry V. Grishin, Dmitry D. Zhdanov, Julia A. Gladilina, Marina V. Pokrovskaya, Svetlana S. Ale-ksandrova, Nikolai N. Sokolov carried out the experimental work. Dmitry V. Grishin, Dmitry D. Zhdanov, Julia A. Gladilina, Marina V. Pokrovskaya, Svetlana S. Aleksandrova, Nikolai N. Sokolov on the basis of the results summarized the material and wrote the manuscript. All authors have equal author's rights and bear equal responsibility for plagiarism.
Conflict of interests
The authors declare no conflict of interests regarding the publication of this article.
СВЕДЕНИЯ ОБ АВТОРАХ
Гришин Дмитрий Викторович, Œ3
к.б.н., старший научный сотрудник, лаборатории медицинской биотехнологии, Научно-исследовательский институт биомедицинской химии им. В.Н. Ореховича, e-mail: molbiol_ibm@inbox.ru
Жданов Дмитрий Дмитриевич,
к.б.н., и.о. заведующего лабораторией медицинской биотехнологии Научно-исследовательский институт биомедицинской химии им. В.Н. Ореховича, e-mail: zhdanovdd@mail.ru
Гладилина Юлия Алексеевна,
к.б.н., научный сотрудник лаборатории медицинской биотехнологии, Научно-исследовательский институт биомедицинской химии им. В.Н. Ореховича, e-mail: ibmcagris@inbox.ru
Покровская Марина Владимировна,
к.б.н., ведущий научный сотрудник лаборатории медицинской биотехнологии, Научно-исследовательский институт биомедицинской химии им. В.Н. Ореховича, e-mail: ibmcagris@inbox.ru
Александрова Светлана Серебеджановна,
к.б.н., старший научный сотрудник лаборатории медицинской биотехнологии, Научно-исследовательский институт биомедицинской химии им. В.Н. Ореховича, e-mail: ibmcagris@inbox.ru
Соколов Николай Николаевич,
д.б.н., профессор, главный научный сотрудник лаборатории медицинской биотехнологии, Научно-исследовательский институт биомедицинской химии им. В.Н. Ореховича, e-mail: sokolov2144@yandex.ru
AUTHORS' INDEX
Dmitry V. Grishin, ISI Ph.D. (Biology), Senior Researcher, Laboratory of Medical Biotechnology, Institute of Biomedical Chemistry (IBMC), e-mail: molbiol_ibm@inbox.ru
Dmitry D. Zhdanov,
Ph.D. (Biology), Acting Head of Laboratory of Medical Biotechnology, Institute of Biomedical Chemistry (IBMC), e-mail: zhdanovdd@mail.ru
Julia А. Gladilina,
Ph.D. (Biology), Researcher, Laboratory of Medical Biotechnology, Institute of Biomedical Chemistry (IBMC), e-mail: ibmcagris@inbox.ru
Marina V. Pokrovskaya,
Ph.D. (Biology), Leading Researcher, Laboratory of Medical Biotechnology, Institute of Biomedical Chemistry (IBMC), e-mail: ibmcagris@inbox.ru
Svetlana S. Aleksandrova,
Ph.D. (Biology), Senior Researcher, Laboratory of Medical Biotechnology, Institute of Biomedical Chemistry (IBMC), e-mail: ibmcagris@inbox.ru
Nikolai N. Sokolov,
Dr. Sci. (Biology), Professor, Chief Researcher, Laboratory of Medical Biotechnology, Institute of Biomedical Chemistry (IBMC), e-mail: sokolov2144@yandex.ru
