CC BY
3УДК 616.34-002.1-053.2-06:616.98
Н.В. Полякова1, Г.В. Семейко2, Е.О. Самойлович2
ГЕНОТИПИЧЕСКИЙ ПЕЙЗАЖ РОТАВИРУСОВ -ЭТИОЛОГИЧЕСКИХ АГЕНТОВ ОСТРЫХ ГАСТРОЭНТЕРИТОВ У ДЕТЕЙ В Г. МИНСКЕ В 2012-2013 ГГ.
1 УО «Белорусский государственный медицинский университет» Республика Беларусь, 220116, г. Минск, пр-т. Дзержинского, 83 Республиканский научно-практический центр эпидемиологии и микробиологии Республика Беларусь, 220114, г. Минск, ул. Филимонова, 23
Введение
В настоящее время острые кишечные инфекции занимают одно из ведущих мест среди инфекционных заболеваний, уступая по частоте лишь гриппу и острым респираторным инфекциям. Ротавирусы являются наиболее распространенной причиной тяжелого гастроэнтерита у детей младшего возраста во всем мире [1]. Ежегодно регистрируется более 100 млн. случаев ротавирусного гастроэнтерита, являющегося причиной 2 млн. госпитализаций и около 600 тыс. смертей детей в возрасте до 5-ти лет, при этом до 80% летальных случаев приходится на развивающиеся страны Юго-Восточной Азии, Африки и Латинской Америки [2, 3]. Однако эпидемиологические исследования показывают, что и в экономически развитых странах данная проблема стоит достаточно остро [4, 5].
Согласно данным официальной регистрации, в Республике Беларусь ежегодно выявляется 3-5 тысяч заболевших ротавирусной инфекцией (2008 г. - 3553, 2009 г. - 4013, 2010 г. - 5113, 2011 г. - 5206, 2012 г. - 3901). Подавляющее большинство заболевших (до 80%) - это дети в возрасте 0-2 года [6, 7] . Практически все зарегистрированные случаи ротавирусной инфекции - это случаи, потребовавшие госпитализации, что и определяет высокую социально-экономическую значимость данной инфекции.
Ротавирусы принадлежат к роду Rotavirus, который по наличию группоспецифического антигена VP6 разделен на семь групп, обозначаемых буквами латинского алфавита от А до G [8]. Наибольший интерес в клинической вирусологии вызывают ротавирусы группы А. Зрелый вирион ротавируса лишен липопо-лисахаридной оболочки, имеет сферическую
форму и состоит из ядра, включающего в себя геном, представленный одиннадцатью сегментами двуцепочечной РНК и окруженный тремя концентрическими слоями белковых оболочек [8]. Инфекционной активностью обладают только зрелые трехслойные частицы вируса. Каждый геномный сегмент РНК кодирует один вирусный белок (за исключением 11-го сегмента, кодирующего два белка): 6 структурных (УР1-"УР6) и 6 неструктурных (ШР1-ШР6) [8,9].
Идентификацию серотипа ротавируса осуществляют на основании антигенной специфичности его поверхностных структурных белков 'УР4 (Р-тип) и 'УР7 ^-тип). При этом определение серотипа ротавируса является достаточно трудоемкой задачей и требует соответствующих реагентов (моноклональных антител), поэтому при характеристике вируса определяют его генотип. При этом для G-типа серотипы и генотипы вируса совпадают. В то же время, число Р-генотипов значительно превышает число Р-серотипов, поскольку гены, кодирующие один и тот же Р-серотип, могут различаться. Чтобы избежать путаницы в обозначениях, Р-генотип записывается в квадратных скобках: Р[8], Р[4] и др.
К настоящему времени выявлено 27 различных G-генотипов и 35 Р-генотипов рота-вирусов [10]. Теоретически при произвольной комбинации G- и Р-типов может образоваться огромное количество различных вариантов ротавирусов, однако реально выявляемое число G/P-комбинаций оказывается значительно меньшим и составляет не более 70 [10]. В Европе и в мире в целом наиболее широко распространены 5 генотипов ротавирусов: G1P[8], G2P[4], G3P[8], G4P[8] и G9P[8] [11].
Однако пейзаж циркулирующих в различных регионах мира ротавирусов имеет свои особенности и изменяется с течением времени. Например, генотипы ротавирусов, которые редко встречаются в Европейском регионе, достаточно широко распространены в Африканском [12].
В последнее десятилетие интерес к проблеме ротавирусной инфекции возрос в связи с разработкой, лицензированием и внедрением ротавирусной вакцины в национальные программы иммунизации. Плановая специфическая вакцинопрофилактика этой инфекции в Республике Беларусь пока не проводится.
Для определения целесообразности внедрения вакцинопрофилактики требуется изучение не только бремени заболеваемости, но и определение генетического пейзажа циркулирующих ротавирусов.
Таким образом, целью данного исследования было определение генотипического пейзажа ротавирусов, циркулировавших в 2012-2013 гг. в г. Минске, выявление преобладающих генотипов в период подъема заболеваемости ротавирусной инфекцией и в межсезонный период, а также установление смены доминирующих штаммов на протяжении нескольких лет.
Материалы и методы
Материалом для изучения генетического разнообразия ротавирусов, циркулировавших в 2012-2013 гг. в г. Минске, являлись 163 образца стула (65 - в 2012 г. и 98 - в 2013 г.) от детей с лабораторно подтвержденным диагнозом ротавирусного гастроэнтерита, госпитализированных в УЗ «Городская детская инфекционная клиническая больница» г. Минска (ГДИКБ) в анализируемый период времени.
Диагностику ротавирусной инфекции осуществляли на основании детекции антигена ротавируса в образцах стула с использованием отечественной иммуноферментной тест-системы «РОТА-АГ» производства РНПЦ эпидемиологии и микробиологии.
Образцы для генотипирования были взяты пропорционально количеству случаев заболевания, зарегистрированных в каждом месяце (рис. 1)
вш число проб количество случаев РВИ
Рис. 1. Распределение проб, отобранных для генотипирования, по месяцам: а) в 2012 г.; б) в 2013 г.
Выделение РНК ротавирусов из предварительно приготовленной 10%-ной суспензии стула выполняли с использованием автоматической системы для выделения нуклеиновых кислот на магнитных частицах MagMAX Express (Applied Biosystems, США) с наборами 5X MagMAX-96 Viral Isolation kit (Ambion, США). Генотипирование ротавирусов осуществляли с помощью мультиплексной
полугнездовой ОТ-ПЦР. Для амплификации фрагмента гена VP7 с целью последующего G-генотипирования использовали прайме-ры 9con1L и"УР7-К [13]. Для амплификации фрагмента гена VP4 с целью последующего P-генотипирования использовали праймеры con3 и con2 [13]. ОТ-ПЦР проводили в один раунд с использованием набора QIAGEN OneStep RT-PCR kit, QIAGEN (Германия),
содержащего смесь ферментов: обратные транскриптазы Omniscript и Sensiscript и Hot-StarTaq ДНК полимеразу. Реакцию проводили в следующих условиях: обратная транскрипция - 30 мин при 42 °С, денатурация смеси обратных транскриптаз и активация полиме-разы - 15 мин при 95 °С и 40 циклов амплификации. Каждый цикл включал: денатурацию
Результаты
Проведенное генотипирование 163 рота-вирусов по генам, кодирующим структурные белки VP7 и VP4, позволило идентифицировать G-генотип ротавирусов во всех исследуемых образцах, P-генотип - в 162 (99,4 ± 0,6%) образцах.
Как известно, применение полугнездовой мультиплексной ОТ-ПЦР позволяет успешно определить генотип ротавирусов, но в то же время данный метод разработан преимущественно для выявления широко распространенных генотипов (G1-4, G9 и P[4], P[6], P[8], P[9]) и не включает необходимый набор праймеров для детекции редко встречающихся генотипов и необычных для данного региона G-P-комбинаций.
В исследуемых пробах за два года исследования в различных сочетаниях были выявлены 3 Р- и 5 G-генотипов ротавируса. Так, среди Р-генотипов наиболее распространенным оказался Р[8], обнаруженный в 150 пробах (92 ± 2%). Достоверно реже выявлялись генотип Р[4], идентифицированный в 11 пробах (6,7 ± 1,9%), и генотип Р[9] (0,6 ± 0,5%), обнаруженный только в 1 образце в 2013 г. Полученные данные соответствуют данным литературы, согласно которым, наиболее часто встречающимися и повсеместно распространенными Р-генотипами являются варианты Р[8] и Р[4] [12].
Наиболее часто выявляемым G-типом был G4, идентифицированный в 104 образцах из 163 (63,8 ± 3,8%). На втором месте был G1, выявленный в 20 пробах (12,3 ± 2,6%). Третьим по частоте оказался G3, обнаруженный в 17 образцах (10,4 ± 2,4%), четвертым - G2 (в 11 пробах; 6,7 ± 2%), пятым - G9, идентифицированный лишь в 7 образцах (4,3 ± 1,5%).
Поскольку гены, кодирующие два связанных с нейтрализацией протеина (VP7(G) и VP4(P)), расщепляются независимо, современная классификация ротавирусов учитывает характеристику
при 94 °С - 30 с, отжиг праймеров при 42 °С -30 с, элонгацию при 72 °С - 45 с. Для второго раунда использовали набор специфических праймеров для определения G- и P-генотипов [14]. Синтез ПЦР-продуктов анализировали методом электрофореза в 3%-ном агарозном геле с добавлением красителя Gelstar 10000X, Lonza (США) для визуализации ДНК.
и обсуждение
обоих этих генов. Таким образом, в г. Минске в 2012-2013 гг. были распространены 6 генетических G-P-вариантов ротавируса: G4P[8], G1P[8], G3P[8], G2P[4], G9P[8] и G3P[9] (рис. 2). Доминирующим на протяжении двух лет анализа среди всех генотипов был G4P[8], обнаруженный в 104 пробах (63,8 ± 3,8%), при этом его удельный вес возрос от 55,4 ± 6% в 2012 г. до 69,3 ± 5,5% в 2013 г. Вторым по распространенности генотипом стал G1P[8], составивший 12,3 ± 2,6% и идентифицированный в 20 пробах из 163. Вклад данного генотипа был равнозначным в 2012 г. и 2013 г. и составил 12,3 ± 4% (8 из 65) и 12,2 ± 3,3% (12 из 98) соответственно. Третьим по частоте выявления в 2013 г. стал, занимавший в 2012 г. второе место, генотип G3P[8], доля которого составила 9,8 ± 2,3% (16 из 163) и снизилась с 21,5 ± 5% (14 из 65) в 2012 г. до 2 ± 1,4% (2 из 98) в 2013 г. В 6,7 ± 1,9% проб был идентифицирован, занявший четвертое место, генотип G2P[4] (11 из 163), выявляемый с частотой 6,2 ± 2,9% и 7,1 ± 2,5% в 2012 г. и 2013 г. соответственно. Разнозначный вклад (6,1 ± 1,9%) в генотипический пейзаж ротавирусов внес и генотип G9P[8], обнаруженный в 4 пробах в 2012 г и 7 пробах в 2013 г. На последнем месте оказался генотип G3P[9], идентифицированный только в 1 пробе (0,6 ± 0,5%) в 2013 г.
Пейзаж циркулирующих в 2012-2013 гг ротавирусов не являлся постоянным в течение года. Наибольшее генотипическое разнообразие изо-лятов приходилось на первую половину года (с декабря по май включительно), которая соответствует сезонному подъему ротавирусной инфекции. Так, в течение данного времени генотипи-ческий пейзаж включал 6 различных генотипов ротавируса: G4P[8], G1P[8], G3P[8], G2P[4], G9P[8] и G3P[9]. В межсезонный период выявляемые ротавирусы характеризовались меньшим разнообразием и были представлены генотипами G4P[8], G1P[8], G3P[8] и G2P[4] (рис. 3)
Рис. 3. Сезонное распределение различных генотипов ротавируса, циркулирующих в г. Минске:
а) в 2012 г.; б) в 2013 г.
Рис. 2. Генотипический пейзаж ротавирусов, циркулировавших в г. Минске в 2012-2013 гг.
Из полученных данных видно, что ротавиру-сы генотипа G4P[8] сохраняли свои лидирующие позиции на протяжении двух лет анализа и выявлялись ежемесячно. При этом вклад данного генотипа снижался в сезонный подъем ротавирусной инфекции и возрастал в межсезонный период. Так, доля генотипа G4P[8], составлявшего в межсезонный период 77,7 ± 9% в 2012 г. и 84,6 ± 7% в 2013 г., снизилась до 50 ± 6,6% и 64 ± 5,6%, соответственно, в сезонный подъем.
В течение каждого из двух лет наблюдения ротавирусы генотипа G2P[4] регистрировались только в первой половине года и вносили в генотипический пейзаж ротавирусов, циркулировавших с января по май, от 8,3 ± 3,9% (в 2012 г.) до 11 ± 3,9% (в 2013 г.). Преимущественно в первой половине 2012 г. выявлялся
и генотип G3P[8], который обусловил 27,1 ± 5,5% случаев острого гастроэнтерита (ОГЭ), выявленных в период с января по июнь, и только 5,9 ± 2,9% гастроэнтеритов, выявленных во второй половине года. В 2013 г. вклад генотипа G3P[8] был существенно ниже (2 ± 1,5%) и вирусы данного генотипа обнаруживались только в январе и апреле.
Сезонные различия в течение двух лет наблюдались и в отношении генотипа G1P[8]. Так, в 2012 г. циркуляция ротавирусов генотипа G1P[8] активизировалась, начиная со второй половины года, и увеличилась по сравнению с первой почти в три раза. На долю этого генотипа пришлось 8,3 ± 3,4% ротавирусных ОГЭ первой половины года и 23,5 ± 5,2% второй половины года. В 2013 г. ситуация изменилась, и вклад генотипа G1P[8] был прак-
тически равнозначен как в первой, так и во второй половинах года (13,4 ± 4% и 9,6 ± 5% соответственно).
Генотип G9P[8] циркулировал в популяции ротавирусов только в течение нескольких месяцев (с января по май в 2012 г.; с ноября по февраль в 2013 г.). Так, в 2012 г. доля этого генотипа составила 10 ± 5% от всех генотипов, выявленных с января по май. В 2013 г. вклад генотипа G9P[8] возрос, составив 18,4 ± 4% от всех вирусов, зарегистрированных с ноября по февраль.
Генотип G3P[9] был идентифицирован только в 1 образце в апреле 2013 г.
Сравнение пейзажа ротавирусов 2012-2013 гг с предыдущими годами показывает, что ротави-рус G4P[8], являвшийся доминирующим в Республике Беларусь в 2008-2009 гг. и несколько
утративший свои позиции в 2010-2011 гг., в 2012-2013 гг. опять вышел на первое место в структуре заболеваемости. Удельный вес генотипа G3P[8], доминировавшего в 2011 г. (66,7%) и занимавшего второе место по частоте выявления в 2012 г. (21,5%), снизился до 2% в 2013 г. Доля генотипа G1P[8], который считается наиболее широко распространенным в мире, в 20122013 гг. в сравнении с 2011 г. несколько выросла (с 4,4% до 12,3% в 2012 г. и 12,2% в 2013 г.), однако по-прежнему в Республике Беларусь удельный вес этого генотипа продолжает оставаться невысоким. Следует отметить, что ротавирусы генотипа G9P[8] встречаются в Республике Беларусь редко (по одному образцу было выявлено в 2008 и 2010 гг., 3 образца - в 2012 г., 7 образцов - 2013 г.), хотя частота обнаружения этого генотипа вируса в мире растет [13].
Заключение
Систематически проводимый в Республике Беларусь молекулярно-эпидемиологический мониторинг популяции ротавирусов позволяет определить спектр циркулирующих штаммов, выявить доминирующие генотипы, своевременно отслеживать их смену, осуществлять прогнозирование эпидемической ситуации.
Так, исследование генетического разнообразия циркулирующих в г. Минске ротавирусов, проведенное в 2012-2013 гг., показало, что в анализируемый период времени регистрировалось 6 генетических G-P-вариантов ротавируса, более 99% из которых составляли ротавирусы широко распространенных генотипов: G1P[8], G2P[4], G3P[8], G4P[8] и G9P[8]. При этом доминирующим генотипом на протяжении двух лет анализа являлся G4P[8], составивший от 55,4 ± 6% в 2012 г. до 69,3 ± 5,5% в 2013 г. и регистри-
руемый как в сезонный подъем ротавирусной инфекции, так и в межсезонный период. Далее по убывающей следовали комбинации G1P[8] (12,3 ± 2,6%), G3P[8] (9,8 ± 2,3%), G2P[4] (6,7 ± 1,9%), G9P[8] (6,1 ± 1,9%), G3P[9] (0,6 ± 0,5%).
Наряду с вышеперечисленными генотипами, которые удалось установить при помощи полугнездовой мультиплексной ОТ-ПЦР, был выявлен генотип, нетипируемый данным методом по белку VP4 (P-тип). Исходя из этого, особый интерес представляет проведение сек-венирования данного вируса, для того, чтобы определить, относится ли он к новому (или редко встречающемуся) генотипу, либо в процессе естественной эволюции вируса произошли нуклеотидные замены в анализируемом участке генома, не позволяющие типировать его с помощью применяемых нами праймеров.
Список использованных источников
1. Wilhelmi, I. Viruses causing gastroenteritis / I. Wilhelmi, E. Roman, A. Sanchez-Fauquier // Clin. Microbiol. Infect. - 2003. - Vol. 9 (4). - P. 247-262.
2. WHO estimates of the causes of death in children / J. Bryce [et al.] // Lancet. - 2005. -Vol. 365 (9465). - P. 1147-1152.
3. Global illness and deaths caused by Rotavirus / U. Parashar [et al.] // Emerg. Inf. Dis. -2003. - Vol. 9. - № 2. - P.565-540.
4. Burden of severe rotavirus disease in Australia / A T. Newall [et al.] // J. Paediatr. Child
Health. - 2006. - Vol. 42 (9). - P. 521-527.
5. Burden of rotavirus disease in European Union countries / M. Soriano-Gabarro [et al.] // Pediatr. Infect. Dis. J. - 2006. - Vol. 25 (Supp. 1). - P. S7-S11.
6. Ротавирусная инфекция в Беларуси / В.Г. Гудков [и др.] // Здравоохранение. -2008. - № 11. - С.8-13.
7. Ротавирусные гастроэнтериты у детей в г. Минске в 2012 г.: распространенность, сезонность, возрастное распределение,
генотипический пейзаж возбудителя / Е.О. Самойлович [и др.] // Медицинский журнал. - 2013 - № 4 - С. 95-98.
8. Pathogenesis of rotavirus gastroenteritis / M.K. Estes [et al.] // Novartis. Found. Symp. -2001. - Vol. 238. - P. 82-96.
9. Jayaram, H. Emerging themes in rotavirus cell entry, genome organization, transcription and replication / H. Jayaram, M.K. Estes, B.V. Prasad // Virus Res. - 2004. - Vol. 101 (l). -P. 67-81.
10. Uniformity of rotavirus strain nomenclature proposed by the Rotavirus Classification Working Group (RCWG) / J. Matthijnssens // Archives of virology. - 2011. - P. 156, 13971413.
11. Iturriza-Gomara, M. Rotavirus genotypes
co-circulating in Europe between 2006 and 2009 as determined by EuroRotaNet, a pan-European collaborative strain surveillance network / M. Iturriza-Gomara, T. Dallman, K. Banyai // Epidemiology and infection. - 2011. - P. 139, 895-909.
12. World Health Organization. Global Rotavirus Information and Surveillance Bulletin. -2013. - Vol. 7. - P. 11
13. Identification of group A rotavirus gene 4 types by polymerase chain reaction / J.R. Gentsch [et al.] // J. Clin. Microbiol. - 1992. - Vol. 30. -№ 6. - P. 1365-1373.
14. Polymerase chain reaction amplification and typing of rotavirus nucleic acid from stool specimens / V. Gouvea [et al.] // J Clin Microbiol. - 1990. - Vol. 28. - P. 276-82.
Дата поступления статьи 24 апреля 2014 г.
