CC BY
55
Кутлунина H.A.*, Беляев А.Ю.**
*Уральский государственный университет им. А.М. Горького, Екатеринбург **Институт экологии растений и животных УрО РАН, Екатеринбург
ГЕНОТИПИЧЕСКОЕ РАЗНООБРАЗИЕ И КЛОНОВАЯ СТРУКТУРА В ПОПУЛЯЦИЯХ ДВУХ БЛИЗКОРОДСТВЕННЫХ ВИДОВ ТЮЛЬПАНА
НА ЮЖНОМ УРАЛЕ
Исследовано генотипическое разнообразие в трех популяциях стерильного триплоида - тюльпана приречного (Tulipa riparia) и двух популяциях диплоидного вида - тюльпана Биберштейна (T biebersteiniana) методом изоферментного анализа. Обсуждаются причины высокой генотипической изменчивости T riparia и возможные механизмы формирования клоновой структуры.
Введение
Большинство травянистых многолетних растений сочетают половое размножение с одной из форм вегетативного и, таким образом, обладают способностью формировать клоны. Соотношение семенного и вегетативного размножения зависит от внешних и внутренних факторов. Неблагоприятные условия среды ограничивают половое размножение и усиливают клональный рост. Большое влияние на баланс этих двух форм размножения оказывают генетические факторы [1]. Так, полиплоидизация может приводить к частичной или полной стерилизации и утрате полового размножения. Каковы эволюционные последствия перехода к клональному росту? Существует ли опасность того, что вегетативная репродукция приведет к снижению или потере генетического разнообразия в популяции? По-видимому, риск не очень велик, так как большинство видов сохраняет способность к половому размножению, а даже его низкий уровень может поддерживать генетическое разнообразие [2]. В то же время наличие семенного размножения не всегда гарантирует сохранение высокого уровня генетической изменчивости, так как различные факторы - дрейф генов, инбридинг и давление отбора могут приводить к генетическому истощению [3].
На Южном Урале произрастает тюльпан Биберштейна Tulipa biebersteiniana Shult. et Shult. fil. - евроазиатский степной вид, характеризующийся высоким полиморфизмом. Известно, что на большей части своего ареала вид представлен желтоцветковыми особями. Но в бассейне р. Белой, по ее притокам, стекающим с западного макросклона Уральских гор, преобладают розовоцветко-
вые особи. В 2001 году М.С. Князев, П.В. Куликов и Е.Г. Филиппов описали тюльпан приречный - Tulipa riparia Knjasev, Kulikov et Philippov, отличающийся от тюльпана Биберштейна более крупными размерами, преобладанием розовоцветковых форм, триплоид-ностью и отсутствием плодоношения [4]. П.В. Куликов [5] рассматривает T. riparia как трип-лоидную расу T. biebersteiniana и относит его к неморальным эндемикам Южного Урала. Увеличение числа особей тюльпана приречного происходит вегетативно. У большинства достаточно крупных луковиц в начале вегетационного периода образуется горизонтальный столон длиной 10-20 см. Впоследствии на конце столона формируется луковица, а столон отмирает. Со временем возникает клон не связанных между собой ра-мет, которые могут быть удалены друг от друга на достаточно большое расстояние. Виды с таким типом клонального роста называются «партизаны» (guerrilla) в отличие от видов с плотным клоном - «пучок» (phalanx) [3]. В связи с тем, что семенное размножение у тюльпана приречного ни в природе, ни в культуре не отмечено [4], можно было предполагать существование популяций, состоящих из одного или небольшого числа клонов. Однако наблюдения в природе и культуре выявили изменчивость окраски околоцветника [4;6], а исследования показали неоднородность особей одной популяции по уровню фертильности пыльцевых зерен [7]. В связи с этим целью нашего исследования была оценка генотипической изменчивости в трех популяциях T. riparia. Для сравнения мы исследовали популяции близкого, по-видимому, родительского вида -T. biebersteiniana, который также способен к
вегетативному размножению путем формирования столонов с дочерней луковицей, но в то же время не утрачивает семенного размножения. Для оценки генотипического разнообразия мы использовали метод изофер-ментного анализа. Данный метод успешно использован для идентификации сортов культурных тюльпанов [8; 9]. Для дикорастущих тюльпанов подобные исследования проводятся впервые.
Материал и методика
В 2005-2006 гг. исследованы три популяции T. riparia в районе среднего течения р. Сим (Челябинская область). Первая популяция - Сим расположена на пойменном злаково-крупнотравном лугу, между железнодорожным полотном и руслом реки Сим (в 10 км выше г. Аша). Вторая популяция - Куряк находится в пойме левобережного притока р. Сим - р. Куряк в одном км от устья, основные типы сообществ - пойменные злаково-крупнотравные луга и прирусловые уремные заросли. Третья популяция - Малоюз находится в одном км от станции Бьянка в пойме ручья Малоюз в составе черемухово-ольховых кустарниковых сообществ.
В 2006 г. исследованы две популяции T. biebersteiniana: в 3 км к юго-востоку от п. Халилово (популяция Халилово) и в окрестностях станции Губерля (популяция Губер-ля) (Оренбургская область). В популяции Халилово материал был собран в пяти микропопуляциях, расположенных в 200-500 м друг от друга. Три микропопуляции произрастают в межсопочных понижениях с луговой степью, четвертая - на лугу рядом с шоссе Орск - Кувандык, пятая - в уремных зарослях ручья, впадающего в р. Большая Каяла. В популяции Губерля материал собирали по двум межсопочным понижениям с временными водотоками.
Для изоферментного анализа и кариоло-гических исследований выкапывали растения, произрастающие на расстоянии не менее 2-3 м друг от друга. Для более детальной оценки распределения клонов у T. riparia были заложены трансекты протяженностью от нескольких десятков метров в небольшой популяции на р. Малоюз, до трех км - вдоль
берега р. Сим. На трансектах пробы включали все луковицы с площади 15х15 см.
Приготовление экстрактов для изофермен-тного анализа проводили по стандартной методике [10]. Для выявления органоспецифичной изменчивости изоэнзимов и сравнения их активности использовали различные органы тюльпанов: чешуи луковиц, столоны, зеленые ростки луковиц, листовые пластинки, стебли.
Для исследования влияния времени и условий хранения луковиц на активность изоферментов использовали: 1) экстракты из свежесобранных луковиц, 2) экстракты из хранившихся при комнатной температуре в течение 2-3 месяцев, а затем стратифицированных и проращенных луковиц, 3) то же без стратификации. Экстракты, приготовленные для анализа, хранили в морозильной камере при -800 С.
Электрофорез проводили в 6,4%-ном полиакриламидном геле в трис-ЭДТА-боратной системе по протоколу, описанному в работе В.Л. Семерикова и А.Ю. Беляева [10]. Для исследования были использованы 7 полиморфных ферментных систем: ЛБЫ - алкоголь-дегидрогеназа (К.Ф.1.1.1.1), 1БЫ - изоцитрат-дегидрогеназа (К.Ф.1.1.1.42), 6-РвБ - 6-фос-фоглюконатдегидрогеназа (К.Ф.1.1.1.43), 8кБЫ - шикиматдегидрогеназа (К.Ф. 1.1.1.25), Рв1 - фосфоглюкоизомераза (К.Ф.5.3.1.9), РвМ - фосфоглюкомутаза (К.Ф.5.4.2.2), С-Б8Т - колориметрическая эстераза (К.Ф.3.1.1.1.). В связи с триплоидностью тюльпана приречного интерпретация электрофо-реграмм в терминах «локус-аллель» невозможна. Анализ зимограмм для отдельных растений позволил выявить своеобразные сочетания бэндов (окрашиваемых полос) по каждой ферментной системе, которые мы интерпретируем как морфы. Идентичные сочетания морф по большинству систем у сравниваемых особей рассматривали как свидетельство принадлежности растений к одному изо-зимному фенотипу или генотипу (клону).
Генотипическое разнообразие оценивали с помощью модифицированного индекса разнообразия Симпсона, предложенного для клональных растений [11]: Б = 1-{[2п.(п. - 1)] /[N(N-1)]}, где п. - число выявленных в популяции изоэнзимных фенотипов 1 (и соответственно генотипов), N - общее число проана-
лизированных растений. Индекс разнообразия D варьирует от 0 в популяциях, состоящих из одного генотипа, до единицы в популяциях, где каждая особь является уникальным генотипом.
Результаты и их обсуждение
Исследование нескольких модельных растений тюльпанов показало, что все энзимные системы демонстрировали идентичность зи-мограмм, полученных для разных органов одного растения тюльпана. В то же время активность изоферментов органоспецифична. Максимальная активность отмечена в запасающих чешуях луковиц, столонах и прорастающих побегах луковиц, чуть ниже - в листьях и самая низкая активность - в стеблях.
Исследование влияния времени и условий хранения луковиц показало наибольшую интенсивность окрашивания в геле экстрактов из свежесобранных луковиц, удовлетворительная активность ферментов наблюдалась и после 2-3-месячного хранения при комнатной температуре и последующего прора-
щивания луковиц. Более длительное хранение луковиц приводило к значительному снижению активности изоэнзимов вплоть до полного исчезновения их окрашивания в гелях.
Изучение электрофореграмм позволило выделить морфы T. riparia и T. biebersteiniana по шести ферментным системам, причем у системы PGI использовали быструю (PGI1) и медленную (PGI2) зоны активности. Изофо-реграммы по колориметрической эстеразе не представлены в виде морф из-за множественности бэндов, хотя использованы нами для выявления генотипов (клонов).
По всем системам, кроме SkDH и C-EST, состав морф в двух популяциях T. biebersteiniana сходный, доля уникальных морф в каждой популяции невелика (табл. 1).
В популяции T. biebersteiniana Халилово выявлено 27 изозимных генотипов среди 57 проанализированных растений (табл. 2); 16 генотипов являются уникальными, то есть каждый представлен одной особью, остальные 11 встречаются неоднократно (от 2 до 9), что свидетельствует о формировании рас-
Таблица 1. Частота встречаемости морф ферментных систем T. biebersteiniana, %
Система Морфа Халилово Губерля Система Морфа Халилово Губерля
SkDH 1 8,77 0 PGI1 1 71,93 25
2 19,30 0 2 10,53 33,14
3 5,26 0 3 15,79 17,96
4 5,26 0 4 1,75 25
5 15,79 28,57 N 57 28
6 15,79 0 IDH 1 47,37 14,29
7 0 35,71 2 31,58 75
8 3,51 14,29 3 3,51 10,71
9 0 10,71 4 17,54 0
10 7,02 0 N 57 28
11 0 10,71 6- PGD 1 20,51 45,11
12 10,53 0 2 41,03 0
13 8,77 0 3 25,64 54,89
N 57 28 4 12,82 0
PGI2 1 24,56 33,33 N 39 24
2 17,54 0 PGM 1 87,24 51,55
3 8,77 0 2 4 11
4 0 3,70 3 8,76 0
5 19,30 7,40 4 0 37,45
6 17,54 0 N 37 27
7 3,51 11,11 ADH 1 23,91 48,6
8 1,75 0 2 47,83 7,44
9 1,75 7,4 3 10,87 0
10 3,51 25,93 4 13,04 43,96
11 1,75 11,11 5 4,35 0
N 57 27 N 46 24
Примечание: N - общее число растений, проанализированных по данной ферментной системе
Таблица 2. Генотипическое разнообразие в популяциях T. riparia и T. biebersteiniana
Вид Местонахождение Число рамет в выборке Число генет (генотипов) в выборке Индекс разнообразия Симпсона(D)
T. biebersteiniana 3 км к юго-западу от п. Халилово 57 27 0,94
T. biebersteiniana Окрестности ст. Губерля 28 12 0,95
T. riparia Р. Сим 45 10 0,82
T. riparia Р. Куряк 73 6 0,76
T. riparia Ручей Малоюз 43 7 0,77
селяющихся клонов. Все клоны представлены небольшим числом особей, которые находятся на ограниченном расстоянии друг от друга. В пойме ручья, впадающего в р. Большая Каяла, обнаружен триплоидный клон T. biebersteiniana (2n = 3x = 36). Это удалось установить по характеру бэндов системы SkDH (три бэнда встречаются только у триплоидых тюльпанов, у диплодных - один или два) и подтвердить кариологическими исследованиями. Ранее для T. biebersteiniana указывали только диплоидный (2n = 2x = 24) и тетрап-лоидный (2n = 4x = 48) уровни [12; 13].
В популяции T. biebersteiniana Губерля выявлено 12 изоэнзимных генотипов среди 28 растений (табл. 2). Четыре генотипа являются уникальными, 8 - представлены растениями расселяющихся клонов, в состав которых входит от 2 до 5 растений изученной выборки. Значение индекса разнообразия очень близко к популяции Халилово и составляет 0,95.
Таким образом, генотипическая структура популяций T. biebersteiniana свидетельствует о сочетании семенного размножения и клонального роста. Клоны расположены достаточно локально, так как отсутствуют особые факторы расселения луковиц.
В каждой популяции T. riparia по большинству ферментных систем имеется свой набор уникальных морф и только одна-две морфы являются общими для трех популяций (табл. 3).
В популяции T. riparia на р. Сим обнаружено 10 изозимных генотипа в выборке из 45 растений. Три генотипа являются уникальными, остальные встретились неоднократно, свидетельствуя о формировании клонов. В них насчитывалось от 2 до 16 растений. Наиболее часто встречались два генотипа, их
доли в популяции - 25,5 и 34%. Растения из этих клонов имеют розовую окраску околоцветника. Именно эти клоны далеко расселились вдоль р. Сим и были собраны на протяжении 3 км вдоль русла.
В популяции на р. Куряк выявлено 6 генотипов среди 73 исследованных растений. Три генотипа преобладают, составляя 35,6, 31,5 и 20,5%. Им свойственна соответственно розовая, желтая и светло-желто-розовая окраска околоцветника.
В популяции на р. Малоюз наблюдалось 7 генотипов на 43 растения. Все генотипы представлены нешироко расселившимися клонами.
Таким образом, установлено, что во всех трех популяциях стерильного триплоида T. riparia генотипическое разнообразие несколько ниже, чем у родственного T. biebersteiniana, способного к семенному размножению, но выше, чем в среднем у клональных видов. N. Ellstrand и M. Roose [11] проанализировали данные по 21 клональному виду, средний индекс разнообразия, подсчитанный ими, составил 0,62. Генотипическое разнообразие имеет тенденцию незначительно возрастать от притоков (р. Куряк и ручей Малоюз) к принимающей их реке (Сим). Интересно то, что для каждой популяции нами обнаружен свой набор генотипов, то есть ни один генотип не встречается в двух популяциях. Такой высокий уровень генетической изменчивости между популяциями считается атипичным для клональных видов, хотя был отмечен у клонального бромелиевого - экмеи и тополя осинообразного [3].
Каковы причины высокого внутрипопу-ляционного генетического разнообразия клональных видов, в том числе T. riparia? В качестве возможных причин называются:
сохранение способности к половому размножению [14]; специализация по местообитаниям, когда различные клоны занимают участки с разными микроусловиями [3]; соматические мутации [15]; многократное происхождение видов [16]. Применительно к T. riparia более предпочтительными являются первая и последняя причины. Несмотря на триплоидность тюльпана и на то, что плодоношения в природе не обнаружено, нельзя полностью исключать наличие редкого семенного размножения, а такие случаи приводят к рекомбинации и сохранению генетического разнообразия. Известны факты, когда нечетные полиплоиды, в том числе трип-лоиды, иногда способны формировать семена. Редкое семенное размножение отмечено у триплоидов сусака зонтичного [17] и хлебного дерева [18].
Мы определяли фертильность пыльцы у растений T. riparia из популяции на р. Куряк [7]. Средний показатель составляет 42,6%, диапазон варьирования - от 11,8 до 77,1%. Исследование женской репродуктивной сферы показало наличие значительных нарушений развития, приводящих к полной дегенерации семяпочек более чем у половины исследованных растений. В то же время обнаружены растения с нормальными семяпочками, в которых формируются зародышевые мешки Eryostemones-типа. Таким образом, состояние репродуктивной сферы T. riparia свидетельствует о возможности спорадического семенного размножения. Фактором, ограничивающим или исключающим этот процесс, является фитоценотическая обстановка злаково-крупнотравного пойменного луга. Вызреванию семян препятствует густой травостой высотой более 1 м, а прорастанию семян - значительное задернение.
По-видимому, одним из источников генотипической изменчивости T. riparia является его аллополиплоидная природа, установленная нами при изучении кариотипа и дифференциальном окрашивании хромосом [19]. У аллополиплоидов возможны различные комбинации родительских геномов и как следствие - неоднородность видов [16]. Еще одним источником изменчивости аллополиплоидов являются хромосомные и ге-
Таблица 3. Частота встречаемости морф ферментных систем T. riparia, %
Система Морфа Сим Куряк Малоюз
Skdh 1 23,91 26,67 19,05
2 36,96 0 0
3 26,09 0 0
4 2,17 0 0
5 4,35 4 33,33
6 6,52 0 0
7 0 36 0
8 0 30,67 0
9 0 2,67 0
10 0 0 19,05
11 0 0 9,52
12 0 0 19,05
N 46 75 42
Pgi2 1 26,09 1,59 51,28
2 32,61 0 0
3 36,96 0 0
4 4,35 0 0
5 0 41,27 17,95
6 0 53,97 0
7 0 3,17 0
8 0 0 20,51
9 0 0 7,69
10 0 0 2,56
N 46 63 39
Pgi1 1 47,73 43,33 73,53
2 27,27 11,67 17,65
3 15,90 45 8,82
4 9,09 0 0
N 44 60 34
Idh 1 48,84 41,67 0
2 34,88 6,94 61,11
3 2,33 0 0
4 6,98 0 0
5 6,98 34,72 38,89
6 0 16,67 0
N 43 72 36
6-Pgd 1 33,33 4,48 18,92
2 15,56 0 0
3 33,33 61,19 0
4 17,78 0 0
5 0 31,34 81,08
6 0 2,99 0
N 45 67 37
Pgm 1 83.73 74,3 86,80
2 11,12 10,52 13,20
3 5,15 15,18 0
N 43 65 36
Adh 1 40 0 0
2 17,50 0 0
3 32,50 0 0
4 5 0 0
5 5 0 0
6 0 32,84 0
7 0 62,69 0
8 0 4,48 0
9 0 0 5,13
10 0 0 33,33
11 0 0 41,03
12 0 0 20,51
N 40 67 39
Примечание: N - общее число растений, проанализированных по данной ферментной системе
номные перестройки, увеличивающие структурный полиморфизм и пластичность вида [20; 21].
Анализ пространственной структуры популяций T. riparia позволил выявить ряд закономерностей. Как и все «партизаны», T. riparia формирует рыхлые взаимопроникающие клоны, поэтому в одной пробе вдоль трансекты можно обнаружить два и даже три генотипа. Расселение клонов вдоль русел рек и ручьев происходит за счет мощных водных потоков в периоды весенних и летних павод-
ков. Так, в 2005 и 2006 гг. на р. Куряк мы наблюдали в весенний период, как происходит размывание берега и дернины, на которых произрастает тюльпан, падают в воду и луковицы переносятся по течению. Поэтому на р. Куряк мы встречаем один и тот же клон на протяжении километра по течению реки, а на р. Сим - на протяжении 3-х км. Отбор проб по трансекте вдоль реки показал, что максимальное генетическое разнообразие и высокая мозаичность распределения клонов обнаруживаются именно здесь.
Список использованной литературы:
1. Eckert C.G. The loss of sex in clonal plants // Evol. Ecol. 2002. 15. P. 501-520.
2. Silander J.A. Microevolution in clonal plants // Population biology and evolution of clonal organisms. 1985. New Haven. P. 107-152.
3. Mclellan A.J., Prati D., Kalts O., Schmid B. Structure and analysis of phenotypic and genetic variation in clonal plants // In: The ecology and evolution of clonal plants Edd. H. De Kroon and J van Groenendael. Backhuys Publishers, Leiden, 1997. P. 185-210.
4. Князев M.C., Куликов П.В., Филиппов Е.Г. Тюльпаны родства Tulipa biebersteiniana (Liliaceae) на Южном Урале // Бот. журн. 2001. Т.86. №3. C. 109-119.
5. Куликов П.В. Конспект флоры Челябинской области (сосудистые растения). Екатеринбург - Миасс: «Геотур». 2005. 537 с.
6. Беляев А.Ю., Князев M.C. Раноцветущие декоративные многолетники уральской флоры, перспективные для озеленения // Новые декоративные растения в культуре на Среднем Урале: Сб. науч. трудов. Свердловск: УНЦ АН СССР, 1986. C. 3-12.
7. Кутлунина Н.А., Жеребцова М.И., Зимницкая С.А. Размер и качество пыльцевых зерен видов Tulipa (Liliaceae) и Saxifraga (Saxifragaceae) разной плоидности // Бот. журн. 2006. Т. 91. №11. С. 1695-1704.
8. Booy G, Donkers-Venne T.H.M., van der Schoot J. Identification of tulip caltivars based on polymorphism in esterase isozymes from bulb scales // Euphytica. 1993. 69. P. 167-176.
9. Booy G., Van Raamsdonk L.W.D. Variation in the enzyme within and between Tulipa species; usefulness for the analysis of genetic relationships at different taxonomical level // Biochemical Syst. and Ecol. 1998. 26. P. 199-224.
10. Семериков В.Л., Беляев А.Ю. Аллозимный полиморфизм в природных популяциях и культурных сортах клевера лугового (Trifolium pretense L.) // Генетика. 1995. 31. №6. С. 815-819.
11. Ellstrand N.C., Roose M.L. Pattern of genotypic diversity in clonal plant species // Amer. J. Bot. 1987. Vol. 74. P. 123-131.
12. Бочанцева З.П. Тюльпаны: морфология, цитология и биология. Ташкент, 1962. 408 с.
13. Данелия И.М. К кариосистематике некоторых кавказских представителей рода Tulipa (Liliaceae) // Бот. журн. 1989. Т. 74. №2. С. 193-200.
14. Pornon A., Escaravage N., Till-Bottraud I., Doche B. Variation of reproductive traits in Rhododendron ferrugineum L. (Ericaceae) populations along a successional gradient // Plant Ecology. 1997. Vol. 130. P. 1-11.
15. Eckert C.G. Clonal plant research: proliferation, integration, but not much evolution // Amer. J. Bot. 1999. 86 (11). P. 16491654.
16. Soltis P.S., Soltis D.E. The role of genetic and genomic attributes in the success of polyploids // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2000. Vol. 97. №13. P. 7051-7057.
17. Eckert C.G., Massonnet B., Thomas J.J. Variation in sexual and clonal reproduction among introduced populations of flowering rush, Butomus umbellatus (Butomaceae) // Can. J. Bot. 2000. 78. P. 437-446.
18. Ragon D. Chromosome number and pollen stainability of three species of Pacific Island breadfruit (Artocarpus, Moraceae) // Amer. J. Bot. 2001. 88 (4). P. 693-696.
19. Кутлунина Н.А., Коцеруба В.В. Дифференциальное окрашивание хромосом тюльпанов секции Eriostemones (Liliaceae), произрастающих на Южном Урале, в связи с проблемами эволюции группы // Материалы конференции по морфологии и систематике растений, посвященной 300-летию со дня рождения Карла Линнея. М. 2007. С. 115-117.
20. Козлова А.А, Карташева Н.Н. Адаптивная роль структурного полиморфизма триплоидов Paris quadrifolia L. // Популяции растений (генетическая и цитогенетическая структура): Межвуз. Сб. Л.:Изд-во Ленингр. Ун-та, 1979. С. 132-145.
21. Leitch I.J., Bennet M.D. Polyploidy in angiosperms // Trends Plant Sci. 1997.12. P. 470-476.
Работа выполнена при поддержке гранта РФФИ №07-04-00768-а.
