CC BY
27
УДК 619:615.244:579.88
ГЕПАТОПРОТЕКТОРНОЕ ДЕЙСТВИЕ ПОЛИСАХАРИДОВ ДРОЖЖЕВЫХ ГРИБОВ
А. А. ПРУСАКОВА, Ж. В. ВИШНЕВЕЦ, Н. С. МОТУЗКО, Л. И. САПУНОВА, С. А. КУЛИШ
УО «Витебская ордена «Знак Почёта» государственная академия ветеринарной медицины», г. Витебск, Беларусь, 210026
(Поступила в редакцию 19.01.2018)
В статье представлены результаты по изучению гепатопротекторного действия двух лабораторных образцов полисахаридов, полученных с использованием штаммов дрожжевых грибов Cryptococcus flavescens 1-АЛ-3 и Rhodotorula sp. ФПСК-17.
Установлено в экспериментах на лабораторных животных, что полисахариды штаммов дрожжевых грибов Cryptococcus flavescens 1-АЛ-3 и Rhodotorula sp. ФПСК-17 в дозе 0,1 г/кг оказывают выраженный гепатопротекторный эффект на модели острого токсического гепатита.
Ключевые слова: гепатопротектор, гепатотоксин, токсический гепатит, полисахарид, лабораторные животные, Cryptococcus flavescens 1-АЛ-3, Rhodotorula sp. ФПСК-17.
The article presents results of a study of the hepatoprotective action of the two polysaccharides laboratory samples obtained using strains of yeast Cryptococcus flavescens 1-AL-3 and Rhodotorula sp. FPSK-17.
It was established in experiments on laboratory animals that polysaccharides of strains of yeast fungi Cryptococcus flavescens1-AL-3 and Rhodotorula sp. FPSK-17 at a dose of 0.1 g/kg has a pronounced hepatoprotective effect on the model of acute toxic hepatitis.
Key words: hepatoprotector, hepatotoxin, toxic hepatitis, polysaccharide, laboratory animals, Cryptococcus flavescens 1-AL-3, Rhodotorula sp. FPSK-17.
Введение. Эффективность животноводческой отрасли сельскохозяйственного производства в значительной мере зависит от качества кормов. Введение в рацион животных и птицы кормовых добавок, в том числе функционального назначения (пробиотиков, пребиотиков, синбиотиков), оптимизирует обменные процессы, улучшает пищеварение и резистентность к инфекциям. Одним из новых и быстро развивающихся сегментов рынка кормовых добавок являются продукты, содержащие живые дрожжи и компоненты их клеточных стенок [4].
Таким образом, изучение и разработка новых кормовых добавок на основе живых дрожжей и компоненты их клеточных стенок является приоритетным направлением современной ветеринарной фармации в Республике Беларусь.
Анализ источников. Использование кормовых добавок на основе живых дрожжей и компонентов их клеточных стенок в животноводстве и птицеводстве стимулирует неспецифический иммунитет, улучшают процессы пищеварения и усвоения питательных веществ, повышают аппетит,
увеличивают приросты. Это способствует более полному усвоению питательных веществ рациона, нормализации общего обмена веществ, стимуляции роста и развития поголовья, повышению его сохранности и продуктивности, улучшению качества получаемых продуктов питания.
Из литературных источников известно, что синтезируемые дрожжевыми грибами полисахариды, представляющие обширную группу биологически активных соединений, обладают антимикробным, антигенным, сорбционным, противоопухолевым, гепатопротекторным, иммуностимулирующим, гиполипидическим, радио- и криопротекторным действием.
Стоит отметить, что ежегодно возрастает количество животных с патологией печени, причем значительное место занимает ее токсическое повреждение. Попадая в организм различными путями, гепатотоксические агенты нарушают структуру и функцию клеточных мембран гепатоцитов, усиливают процессы перекисного окисления липидов, изменяют процессы регенерации и функции гепатоцитов, что сопровождается, прямо и косвенно, нарушениями иммунной реактивности. Применение веществ гепатопротекторного действия позволяет восстанавливать поврежденные клеточные структуры и ускорять процессы репаративной регенерации в гепатоцитах [1, 2, 7].
Цель настоящей работы - изучить на лабораторных животных гепато-протекторное действие двух лабораторных образцов полисахаридов, полученных в Институте микробиологии НАН Беларуси с использованием штаммов дрожжевых грибов Cryptococcus flavescens 1-АЛ-3 и Rhodotorula sp. ФПСК-17.
Материал и методика исследований. Объектом исследования служили лабораторные образцы полисахаридов, полученные с использованием штаммов дрожжевых грибов Cryptococcus flavescens 1-АЛ-3 и Rhodotorula sp. ФПСК-17.
С целью получения внеклеточных полисахаридов, синтезируемых дрожжевыми грибами Cryptococcus flavescens 1-АЛ-3 и Rhodotorula sp. ФПСК-17, культуры выращивали в питательных средах на основе молочной сыворотки в колбах Эрленмейера при 26-28 °С на качалке (190210 об/мин) в течение 48 ч. В качестве посевного материала использовали 4 об.% суспензии клеток дрожжей, выращенных в жидкой питательной среде в течение 16 ч.
По окончании культивирования биомассу дрожжей отделяли от куль-туральной жидкости центрифугированием (8000 g, 15 мин). Процедуру повторяли трижды. Из охлажденного бесклеточного супернатанта выделяли полисахарид осаждением 96 % этанолом в соотношении 1:2. Образовавшийся осадок промывали этиловым спиртом, высушивали при 50 °С до постоянного веса и хранили при комнатной температуре.
Изучение гепатопротекторного действия лабораторных образцов полисахаридов штаммов дрожжевых грибов Сгур(ососсш' /¡ауе^сет 1-АЛ-3 и Ккоёо1от1а ¿р. ФПСК-17 проводили согласно «Руководству по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ» (Москва, 2005 г.) [6].
В качестве экспериментальных животных использовали беспородных белых мышей-самцов массой 25 - 30 г в возрасте 2 - 3 мес., выращенных в УО «Витебская государственная академия ветеринарной медицины» и содержавшихся в стандартных условиях вивария.
Уход за животными, эксперименты и эвтаназию проводили в соответствии с этическими нормами работы с лабораторными животными, отраженными в Правилах проведения работ с использованием экспериментальных животных (приложение к приказу МЗ СССР №775 от 12.08.1977 г.).
Всего испытанию подвергнуто 40 мышей. Из животных для опытов было сформировано 4 группы:
1 - контрольная (норма, интактные);
2 - контрольная (патология, токсический гепатит);
3 - опытная - токсический гепатит, которая получала с первого дня опыта полисахариды дрожжевых грибов Сгур(ососсш' /¡ауе^сет 1-АЛ-3 в дозе 0,1 г/кг;
4 - опытная - токсический гепатит, которая получала с первого дня опыта полисахариды дрожжевых грибов Ккоёо1от1а ¿р. ФПСК-17 в дозе 0,1 г/кг.
Количество животных в группах по 10 голов в каждой.
Лабораторные образцы полисахаридов предварительно растворяли в воде и вводили ежедневно в течение 14 дней опытным группам при помощи инсулинового стеклянного шприца с наплавленной оливой. Животным 1 и 2 контрольных групп ежедневно на протяжении 14 дней внутри-желудочно вводили дистиллированную воду.
Токсическое поражение печени моделировали внутрижелудочным введением четыреххлористого углерода на оливковом масле в виде 50 % раствора на 8-й, 9-й и 10-й дни опыта в дозе 1,25 мл/кг.
В процессе эксперимента проводилось ежедневное наблюдение за мышами, а именно: за их активностью, общим состоянием здоровья, аппетитом, выживаемостью.
Для оценки гепатопротекторных свойств взятие крови проводили путем декапитации на 7-й и 14-й дни опыта.
Для оценки гепатопротекторного действия лабораторных образцов полисахаридов на организм мышей изучали:
• морфологические показатели крови (количество лейкоцитов);
• биохимические показатели сыворотки крови - маркеры поражения печени (общий белок, альбумин, мочевина, общий билирубин, холестерин, креатинин, активность аминотрансфераз (АлАТ и АсАт), активность щелочной фосфатазы) [8].
В крови определяли количество лейкоцитов путем подсчета их в камере Горяева. Биохимические исследования проводили по стандартным методикам с использованием биохимического анализатора [3].
Статистическую обработку результатов исследований проводили с помощью компьютерной программы ВЮМ 2716.Статистически значимыми считали различия с Р<0,05 [5].
Результаты исследований и их обсуждение. При исследовании гепа-топротекторного действия лабораторных образцов кормовой добавки изменений поведенческого и клинического статуса лабораторных животных не отмечено.
Таблица 1. Динамика уровня лейкоцитов крови мышей в норме и при патологии печени (М±ш)
Группы животных Применения полисахаридов, дни
7 14
Лейкоциты, 109/л
1-я контрольная 5,62±0,57 5,18±0,85
2-я контрольная 5,14±0,21 5,26±0,16
3-я опытная 7,57±0,16** 12,24±0,71***
4-я опытная 7,08±0,48* 13,65±3,49*
Примечания - *Р<0,05; **Р<0,01; ***Р<0,001.
Изучив количество лейкоцитов в крови животных мы отметили, что введение полисахаридов мышам 3-й и 4-й опытных групп вызвало достоверное повышение лейкоцитов по сравнению с контрольной (интактной) группой до введения гепатотоксического вещества на 34,7 % (Р<0,01) и 26 % (Р<0,05) соответственно, но показатель оставался в пределах нормы. После введения гепатотоксиканта мышам опытных групп совместно с испытуемым препаратом количество лейкоцитов возрастло еще больше, превзойдя в 2,3 и 2,6 раза этот показатель у животных 2-й контрольной групп (токсический гепатит), однако не превысив верхние границы физиологической нормы. Это можно объяснить как положительное влияние полисахаридов на продукцию лейкоцитов.
Печень участвует в поддержании динамического равновесия плазмы крови - белков, сахаров, холестерина, минеральных веществ, синтезирует конечный продукт обмена простых белков - мочевину и ферменты. Диагностику заболеваний печени на ранних стадиях и оценку характера поражения гепатоцитов можно провести на основании лабораторных исследований, главным образом данных клинической биохимии.
Биохимический анализ был начат с определения содержания общего белка. У клинически здоровых животных с возрастом отмечается снижение содержания общего белка в сыворотке крови, что является естествен-
ным физиологическим процессом. Аналогичная тенденция отмечается и у животных с патологией печени.
Таблица 2. Динамика биохимических показателей сыворотки крови мышей в норме и при патологии печени (М±ш).
Группы животных Применения полисахаридов, дни
7 14
Общий белок, г/л
1-я контрольная 65,73±1,68 67,31±1,81
2-я контрольная 65,82±4,02 58,91±4,04
3-я опытная 77,15±6,45 61,56±6,53
4-я опытная 76,56±4,56 61,29±3,98
Альбумины, г/л
1-я контрольная 29,32±1,26 28,08±0,97
2-я контрольная 29,07±1,83 23,93±0,66**
3-я опытная 32,85±1,41 25,36±1,08
4-я опытная 30,33±1,44 24,83±1,19
Примечания - **Р<0,01.
Из табл. 2 видно, что применение полисахаридов в течение 7-ми дней стимулирует протеосинтез в опытных группах. Совместное применение полисахаридов и гепатотоксиканта, вводимого на 8-й, 9-й и 10-й дни опыта снизило содержание общего белка и альбумина в сыворотке крови по сравнению с 1-м контролем. Однако стоит отметить, что применение полисахарида в 3-й и 4-й опытных группах на фоне гепатотоксина в течение 14 дней повысило показатели общего белка, что свидетельствует о гепа-топротекторных свойствах полисахаридов. Было отмечено также достоверное снижение уровня альбумина на 14,8% (Р<0,01) во 2-й контрольной группе (токсический гепатит) по сравнению с контролем. Полученные данные свидетельствуют о развитии патологического процесса в печени лабораторных животных.
Концентрация мочевины в крови зависит от скорости её образования в печени и удаления почками. Поэтому при тяжелых поражениях печени уровень мочевины в крови обычно изменяется. Результаты исследований этого показателя представлены в табл. 3.
Как следует из представленных данных, во всех группах животных с патологией печени отмечается снижение уровня мочевины в сыворотке крови. Во 2-й контрольной группе (токсический гепатит) мы выявлено резкое снижение показателя по отношению к 1-му контролю на 31,8 % (Р<0,05).
Применение полисахарида в 3-й и 4-й опытных группах на фоне гепа-тотоксина в течение 14 дней нормализовало уровень мочевины до нижней границы нормы соответственно на 28,4 % (Р<0,05) и 25,2 % (Р<0,05).
Данные, полученные по динамике мочевины, также свидетельствуют о наличии у лабораторных образцов полисахаридов гепатопротекторных свойств.Известно, что при острых заболеваниях печени содержание билирубина в крови может превышать норму в 20 и более раз, а при хронических в 2-10 раз.
Таблица 3 . Динамика биохимических показателей сыворотки крови мышей в норме и при патологии печени (М±ш).
Группы животных Применения полисахаридов, дни
7 | 14
Мочевина, ммоль/л
1-я контрольная 5,99±0,53 6,04±0,57
2-я контрольная 5,62±0,63 4,12±0,29*
3-я опытная 6,21±0,53 5,29±0,36*
4-я опытная 5,89±0,53 5,16±0,34*
Общий билирубин, мкмоль/л
1-я контрольная 2,46±0,14 2,52±0,21
2-я контрольная 2,48±0,14 4,27±0,4**
3-я опытная 2,47±0,12 3,27±0,22
4-я опытная 2,42±0,17 3,22±0,18*
Креатинин, мкмоль/л
1-я контрольная 30,56±2,31 29,98±2,92
2-я контрольная 32,95±2,75 28,96±2,46
3-я опытная 31,56±2,66 30,52±3,67
4-я опытная 35,2±4,26 29,88±2,2
Холестерин, ммоль/л
1-я контрольная 2,39±0,19 2,22±0,12
2-я контрольная 2,27±0,14 2,05±0,09
3-я опытная 2,51±0,30 2,09±0,07
4-я опытная 2,67±0,14 2,08±0,09
*Р<0,05; **Р<0,01.
В нашем случае содержание общего билирубина у животных с патологией печени (2-я контрольная группа) было выше в 1,7 раза по отношению к контролю. Применение полисахаридов в 3-й опытной группе на фоне гепатотоксина понизило уровень общего билирубина на 23,4 % по отношению к контролю (токсический гепатит), хотя значение и не является достоверным. Стоит отметить достоверное понижение данного показателя в сыворотке крови у мышей 4-й опытной группы на 24,6 % (Р<0,05) по отношению к группе, получавшей только гепатотоксин. В то же время данный показатель в опытных группах практически не отличался от показателя, характерного для крови здоровых мышей. Нарушению обмена билирубина способствует резкое ослабление метаболических процессов в пораженных гепатоцитах, которые теряют способность нормально выполнять различные биохимические и физиологические процессы, в частности переводить связанный билирубин из клеток в желчь против градиента концентрации. Концентрации креатинина (одного из конечных продуктов белкового обмена) и холестерина (являющегося важным показателем синтетической функции печени) в крови всех исследуемых групп животных находились в пределах нормы, и их величины достоверно не различались (табл. 3).
Определение активности АсАт, АлАт и ЩФ в сыворотке крови является индикатором цитолитического синдрома, который возникает при повреждении клеток печени, в первую очередь ее цитоплазмы, а также органоидов и протекает с выраженным нарушением клеточных мембран. После введения гепатотоксина во 2-й контрольной группе на 14 день опы-
та мы отметили достоверное увеличение концентрации щелочной фосфа-тазы в крови мышей в 2,2 раза по отношению к 1-й контрольной группе. Тенденция к росту активности ЩФ свидетельствует о патологических явлениях в печени. Совместное введение четыреххлористого углерода и полисахаридов 3 -й и 4-й опытным группам способствовало снижению активности щелочной фосфатазы соответственно на 25,8 % (Р<0,001) и 28 % (Р<0,001) по отношению ко 2-й контрольной группе. Полученные данные свидетельствуют о развитии воспалительного процесса в печени лабораторных животных и благоприятного воздействия полисахаридов на патологический процесс. Можно сделать вывод, что данные лабораторные образцы полисахаридов обладают выраженным гепатопротекторным действием.
В сыворотке крови мышей мы определяли уровень индикаторных ферментов - аланинаминотрансферазы (АлАТ) и аспартатаминотрансфе-разы (АсАТ), которые используют для оценки состояния клеточных мембран гепатоцитов («синдром цитолиза»). Анализ полученных данных свидетельствует, что у мышей, получавших полисахариды в течение 7 дней, не отмечено достоверных различий по содержанию в сыворотке крови аспартатаминотрансферазы по сравнению с контролем. У мышей 2-й контрольной группы, которым в течение 3 дней вводили гепатотоксин, отметили повышение уровня АсАт на 23,9 % (Р<0,01) по сравнению с контролем на 14 сутки опыта.
Таблица 4. Динамика ферментов в сыворотке крови мышей в норме и при патологии печени (М±ш).
Группыживотных Применения полисахаридов, дни
7 14
Щелочная фосфатаза,И/Ь
1-я контрольная 72,52±4,59 72,26±2,10
2-я контрольная 71,11±2,86 156,98±4,23***
3-я опытная 62,23±3,14 116,43±2,67***
4-я опытная 65,84±3,18 113,06±6,58***
АсАТ, И/Ь
1-я контрольная 357,8±9,36 340,0±17,27
2-я контрольная 331,6±18,27 421,24±16,62**
3-я опытная 339,1±17,86 350,9±10,28**
4-я опытная 362,6±11,52 362,24±6,74*
АлАТ, И/Ь
1-я контрольная 43,11±4,07 44,63±3,95
2-я контрольная 44,66±2,74 63,65±4,16*
3-я опытная 45,57±4,18 49,26±3,34*
4-я опытная 44,38±2,86 48,01±2,30*
*Р<0,05; **Р<0,01; ***Р<0,001.
Уровень фермента в сыворотке крови у мышей 3-й и 4-й опытных групп был ниже по сравнению с животными, которым вводили одно гепа-тотоксическое вещество. Разница была достоверной и составила соответственно 16,7 % (Р<0,01) и 14 % (Р<0,05).
Изучив уровень АлАт в сыворотке крови мышей до назначения гепа-тотоксического вещества, мы не отметили достоверных различий между животными опытных и контрольных групп. Уровень фермента находился в пределах нормы. Введение гепатотоксического вещества вызвало рост уровня АлАт в сыворотке крови на 42,6 % (Р<0,05) во 2-й контрольной группе по отношению к интактным мышам, что свидетельствует о повреждении клеток печени. Активность фермента в сыворотке крови мышей 3 -й и 4-й опытных групп достоверно не отличался от 1 -й контрольной группы, но находился на более низком уровне по отношению ко 2-й контрольной группой, которой вводили одно гепатотоксическое вещество. Эта разница была достоверной и составила в 3-й группе 22,6 % (Р<0,05) и в 4-й группе 30,9 % (Р<0,05). Это может свидетельствовать о наличии ге-патопротекторных свойствах у испытуемых препаратов.
Заключение. Полученные в экспериментах на лабораторных животных результаты указывают на то, что в дозе 0,1 г/кг лабораторные образцы полисахаридов штаммов дрожжевых грибов Cryptococcus flavescens 1-АЛ-3 и Rhodotorula sp. ФПСК-17, оказывают выраженный гепатопротек-торный эффект на модели острого токсического гепатита.
ЛИТЕРАТУРА
1. Алексеева И.Н., Брызгина Т.М. Печень и иммунологическая реактивность. - Киев, 1991. - 168 с.
2. Брюгер А. Ф., Новицкий И. Н. Практическая гепатология. - Рига: Звайгзне, 1984.-405с.
3. Капитатенко А. М., Дочкин Н. И. Клинический анализ лабораторных исследований. -М.: Воениздат, 1988.- 270с.
4. Клиническая диагностика внутренних незаразных болезней животных /А. М. Смирнов, П. Я. Конопелько, Р. П. Пушкарев [и др.], - 2-е изд., доп. - М., 1988.- 512с.
5. Основы биометрии: Учебно-метод. пособие / А. В.Вишневец, В. Ф. Соболева, В. К. Смунева, Т. В. Видасова - Витебск: ВГАВМ, 2011 - 40 с.
6. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармацевтических веществ /Под ред. Р. У. Хабриева - М.: Медицина, 2005.- 832 с.
7. Хазанов А. И. Функциональная диагностика болезней печени. - М.: Медицина, 1988.254 с.
8. Холод В. М., Ермолаев Г. Ф. Справочник по ветеринарной биохимии. -Минск, 1988. -168 с.
