CC BY
45
УДК 616-005.4: 615.217.34:547.756
ГЕПАТОПРОТЕКТОРНАЯ АКТИВНОСТЬ СПИРОЦИКЛИЧЕСКОГО ПРОИЗВОДНОГО ОКСИНДОЛА В УСЛОВИЯХ ОСТРОЙ ИШЕМИИ ПЕЧЕНИ
Изучено влияние спироциклического производного оксин-дола в дозе 5 мг/кг и препаратов сравнения вита-мелатонина (5 мг/кг) и тиотриазолина (48 мг/кг), на летальность животных, активность цитолиза, свободнорадикальное окисление и функциональную активность печени в условиях острой экспериментальной ишемии.
Установлено выраженое антиоксидантное, антицитолити-ческое действие спироциклического производного оксиндола в дозе 5 мг/кг. Установлено, что суммарная гепатопротекторная активность нового соединения превышает активность препаратов сравнения вита-мелатонина и тиотриазолина.
Ключевые слова: спироциклическое производное оксиндо-ла, острая ишемия печени, гепатопротекторное действие
По статистике ВОЗ более 30% взрослого населения Земли страдает теми или иными заболеваниями печени. Согласно данным МЗ РФ, более 4 тысяч человек умирают ежегодно от причин, обусловленных заболеваниями печени [1].
Одной из тяжелейших патологий печени является гипоксический гепатит (ГГ), он же ишемический гепатит или шок печени. По данным зарубежных авторов [2], ГГ признан наиболее частой причиной острого повреждения печени у реанимационных больных, с распространенностью до 10% [3]. Пациенты с признаками острой печеночной гипоксии/ишемии имеют значительно больший риск смертности [4]. Уровень госпитальной летальности от ГГ составляет 61,5%, при этом перечень лекарственных препаратов для оптимальной фармакокореции этой патологии является недостаточным.
Сложность механизмов развития ишемического поражения печени исключает монотерапию в связи с недостаточностью воздействия только на одно звено патологического каскада, а отсутствие эффективных препаратов политропного действия обуславливает необходимость назначения лекарственных комбинаций, при которых возрастает риск развития негативного действия [6].
Актуальным направлением в современной медицине и фармации является создание, изучение и внедрение в медицинскую практику лекарственных препаратов с полиорганным действием, а именно антигипоксическим, гепатопротекторным и способностью восстанавливать энергетический метаболизм в поврежденных клетках печени при лечении и профилактике ишемических и реперфузионных повреждений ткани печени и ее микроциркуляторного русла.
Перспективным соединением в этом аспекте можно рассматривать новое вещество -4,3'-спиро[(2-амино-э-нитрил-4,5-дигидропирано[з,2-с]хромен-5-он)-5-метил-2’ -оксиндол], в дальнейшем соединение 77, которое по строению ядра молекулы (4Н-пирано[з,2-с]хромен) является структурным аналогом мелатонина и было синтезированно в НФаУ к.ф.н. Редькиным Р.Г., проф. Шемчуком Л.А. (рис.).
H2N^
N
НА ЦУБАНОВА С.Ю. ШТРЫГОЛЬ
Национальный фармацевтический университет Украины, Харьков
e-mail: [email protected]
а б
Рис. Химическая структура мелатонина (а) и 4,з'-спиро[(2-амино-3-нитрил-4,5-дигидропирано [3,2-с]хромен-5-он)-5-метил-2' -оксиндола] (б), обведено структурное ядро молекул.
В предыдущих исследованиях установлено, что это соединение 77 является лидером среди 29 спироциклических производных оксиндола по антигипоксическому действию [7]. Также для соединения 77 установлена гепатопротекторная активность на модели острого токсического (тетрахлорметанового) гепатита [8].
Цель исследования- выяснить влияние спироциклического производного оксиндола на выживаемость животных, биохимические показатели функционального состояния печени в условиях острой печеночной ишемии.
Материалы и методы. Исследования проводили на крысах массою 180-240г. Животные содержались в стандартных условиях вивария в соответствии с правилами GLP. При роботе исполняли требования Директивы Совета ЕС по вопросам защиты животных, которые используются для экспериментальных и других научных целей.
Острую ишемию печени моделировали под тиопентал-натриевым наркозом (35 мг/кг) путем наложения специального зажима на сосудистую ножку печени и желчевыводящий проток. Окклюзия продолжалась 25 мин. Животные были распределены на следующие группы:
1. Псевдооперированные животные (под наркозом вскрывали брюшную полость и препарировали сосудистую ножку печени и желчевыводящий проток, после чего рану послойно ушивали).
2. Контрольная патология (25-минутная окклюзия сосудистой ножки печени и желчевыводящего протока).
3. Животные, которые получали соединение 77 в дозе 5 мг/кг (доза максимального ан-тигипоксического эффекта) ежедневно внутрижелудочно на протяжении 3 суток, в последний раз за 40 мин до моделирования ишемии.
4. Животные, получавшие препарат сравнения вита-мелатонин (аналог структурного ядра соединения 77) в дозе 5 мг/кг в аналогичном режиме.
5. Животные, которые получали препарат сравнения тиотриазолин (синтетический ге-патопротектор) в дозе 48 мг/кг в аналогичном режиме.
Доза вита-мелатонина, как структурного аналога соответствует дозировке изучаемого соединения. Доза тиотриазолина соответствует среднесуточной терапевтической дозе для человека и пересчитана для крыс с использованием коэффициента видовой чувствительности.
Регистрировали выживаемость животных в течение 24 ч, по истечении суток животных выводили из эксперимента (под эфирным наркозом) осуществляли забор биоматериала для биохимических исследований.
Антицитолитическую активность изучаемого соединения и препаратов сравнения оценивали по уровню в сыворотке крови аланинаминотрансферазы (АлАТ) и аспартатаминотранс-феразы (АсАТ), о противовоспалительной активности судили по коэффициенту массы печени, о холестазе - по активности щелочной фосфатазы (ЩФ) в крови. Изменения прооксидантно-антиоксидантного баланса верифицировали по концентрации в гомогенате печени и сыворотке крови веществ реагирующих с тиобарбитуровой кислотой (ТБК - реактанты), диеновых конъюгатов (ДК), восстановленного глутатиона (ВГ) и активности каталазы.
Также изучали показатели, характеризующие функциональное состояние печени: углеводный обмен - гликоген (гомогенат печени), глюкоза (сыворотка крови), белковый обмен и синтетическая функция - общий белок (сыворотка крови), церулоплазмин (сыворотка крови).
Статистическую обработку результатов проводили с помощью программы Statistika 6.0. с использованием критерия Стьюдента и углового преобразования Фишера.
Результаты и их обсуждение. Гепатопротекторную активность спироциклического производного оксиндола и препаратов сравнения оценивали по интегральному показателю -снижению летальности (табл. 1).
При 25-минутной ишемии печени без фармакологической защиты у животных группы контрольной патологии отмечался высокий уровень смертности (64,3%), что достоверно указывало на тяжесть состояния и достоверно превышало показатель у группы псевдооперированных крыс (0%, р<0,001).
Лечебно-профилактическое введение соединения 77 и препаратов сравнения достоверно снижало процент летальности во всех трех опытных группах, однако необходимо отметить, что протекторное действие соединения 77 было максимально выраженным и позволило снизить летальность до 0%, в чем существенно превосходило данный показатель вита-мелатонина (40%, р<0,001) и гепатопротектора тиотриазолина (25%, р<0,01).
Выраженные патологические изменения на фоне острой ишемии печени в группе контрольной патологии верифицированы по увеличению в 1,4 раза коэффициента массы печени, о разрушении клеток свидетельствует рост в 2-2,3 раза активности клеточных ферментов АлАТ и АсАТ в сыворотке крови. Увеличение в 1,8 раза активности щелочной фосфатазы является индикатором синдрома холестаза. (табл. 2).
Таблица l
Влияние спироциклического производного оксиндола и препаратов сравнения на показатель летальности у крыс с модельной патологией острой ишемии печени (статистическая обработка результатов проведена с использованием углового преобразования Фишера)
№ Группа Летальность P
п/п погибло/ всего животных в группе %
1 Контроль псевдооперирован-ные, (n=6) o/б 0 —
2 Контрольная патология ишемия печени, (n=l4) - 9/14 б4,3 P2-l<0,00l
3 Соединение уу, 5 мг/кг ишемия печени (n=8) + 0/В 0 рз-2<0,001 рз-4<0,001 рз-5<0,01
4 Вита-мелатонин, 5 мг/кг ишемия печени (n=l0) + 4/10 40 P4-l<0,00l
5 Тиотриазолин, 48 мг/кг ишемия печени (n=8) + 2/В 25 P5-l<0,0l P5-2<0,05
Таблица 2.
Влияние спироциклического производного оксиндола и препаратов сравнения на коэффициент массы печени и ферментативную активность у крыс с модельной патологией острой ишемии печени (n=6) (статистическая обработка результатов проведена с использованием критерия Стьюдента)
Условия эксперимента Коэффициент массы печени, % Ферменти, сыворотка крови
ЛлЛТ, мккат/л ЛсЛТ мккат/л Щелочная фосфатаза, ммоль/л
Контроль псевдооперированные 3,53±0,13 0,б1+0,02 0,58+0,02 1,18+0,11
Контрольная патология - ишемия печени 4,9б+0,13 * 1,22+0,0б * 1,32+0,0б ** 2,15+0,07*
Соединение уу, 5 мг/кг + ишемия печени 3,90+0,10 # $$ ллл 0,б9+0,03 # $$$ 0,бВ+0,03 *** # $$ 1,31+0,08 # $$$
Вита-мелатонин, 5 мг/кг + ишемия печени 4,48+0,07 * ## ллл 0,Вб+0,05 ** ## 1,03+0,07 ** ### 1,б8+0,11 ** ##
Тиотриазолин, 48 мг/кг + ишемия печени 4,21+0,09 ** ## 0,74+0,04 ***### 0,78+0,05 ***# $$$ 1,43+0,12 #
Примечания:
1.Достоверные отличия с показателями группы псевдооперированного контроля * -р<0,001; ** -р<0,01; ***-р<0,05;
2. Достоверные отличия с показателями группы контрольной патологии # - р<0,001; ## - р<0,01; ###-р<0,05;
3. Достоверные отличия с показателями группы вита-мелатонина $- р<0,001; $$- р<0,01; $$$-
р<0,05;
4. Достоверные отличия с показателями группы тиотриазолина - р<0,001; Л -р<0,01; ЛЛЛ -
р<0,05.
Соединение 77 проявило выраженное антицитолитическое действие, достоверно снижая активность ферментов цитолиза в сыворотке крови. Мембранопротекторное действие нового соединения также подтверждается массой печени, которая находится в границах физиологической нормы через сутки после моделирования острой ишемии. Активность щелочной фосфатазы, достоверно не отличающаяся от показателя контрольных псевдооперированных животных, свидетельствует об отсутствии холестаза.
Введение гепатопротектора тиотриазолина и вита - мелатонина достоверно восстанов-ливали изучаемые показатели относительно группы контрольной патологии, но в некоторых аспектах существенно уступали фармакологической активности спироциклического производного оксиндола.
Острая 25-минутная ишемия печени с последующей реперфузией сопровождалась значительной активацией процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ), увеличение уровня ТБК-ректантов и ДК в гомогенате печени и сыворотке крови в среднем в і,4-2,6 раза, при этом активность антиоксидантной системы ^ОС), судя по содержанию ВГ и активности каталазы, снижалась в l,5-l,8 раза (табл.з).
Соединение уу проявило выраженное антиоксидантное действие в виде нормализации баланса системы ПОЛ - AОС. Снижение процессов ПОЛ верифицировано по достоверному снижению ТБК-реактантов и ДК. Существенным положительным аспектом реализации антиоксидантного действия соединения уу является восстановление активности и неферментативного звена системы AОС (содержание ВГ), и ферментативного (активность каталазы). Aнтиокси-дантный эффект спироциклического производного оксиндола достоверно превышает активность вита - мелатонина и тиотриазолина практически по всем показателям.
Таким образом, фармакологическое действие соединения уу в значительной мере обеспечивается торможением перекисного окисления липидов с одновременным повышением ан-тиоксидантной системы.
Препараты сравнения вита-мелатонин и тиотриазолин достоверно нормализуют дисбаланс системы ПОЛ^ОС относительно группы контрольной патологии.
Маркером снижения белоксинетической функции печени является снижение концентрации общего белка у группы контрольной патологии в l,3 раза (табл. з).
Таблица 3.
Влияние спироциклического производного оксиндола и препаратов сравнения на проокси-дантно-антиоксидантный баланс и показатели, характеризующие функциональную активность печени у крыс с модельной патологией острой ишемии печени (n=6) (статистическая обработка результатов проведена с использованием критерия Стьюдента)
Показатель Условия эксперимента
Контроль псевдо- опериро- ванные Ишемия печени
Контрольная патология Соединение уу, 5 мг/кг Вита-мелатонин, 5 мг/кг Тиотриазолин, 48 мг/кг
Гомогенат печени
ТБК- реак-танти, мкмоль/г 78,8+0,98 208+4,94* 111+4,38 * # $ л 172+2,87 * ## 1б2+б,53 * ## $$
ДК, мкмоль/г 5,93+0,36 8,49+0,21** 6,65+0,24 ## лл 7,57+0,18 ** ### 7,00+0,26 ##
ВГ, усл. ед. 118 +3,83 72,2+ 2,80* 101+1,49 ** # $$ аа 82,9+з,0б * ### 91,9+2,87 ** ##
Каталаза, мкат/л 0,37 +0,02 0,21+ 0,02** 0,32+0,01 ** ## лл 0,27+0,01 ** ### 0,30+0,01 ** ##
Гликоген, мкг/мл 1243+48,4 722+21,4 * 1147+38,6 # $ 836+19,5 * ### 1022+44,3 *** ## $
Сыворотка крови
ТБК- реак-танти, кмоль/л 1,17+0,08 2,41+0,07* 1,63+0,07 ** # $$$ АА 2,07+0,09 * ### 1,88+0,06 * ##
ВГ, усл. ед. 61,9+2,35 41,1+ 2,09 ** 56,5+1,29 # #$$$ 50,3+1,17 ** ### 52,3+1,15 ** ##
Глюкоза, ммоль/л 8,79+0,07 5,55+0,19 * 7,40+0,23 ** ## $$$ 6,69+0,08 * ## 7,05+0,08 * #$$$
Общий белок, г/л 72,7+1,54 55,6+ 2,29 ** 68,2+1,85 # #$$$ 60,2+1,81 ** 64,4+1,59 *** ###
Церулоплазмин, г/л 0,43+0,03 0,68+0,02 ** 0,48+0,02 # $$$ 0,59+0,02 ** ### 0,52+0,01 *** #
Примечания:
1.Достоверные отличия с показателями группы псевдооперированного контроля * -р<0,001; ** -р<0,01; ***-р<0,05;
2. Достоверные отличия с показателями группы контрольной патологии # - р<0,001; ## - р<0,01; ###-р<0,05;
3. Достоверные отличия с показателями группы вита-мелатонина $- р<0,001; $$- р<0,01; $$$-
р<0,05;
4. Достоверные отличия с показателями группы тиотриазолина - р<0,01; л -р<0,05.
У животных группы контрольной патологии зарегистрированно повышение уровня церулоплазмина в 1,6 раз, что наряду с другими показателями характерено для острой фазы воспаления на фоне предшествующей ишемии.
Содержание гликогена в гепатоцитах на фоне острой нелеченной патологии значительно снижено на 31%, о нарушении участия печени в углеводном обмене свидетельствует достоверное снижение концентрации глюкозы в сыворотке крови (табл. 3).
Соединение 77 достоверно восстанавливает функциональную активность печени (белок-синтетическую - по уровню общего белка в крови; обмена углеводов - по нормализации содержания гликогена в печени и глюкозы в сыворотке крови), при этом эффективность нового соединения не уступает классическому гепатопротектору тиатриазолину и достоверно превышает вита-мелатонин.
Таким образом, 4,з'-спиро[(2-амино-3-нитрил-4,5-дигидропирано[з,2-с]хромен-5-он)-5-метил-2'-оксиндол] можно считать потенциальным эффективным гепатопротектором, как при токсическом так и при ишемическом поражении печени.
Выводы. На фоне острой 25 - минутной ишемии печени с последующей реперфузией новое вещество - 4,з’-спиро[(2-амино-з-нитрил-4,5-дигидропирано[з,2-с]хромен-5-он)-5-метил-2' -оксиндол] проявляет выраженное гепатопротекторное действие.
Политропные свойства изучаемого соединения обеспечивают воздействие на разные звенья патогенетического каскада в ишемизированной печени.
Гепатопротекторная активность изучаемого соединения по величине эффекта значительно превышает эффективность препаратов сравнения вита-мелатонина и тиотриазолина.
Литература
1. Ивашкин В.Т. Гастроэнтерология. Клинические рекомендации. М.: ГЭОТАР- Медиа, 2008. -
208 с.
2. Hypoxic hepatitis - epidemiology, pathophysiology and clinical management/[Fuhrmann V., Jäger B., Zubkova A. and al.]// Wien Klin Wochenschr.- 2010.- №122(5-6).- Р.129-139.
3. Ebert EC .Hypoxic liver injury// Mayo Clin Proc - 2006. - №81(9). - Р. 1232-1236.
4. Hypoxic hepatitis: underlying conditions and risk factors for mortality in critically ill patients/ [Fuhrmann V., Kneidinger N., Herkner H. and al.]// Intensive Care Med.- 2009.- №35(8). - Р.1397-1405.
5. Raurich J.M. Hypoxic hepatitis in critically ill patients: incidence, etiology and risk factors for mortal-ity/[Raurich J.M., Llompart J.A., Ferreruela M.] // J Anesth.- 2011,- №25 Щ.-Р.50-56.
6. Способ профилактики и лечения последствий ишемического воздействия на печень/ Перьков А.А., Лазаренко С.В. //Патент РФ на изобретение RU 2456678 С1, от 20.07.2012 Бюл. № 20.-14 с.
7. Цубанова Н.А.Скрининговые исследования антигипоксического действия спироциклических
2-оксиндольных производных 2-амино-3-нитрил-4н-пирана//Клінічна фармація.-2009.-Т.13. -
№. 2.-С.62-64.
8. Цубанова Н.А. Изучение гепатопротекторного действия спироциклического производного ок-синдола в условиях острого тетрахлорметанового гепатита// Фармакологія та лікарська токсикологія.-2012. -№3(28). -С.61-65.
HEPATOPROTECTIVE EFFECT ON SPIROCYCLIC OXINDOLIC DERIVATE IN THE CONDITIONS OF ACUTE LIVER'S ISCHEMIA
Influence the spirocyclic oxindolic derivate in a dose 5 mg/kg and preparations of comparison vita-melatonin (5 mg/kg) and thiotriazolin (48 mg/kg) on lethality on animals, activity of cytolysis, free-radical oxidization and functional activity of the liver in the conditions of acute experimental ischemia were studied.
The expressed antioxidant, anticytolytic action spirocyclic oxin-dolic derivate in dose 5 mg/kg is established. It is found that the total hepatoprotective effect of new substance exceeds activity of preparations of comparison of vita-melatonin and thiotriazolin.
Key words: spirocyclic oxindolic derivate, model acute liver 's ischemia, hepatoprotective effect
N.A. TSUBANOVA S.Yu. SHTRYGOL
National University of Pharmacy of Ukraine, Kharkiv
e-mail: [email protected]
