CC BY
29ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
Научная статья
https://doi.org/10.36233/0372-9311-208 ► Check for updates
Молекулярно-генетические особенности ротавирусов группы А, выявленных в Москве в 2015-2020 гг.
Петруша О.А.1Н, Корчевая Е.Р.1, Минтаев Р.Р.1, Исаков И.Ю.1, Никонова А.А.1, Мескина Е.Р.1,2, Ушакова А.Ю.2, Хадисова М.К.2, Зверев В.В.3, Файзулоев Е.Б.1
1Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток имени И.И. Мечникова, Москва, Россия; 2Московский областной научно-исследовательский клинический институт имени М.Ф. Владимирского, Москва, Россия;
3Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова (Сеченовский Университет), Москва, Россия
Аннотация
Цель работы — анализ генетических характеристик штаммов ротавирусов группы А (РВА), циркулировавших в Москве в 2015-2020 гг., включая редкие штаммы, нетипируемые методом полимеразной цепной реакции (ПЦР).
Материалы и методы. Исследовали 289 фекальных образцов от детей в возрасте от 1 мес до 17 лет, госпитализированных с острым гастроэнтеритом. Выявление ротавирусов в образцах проводили методами иммунохроматографии и обратной транскрипции (ОТ) с ПЦР в реальном времени (ОТ-ПЦР-РВ). Секвени-рование ротавирусного генома проводили по Сэнгеру и методом нанопорового секвенирования. Результаты и обсуждение. В 131 клиническом образце была выявлена РНК РВА, в 125 случаях из них был установлен в/[Р]-генотип. В общей структуре преобладали штаммы РВА с генотипом 39Р[8]!1 (37%), за ними следовали варианты в3Р[8]!2, G4P[8]I1, G2P[4]I2, G1P[8]I1 и в3Р[8]!1 (18, 15, 11, 5 и 2% соответственно). Семь (5%) изолятов были идентифицированы как ЭхР[8]. В 2015-2020 гг. в регионе снизилась частота встречаемости генотипа G4P[8]I1 (с 39 до 9%) и выросла доля генотипа Э9Р[8]!1 (с 6 до 37%) по сравнению с 2009-2014 гг. В 2018-2020 гг. выявлена высокая доля не встречавшегося ранее DS-1-подоб-ного реассортантного штамма Б3Р[8]!2, широко распространившегося в мире в последние годы, Методом нанопорового секвенирования проведён анализ генома штамма Э3Р[8]!2 и редкого штамма G4P[6]I1. Для штамма G4P[6]I1 установлена тесная филогенетическая связь с ротавирусами свиней. Заключение. За последние годы в генетической структуре РВА, циркулирующих на территории московского региона, произошли существенные изменения. Полученные результаты свидетельствуют о необходимости постоянного мониторинга ротавирусной инфекции и выборочного секвенирования генов РВА для уточнения данных типоспецифической ОТ-ПЦР-РВ. Из-за постоянных изменений генетического состава циркулирующих штаммов РВА требуется периодическая оптимизация систем генотипирования РВА на основе ОТ-ПЦР-РВ.
Ключевые слова: ротавирусы группы А, острый гастроэнтерит, G/[P]-генотипирование, нанопоро-вое секвенирование
Этическое утверждение. Исследование проводилось при добровольном информированном согласии пациентов. Протокол исследования одобрен Этическим комитетом НИИВС им. И.И. Мечникова (Протокол № 6 от 24.09.2021).
Источник финансирования. Работа выполнена в рамках государственного задания Министерства науки и высшего образования Российской Федерации (тема № 0525-2019-0037).
Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.
Для цитирования: Петруша О.А., Корчевая Е.Р, Минтаев Р.Р., Исаков И.Ю., Никонова А.А., Мескина Е.Р, Ушакова А.Ю., Хадисова М.К., Зверев В.В., Файзулоев Е.Б. Молекулярно-генетические особенности ротавирусов группы А, выявленных в Москве в 2015-2020 гг. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2022;99(1):7-19.
DOI: https://doi.org/10.36233/0372-9311-208
© Коллектив авторов, 2021
ORIGINAL RESEARCHES
Original article
https://doi.org/10.36233/0372-9311-208
Molecular and genetic characteristics of group A rotaviruses detected in Moscow in 2015-2020
Olga A. Petrusha1®, Ekaterina R. Korchevaya1, Ramil R. Mintaev1, Alexandra A. Nikonova1, Igor Yu. Isakov1, Elena R. Meskina12, Anna Yu. Ushakova2, Marima K. Khadisova2, Vitaly V. Zverev3, Evgeny B. Faizuloev1
1I. Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera, Moscow, Russia;
2M. Vladimirsky Moscow Regional Research Clinical Institute, Moscow, Russia;
3I.M. Sechenov First Moscow State Medical University (Sechenov University), Moscow, Russia
Abstract
The aim of the study was to analyze genetic characteristics of strains belonging to group A rotaviruses (RVA) circulating in Moscow in 2015-2020, including rare strains non-typeable by polymerase chain reaction (PCR). Materials and methods. A total of 289 stool samples were tested; the samples were collected from children aged 1 month to 17 years, hospitalized with acute gastroenteritis. Immunochromatography and real-time reverse transcription-polymerase chain reaction (real-time RT-PCR) assays were used for detection of rotaviruses in the samples. The rotavirus genome sequencing was performed using the Sanger technique and nanopore sequencing.
Results and discussion. RVA RNA was detected in 131 clinical samples, and the G/[P] genotype was identified in 125 samples. The general profile showed prevalence of RVA strains with the G9P[8]I1 genotype (37%) followed by G3P[8]I2, G4P[8]I1, G2P[4]I2, G1P[8]I1, and G3P[8]I1 variants (18, 15, 11, 5, and 2%, respectively). Seven (5%) isolates were identified as GxP[8]. In 2015-2020, the region reported a decline in G4P[8]I1 genotype prevalence (from 39% to 9%) and an increase in the proportion of the G9P[8]I1 genotype (from 6% to 37%) as compared to 2009-2014. In 2018-2020, a large number of cases with the previously unknown DS-1-like reassortant strain with the G3P[8]I2 genotype were reported; the above strain has become widely common worldwide in the recent years. Nanopore sequencing was performed to analyze the genome of the G3P[8]I2 strain and the rare G4P[6]I1 strain. It was found that the G4P[6]I1 strain was phylogenetically related to porcine rotaviruses.
Conclusion. In the recent years, the genetic diversity of RVA circulating in the Moscow Region has changed significantly. The obtained results prove the importance of continuous monitoring of rotavirus infection and selective sequencing of RVA genes to fine-tune data of the type-specific real-time RT-PCR. The ever-changing genetic composition of the circulating RVA strains calls for regular optimization of RVA genotyping systems based on real-time RT-PCR.
Keywords: group A rotaviruses, acute gastroenteritis, G/[P]-genotyping, nanopore sequencing
Ethics approval. The study was conducted with the informed consent of the patients. The research protocol was approved by the Ethics Committee of the I. Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera (Protocol No. 6, September 24.2021).
Funding source. The work was carried out within the framework of the state task of the Ministry of Science and Higher Education of the Russian Federation (subject no. 0525-2019-0037).
Conflict of interest. The authors declare no apparent or potential conflicts of interest related to the publication of this article.
For citation: Petrusha O.A., Korchevaya E.R., Mintaev R.R., Nikonova A.A., Isakov I.Yu., Meskina E.R., Ushakova A.Yu., Khadisova M.K., Zverev V.V., Faizuloev E.B. Molecular and genetic characteristics of group A rotaviruses detected in Moscow in 2015-2020. Journal of microbiology, epidemiology and immunobiology = Zhurnal mikrobiologii, epidemiologii i immunobiologii. 2022;99(1):7-19. DOI: https://doi.org/10.36233/0372-9311-208
Введение
Ротавирусы группы А (РВА) являются основной причиной госпитализации детей в возрасте до 5 лет с острым гастроэнтеритом в странах с низким охватом вакцинацией против ротавируса. В 2016 г. ротавирусная инфекция (РВИ) вызвала 258 млн эпизодов диареи и 128 500 случаев смерти среди детей в возрасте до 5 лет во всём мире [1].
В 2020 г. вакцинация против РВА была включена в национальные программы иммунизации
107 стран1. Иммунизация от РВИ в России включена в Календарь профилактических прививок по эпидемическим показаниям. Четыре ротавирусные вакцины в настоящее время рекомендованы ВОЗ и лицензированы для использования: пятивалентные — RotaTeq («Merck & Co., Inc.»), ROTASIIL (Serum institute of India PVT. Ltd.); и моновалент-
1 URL: https://preventrotavirus.org/vaccine-introduction/global-introduction-status
ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
ные — Rotarix («GlaxoSmithKline»), ROTAVAC («Bharat Biotech»). Массовая вакцинация против РВА снижает заболеваемость и частоту госпитализации с острым гастроэнтеритом во всех возрастных группах, особенно у младенцев и людей старше 65 лет [2].
РВА относятся к виду Rotavirus A, рода Rotavirus, семейства Reoviridae. Геном ротавирусов представлен 11 сегментами двухцепочечной РНК, кодирующими синтез 12 белков [3]. Современная система классификации ротавирусов предполагает генотипирование по всем 11 генам (Gx-P[x]-Ix-Rx-Cx-Mx-Ax-Nx-Tx-Ex-Hx). Большинство циркулирующих РВА человека относятся к 3 эволюционным линиям, отличающимся констелляциями генома: Wa -подобные штаммы (G1-P[8]-I1-R1-C1-M1-A1-N1-T1-E1-H1), DS-1 -подобные (G2-P[4]-I2-R2-C2-M2-A2-N2-T2-E2-H2) и AU-1 -подобные штаммы (G3-P[3]-I3-R3-C3-M3-A3-N3-T3-E3-H3) [3]. Ранее широко применялась схема типиро-вания, в которой определялись только гены белков VP7 (G) и VP4 (P). G/[P]-генотипирование штаммов РВА выполняется в реакции ОТ с последующей мультиплексной полимеразной цепной реакцией (ОТ-ПЦР) [4] или секвенированием соответствующих генов.
В настоящее время генотипы G1P[8], G2P[4], G3P[8], G4P[8], G12P[8] и G9P[8], гомотипные или частично гетеротипные по отношению к используемым лицензированным вакцинам (RotaTeq и Rotarix), доминируют среди циркулирующих штаммов РВА во всем мире [5]. Описаны случаи как межвидовой передачи РВА от животных человеку, так и заражения человека штаммами, образованными в результате реассортации штаммов рота-вирусов животных и человека [6-8].
Эволюционная изменчивость штаммов РВА во времени [9], территориальные различия в распределении циркулирующих штаммов, увеличение их разнообразия после введения иммунизации в некоторых регионах, изменение генотипической структуры как в странах с плановой вакцинацией, так и без нее требуют постоянного эпидемиологического мониторинга РВИ [10].
Целью настоящего исследования является анализ генетических характеристик штаммов РВА, циркулировавших в Москве в 2015-2020 гг., включая редкие штаммы, не типируемые методом ПЦР.
Материалы и методы
Клинические образцы
Всего за 5 лет (2015-2020 гг.) было собрано 289 образцов стула у детей в возрасте от 1 мес до 17 лет с симптомами острого гастроэнтерита, госпитализированных в МОНИКИ им. М.Ф. Владимирского. Дети, прошедшие вакцинацию против
РВИ, не были включены в исследование. Информированное согласие было получено от родителей или законных представителей для всех испытуемых.
В 45 пробах антиген РВА был обнаружен методом иммунохроматографии (набор реагентов «RIDA Quick Rotavirus», «R-Biopharm AG»). Образцы фекалий собирались в стерильные контейнеры у пациентов с диарей (не более 72 ч после появления симптомов), до отправки в лабораторию образцы хранились при температуре -20°С, затем отправлялись в НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова для генетического анализа ротавирусов.
Выделение РНК
Для изоляции РНК использовали осветлённые центрифугированием (5000 об/мин, 5 мин) 10% фекальные экстракты, приготовленные в стерильном физиологическом растворе. Выделение РНК из экстрактов проводили набором «АмплиСенс® МАГНО-сорб» («ИнтерЛабСервис») в соответствии с инструкцией по применению. Образцы РНК хранили при -80°С.
Детекция ротавирусной РНК
Обнаружение РВА в клинических образцах методом ОТ-ПЦР в реальном времени (ОТ-ПЦР-РВ) выполняли в формате одной пробирки с использованием праймеров и зондов, описанных ранее [11]. Генотипирование РВА двухэтапной мультиплексной ПЦР-РВ для генов белков VP7 (G1, G2, G3, G4, G9), VP4 (P[4], P[6], P[8]) и VP6 (I1, I2) проводили согласно методике [12]. Анализ генотипирования РВА, основанный на мультиплексной ОТ-ПЦР с последующим анализом продуктов ПЦР с помощью электрофореза в агарозном геле, использовали в качестве эталонного метода и выполняли, как описано в рекомендациях ВОЗ [4].
Амплификация и секвенирование генов белков VP7 и VP4
Для секвенирования генов белков VP7 и VP4 штаммов G3P[8]I2 амплификацию выполняли с использованием описанных ранее праймеров для секвенирования VP7F/VP7R [13] и VP4F/VP4R [14], образующих ампликоны размером 881 и 663 пар оснований соответственно. Аликвоты выделенной РНК (10 мкл) смешивали с 3 пмоль праймерами VP7F или VP4F, инкубировали при 95°С в течение 1 мин и охлаждали в течение 2-3 мин при комнатной температуре. Реакцию ОТ проводили в общем объёме 25 мкл, содержащем праймер ОТ, 25 единиц обратной транскриптазы MMLV («Синтол», Россия). Стадия ОТ включала инкубацию для синтеза кДНК при 45°С в течение 30 мин и инактивацию обратной транскриптазы MMLV при 95°С в течение 5 мин. Температурно-временной режим ПЦР-РВ:
ORIGINAL RESEARCHES
95°C — 120 с; 95°C — 60 с, 52°C — 40 с, 72°C — 40 с (45 циклов); 72°C — 40 с. ПЦР-ампликоны каждого гена очищали с помощью набора «Cleanup Standard» («Евроген») и проводили секвенирование обеих цепей ДНК с использованием генетического анализатора «NAN0PH0RE®05» («Синтол») и реагентов компании «Синтол».
Нанопоровое секвенирование ротавирусного генома и биоинформатический анализ
Полногеномная кДНК ротавирусных генных сегментов была получена с помощью смеси прай-меров unRAfl, unRAf2, unRAf3, unRArl, unRAr2 и unRAr3 (табл. 1) для реакции ОТ. Для одновременной амплификации всех сегментов гена РВА использовали «универсальный» праймер Up [15] (табл. 1). Амплификация проводилась в следующей реакционной смеси: TaKaRa LA Taq полимераза (2,5 ЕД), LA PCR Buffer ll (Mg2+plus), 25 мМ MgCl2 (финальная концентрация Mg2+ 5 мМ) («TaKaRa»), dNTP 25 мМ («Синтол»), 40 пмоль Up праймера. Параметры амплификации: 95°C — 2 мин, затем 40 циклов при 95°С по 30 с, 65°С — 30 с, 68°С — 3,5 мин. ПЦР-ампликоны очищали экстракцией фенол/хлороформ. Концентрацию и чистоту ампли-конов измеряли спектрофотометрическим методом (A260/230, 260/280).
Библиотеку ДНК для нанопорового секвени-рования (НПС) получали с использованием набора реагентов «Rapid Sequencing Kit» на портативном секвенаторе «MinlON» с использованием стандартной проточной ячейки R9 («Oxford Nanopore Technologies»). Был разработан конвейер, позволяющий точно классифицировать исходные данные НПС. Конвейер на основе языка программирования Python идентифицировал полученные прочтения, запуская BLAST-анализ для базы данных эталонных последовательностей сегментов генома ротавиру-са2. Затем проводилось картирование прочтений на референсную последовательность с использованием программы Minimap2 [16] и создание консенсусной последовательности с использованием скрипта3, написанного на языке Python. В консенсусной последовательности выбирался нуклеотид с наибольшей частотой встречаемости в положении выравнивания.
В редких случаях, когда два нуклеотида обнаруживались в одном положении в равном количестве, второй нуклеотид игнорировался. Идентификацию генотипа РВА по нуклеотидной последовательности генных сегментов проводили с помощью онлайн-сервиса «Rotavirus A Genotype
2 URL: https://github.com/lioj/bioinformatics/blob/master/py/ classificationStat.py
3 URL: https://github.com/lioj/bioinformatics/blob/master/py/
bam2consensus.py
Таблица 1. Праймеры для амплификации полноразмерных генных сегментов ротавирусов Table 1. Primers for amplification of full length rotavirus gene segments
Праймер Primer Последовательность праймера 5'-3' Primer sequence 5'-3'
unRAfl GCCGGAGCTCTGCAGAATTCGGCTWTWAAA
unRAf2 GCCGGAGCTCTGCAGAATTCGGCTTTTTTT
unRAf3 GCCGGAGCTCTGCAGAATTCGGCTTTTAAT
unRArl GCCGGAGCTCTGCAGAATTCGGTCAYATC
unRAr2 GCCGGAGCTCTGCAGAATTCGGTCACAWA
unRAr3 GCCGGAGCTCTGCAGAATTCAGCCACATG
Up GCCGGAGCTCTGCAGAATTC
Determination»4, основанном на программном обеспечении, написанном Dan Katzel [17].
Методика НПС генома ротавирусов подробно описана в статье E. Faizuloev и соавт. [18].
Идентификационные номера GenBank (NCBI)
Нуклеотидные последовательности, соответствующие 10 сегментам генома изолятов Moscow-40/2020 (G3P[8]I2) и Moscow-1P/2015 (G4P[6]I1), депонированы в GenBank под номерами MW558493-MW558502 и MT876633-MT876642 соответственно. Частичные последовательности трех других штаммов с генотипом G3P[8]I2 были депонированы под номерами MT648671, MT648671, MT648671 для VP7 и MT814324, MT814326 для VP4.
Филогенетический анализ
Построение филогенетических деревьев проводили в программе MEGA-X [19] методом максимального правдоподобия (двухпараметрическая модель Kimura [20]). Bootstrap-анализ осуществляли на основе 1000 репликаций. В качестве референс-ных использовали штаммы РВА, рекомендованные Рабочей группой по таксономии ротавирусов [3], а также штаммы, имеющие, по данным BLAST-ана-лиза, не менее чем 99,5% сходство с исследуемыми штаммами.
Результаты
Всего на наличие РНК или антигена РВА было проанализировано 289 фекальных образцов, собранных у детей, госпитализированных в стационар с симптомами острого гастроэнтерита. В 131 (45%) случае была обнаружена РНК, которую в дальнейшем использовали для G/pj-генотипирования методом ОТ-ПЦР-РВ и/или секвенированием. В 125 случаях (95,4%) был определен С/[Р]-генотип РВА,
4 URL: https://www.viprbrc.org/brc/rvaGenotyper.spg?method=S howCleanInputPage&decorator=reo
ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
Рис. 1. Распределение G/^-генотипов РВА, выделенных из 131 клинического образца в 2015-2020 гг. GxP[8]Ix — частично типированные РВА; Mix — смешанные генотипы; Nt — нетипированные образцы.
Fig. 1. Distribution of RVA G/[P]-genotypes isolated from 131 clinical samples in 2015-2020. GxP[8]Ix — partially typed PVA; Mix — mixed genotypes; Nt — non-typed samples.
в 7 (5,3%) случаях РВА был типирован только по гену P, а для 6 (4,6%) образцов генотип установить не удалось.
Генетический состав исследованных штаммов РВА представлен на рис. 1. В 2015-2020 гг. штаммы РВА с генотипом G9P[8]I1 доминировали в общей структуре (37%), второе место занимали G3P[8]I2 (новый DS-1-подобный штамм) — 18%, далее — G4P[8]I1 (15%), G2P[4]I2 (11%), G1P[8] II (5%), G3P[8]I1 (2%). Семь (5%) штаммов, типи-рованных только по гену Р, относились к варианту гена Р[8]. Также были обнаружены единичный случай смешанной инфекции двумя генотипами ^9Р[8]11 и G2P[4]I2) и редкий штамм с генотипом G4P[6]I1.
На рис. 2 представлено распределение выявленных в Московском регионе генотипов РВА по годам. Доля генотипа G9P[8]I1 в последние годы значительно возросла, и в 2015-2020 гг. варьировала в пределах 36-41%. В то же время частота встречаемости генотипов G4P[8]I1 снизилась с 38 до 9%, а частота встречаемости генотипа G2P[4]I2 выросла до 14%.
Важно отметить, что для О/[Р]-генотипиро-вания некоторых штаммов с генотипом GxP[8]I2 требовалось частичное секвенирование генов белков УР7 (О) и УР4 (Р), поскольку лабораторной тест-системой на основе ОТ-ПЦР-РВ их О/[Р]-ге-нотип установить не удалось [12]. Секвенирование и филогенетический анализ О и Р генов РВА (номера GenBank: МТ648671, МТ648671, МТ648671 для гена О и МТ814324, МТ814326 для гена Р) в
%
50 -,
40 -
30 -
20 -
10 -
39
24
19
12
G 4 [ G 9 [ G1 [
oo 8o 8o
M 1-1
2009- -2014* (n = 212)
41
38
36
21
14
CD 4
2015-2017 (n = 29)
24
19
14
G 4 G G
LO
[ [ [
8o oo 8o 2
1 1
1
2018-2020 (n = 102)
Рис. 2. Распространение G/^-генотипов, выявленных в Москве за 10 лет наблюдения (2009-2020 гг.) [12].
Nt — нетипированные образцы. Fig. 2. Prevalence of G/[P]-genotypes detected in Moscow during the 10-year monitoring period (2009-2020) [12].
Nt — non-typed samples.
9
6
6
0
0
ORIGINAL RESEARCHES
VP 7
59
100
100
98
83
100
100
68, A MT648673 RVA/Hu/RUS/Moscow-41 /2020/G3 G3P8I2 4 MW558500 RVA/Hu/RUS/Moscow-40/2020/G3 G3P8I2 I A MT648671 RVA/Hu/RUS/Moscow-33/2020/G3 G3P8I2 I KU870393 RVA/Human-wt/HUN/ERN8148/2015/G3P8 G3P8I2 KU550297 RVA/Human-wt/ESP/SS98244047/2015/G3P8 G3P8I2 MT386430 RVA/Human-wt/BRA/LVCA29508/2018/G3P8 G3P8I2 MG652305 RVA/Human-wt/DOM/3000503701/2014/G3P8 G3P8I2 LC490286 RVA/Human-wt/THA/MS2014-0134/2014/G3P8 G3P8I2 LC47735 Human-wt/JPN/Tokyo17-09/2017/G3P8 G3P8I2 A MT648674 RVA/Hu/RUS/Moscow-45/2020/G3 G3P8I2 DQ981479 Equine rotavirus strain Erv105 GQ117006 Hu/RUS/Nov08-3281/2008/G3P8 FJ915079 Hu/RUS/Omck07-217/2007/G3P8 EF672602 RVA/Hu man-tc/USA/P/1974/G3P1A8 D86284 YO G3P8 D86271 AU-1/JPN/1982 G3P9 AB180969 WI61 G9P8 - FJ361209 116E/AG G9P11
Д
G3P[8]I2
99,
G3
100
G9
AF060487 US 1205 G9P6 J 91, K02033 Wa/USA/1980 G1P8 lOOji EF672574 RVA/Human-tc/USA/D/1974/G1P1A8 T- D16344 K8/JPN/1977 G1P9 AF500235 RMC100 G4P8 AB039035 Hochi G4P8
G1
100
G4
gg 'AB039034 Odelia G4P8 AY787646 ТВ-Chen G2P4
— EF672581 RVA/Human-tc/USA/DS-1/1976/G2P1B4 D50124 KUN JPN G2P4
G2
VP4
99
158
95
87
84 98
99
KU870410 RVA/Human-wt/HUN/ERN8263/2015/G3P8 KU550280 RVA/Human-wt/ESP/SS98242319/2015/G3P8 LC477395 H u man-wt/J PN/Tokyo 17-45/2017/G3P8(DS-1) M F044167 RVA/H u man-wt/TWN/2016/105-701-D073/G3P8 MH569763 RVA/Human-wt/BRA/IAL-R608/2015/G3P8 MN067528 RVA/Human-wt/TWN//G3P8/Taichung/105-401-D098/2016 MT053445 RVA/H u man-wt/GER/FB038/2017/G3P8 ф MW558495 RVA/Hu/RUS/Moscow-40/2020/G3 A MT814326 RVA/H u/RUS/Moscow-41 /2020/G3 A MT814324 RVA/H u/RUS/Moscow-1 /2020/G3 MT053446 RVA/H u man-wt/GER/FB039/2017/G3P8I2 KF371691 RVA/Hu man -tc/C H N/R709/2005/G3 P8 JF491015 Vanderbilt/VU08-09-12/2008/G3P8 HM773670 RVA/Human-wt/USA2008747337/2008/G3P8 ■ FJ423116 WaG1P8 -AB008295 Hochi G4P8 J P[8]
G3P[8]I2
p AY787644 ТВ-Chen G2P4 "^jj— M58292 L26 G12P4
4-HQ650119 RVA/H u m an -tc/U SA/DS-1/1976/G2P4
r JX271004 RVA/Human-wt/TUN/17237/2008/G6P9 -100|_ D10970 AU-1 G3P9
P[4]
98 L AB008289 02-92 G3P9
P[9]
Рис. 3. Филогенетические деревья, основанные на секвенированных генах белков VP4 и VP7 нового штамма G3P[8]I2. ▲ — сегменты, секвенированные по Сэнгеру; ♦ — ген, секвенированный методом НПС; А — ген белка VP7 РВА лошади. Для обозначения штаммов использовался идентификационный номер GenBank, названия штаммов и G/рренотип.
Fig. 3. Phylogenetic trees based on the sequenced genes of the VP4 and VP7 proteins of the new G3P[8]I2 strain. ▲ — segments sequenced using the Sanger technique; ♦ — the gene sequenced using the NPS technique; А — the equine RVA VP7 gene. The respective GenBank accession number, name of strains and G/[P]-genotype were used for designation of strains.
ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
Таблица 2. Результаты нанопорового секвенирования генома штаммов Table 2. Results of nanopore sequencing of the genome of RVA strains with
РВА с генотипами G3P[8]I2 и G4P[6]I1 G3P[8]I2 and G4P[6]I1 genotypes
Вирусный белок Viral protein G4P[6]I1 G3P[8]I2
Сегмент Segment количество прочтений number of reads покрытие сегмента, % segment coverage, % генотип genotype количество прочтений number of reads покрытие сегмента,% segment coverage, % генотип genotype
1 VP1 1372 100 R1 12 792 100 R2
2 VP2 3795 100 C1 11 193 100 C2
3 VP3 1995 100 M1 - - Mx
4 VP4 633 20 P[6] 2785 100 P[8]
5 NSP1 546 100 A1 53 841 100 A2
6 VP6 15 187 100 I1 16 479 100 I2
7 NSP3 14 566 100 T1 80 554 100 T2
8 NSP2 175 36 N1 40 022 100 N2
9 VP7 1465 100 G4 25 059 100 G3
10 NSP4 - - Ех 10 222 100 E2
11 NSP5/6 77 100 H1 11 351 100 H2
образцах с обнаруженным GxP[8]I2 показали, что они принадлежат к генотипу G3P[8]I2 (рис. 3). Выявлено, что отсутствие сигнала при генотипи-ровании с помощью ОТ-ПЦР-РВ вызвано несоответствием нуклеотидов между геном VP7 генотипа G3P[8]I2 и соответствующим зондом. На нетипиру-емых образцах с генотипом GxP[8]I2 была проведена моноспецифическая ПЦР с праймерами к О3 и электрофоретической детекцией, которая выявила ампликоны ожидаемой подвижности во всех образцах (данные не представлены), что подтвердило их принадлежность к генотипу G3P[8]I2.
BLAST-анализ и филогенетический анализ продемонстрировали сходство секвенированных генов VP7 и VP4 с аналогичными генами РВА новой G3-DS-1-подобной констелляции, выявленной по всему миру. Схожие G3-DS-1-подобные штаммы были обнаружены в Австралии (2013) [21], Испании (2014-2015) [22], Венгрии (2016) [23], Бразилии (2016) [24], Индонезии (2016) [25], России (2019) [28] и в других странах (рис. 3).
Кроме того, было проведено НПС изолята Moscow-40/2020 с генотипом G3P[8]I2 (табл. 2), в результате которого были идентифицированы варианты генов 10 сегментов генома (номера GenBank MW558493-MW558502) и выявлена высокая (91,099,8%) степень сходства консенсусной последовательности с референсным штаммом RVA/Human-wt/THA/SKT-281/2013/G3P[8] (номера GenBank LC086714-LC086724).
Редкий штамм Moscow-1P/2015 с генотипом G4P[6]I1 был обнаружен в клиническом образце, взятом у 8-летнего пациента в 2015 г. Методом ПЦР-РВ удалось установить только вариант гена Р[6]. Секвенирование методами Сэнгера и НПС позволило установить генотип этого штамма по 10
генам: G4-P6-I1-R1-C1-M1-A1-N1-T1-Ex-H1 (номера GenBank МТ876633-МТ876642, MG271938), что соответствует 81,7% генома (табл. 2).
Филогенетический анализ генов VP7, VP6 и VP4 штамма Moscow-1P/2015 (рис. 4) демонстрирует высокую степень сходства генов анализируемого образца с генами РВА свиней (номера GenBank: VP4 — КХ363402, МК227950, КХ363435, МК227948; VP6 — МК227391, МК227402, КХ363414, MG066585, Ю126830; VP7 — JX498957, JX498956, МК227392, МШ33419, МШ33444) либо штаммов РВА (штамм RVA/Human-wt/CHN/ Ю954/2013Ю4Р[6], номера GenBank: СТ726066-^726076, ^726056), выделенных из фекалий человека, но имеющих доказанное происхождение от РВА свиней [7]. BLAST-анализ остальных 7 генов также демонстрирует высокую степень сходства (92-98%) нуклеотидной последовательности со штаммами РВА свиней. Таким образом, филогенетический анализ свидетельствует о происхождении штамма G4P[6] от РВА свиней.
Обсуждение
Полученные нами результаты свидетельствуют о существенных изменениях, произошедших в «генетическом ландшафте» РВА, циркулирующих в московском регионе. Согласно данным предыдущих исследований [12, 26], до 2015 г. большинство гено-типированных РВА относились к генотипу G4P[8]. Наши данные свидетельствуют о постепенном снижении встречаемости данного генотипа с 38 до 9% в 2017-2018 гг. При этом доля генотипа G9P[8] в московском регионе увеличилась до 36-41%. Это соответствует данным независимых исследований, проведенных в Москве [27, 28], Нижнем Новгороде [29, 30] и Оренбурге [31].
ORIGINAL RESEARCHES
VP4
с
100
94
О
KX363435 RVA/Pig-wt/VNM/14250 9/VP4 G4P6 MK227948 RVA/Pig-wbTWN/104-P-002-1 -1231/2015/G4P6 KF726067 RVA/Human-wt/CHN/R1954/2013/G4P6 MK227950 RVA/Pig-wVTWN/104-P-001-1-1357/2015/G4P6 ф- MT876638 RVA/Hu/RUS/Moscow-1 P/2015 G4P6 KX363402 RVA/Pig-wt/VNM/14226 39/VP4 G4P6 — KF726056 RVA/Human-wl/CHN/R946/2006/G3P6 - О HQ650119.1 Rotavirus A RVA/Human-tc/USA/DS-1/1976/G2P4 FJ423116 WaG1P8 - О D10970 AU-1 G3P9
VP6
99
100
100 MK227391 RVA/Pig-wt/BGD/H14020027/G4P49 I MK227402 RVA/Pig-wt/BGD/H14020036/G4P49 - + MT876633 RVA/Hu/RUS/Moscow-1 P/2015 G4P6 г— KX363414 RVA/Pig-wt/VNM/14226 42/G4P6 gl"L MG066585 RVA/Pig-wt/CHN/SCLS-2-3/2017/G9P23l1
— KJ126830 Porcine rotavirus A LLP48 G9P6
- О K02086 Wa/USA/1980 G1P8
- О DG490538 RVA/Human-tc/JPN/AU-1/1982/G3P39
О HQ650121 RVA/Human-tc/USA/DS-1/1976/G2P4
Штаммы РВА, выделенные от человека и свиней
Porcine RVA strains isolated from human or porcine samples
VP 7
г
94
100
+ MT876642 RVA/Hu/RUS/Moscow-1 P/2015 G4P6
JX498956 Porcine rotavirus A HLJhg2 G4 JX498957 Porcine rotavirus A isolate HeN4 G4 MK227392 RVA/Pig-wt/BGD/H14020027/G4P49 MN133419 RVA/Pig-wt/BGD/H14020001 /G4P49 MN133444 RVA/Pig-wt/BGD/H14020026/G4P49 — KF726066 RVA/Human-wl/CHN/R1954/2013/G4P6 О K02033 Wa/USA/1980 G1P8 -O D86271 AU-1/JPN/1982 G3P9 - О EF672581 RVA/Human-tc/USA/DS-1/1976/G2P4
100
0 050
Рис. 4. Филогенетические деревья, основанные на секвенированных генах белков VP4, VP7 и VP6 РВА, штамма G4P[6]I1 (отмечены знаком ♦), референсных штаммах (Wa, AU-1, DS-1) представителей трёх эволюционных линий РВА (отмечены знаком о) и генов РВА свиного происхождения, наиболее филогенетически близких генам штамма
Moscow-1P/2015 согласно BLAST-анализу. Для обозначения штаммов использовался номер GenBank, название штамма и 0/[Р]-генотт. Fig. 4. Phylogenetic trees based on sequenced genes of RVA VP4, VP7, and VP6 proteins, strain G4P[6]I1 (marked by ♦), reference strains (Wa, AU-1, DS-1) representatives of three evolutionary lines RVA (marked by о) and RVA genes of porcine origin, phylogenetically most closely related to genes of the Moscow-1P/2015 strain based on the BLAST analysis. The respective GenBank number, name of the strain and G/[P]-genotype were used for designation of strains.
В нашем исследовании изучались клинические образцы, собранные у детей, госпитализированных с острым гастроэнтеритом. Реальный «генетический ландшафт» и распределение генотипов РВА, циркулирующих в Москве, могут отличаться от полученных данных, поскольку мы не включали в исследование пациентов с лёгким или умеренным
гастроэнтеритом, не требующих госпитализации. Ранее в исследовании Е.Р. Мескиной показано, что тяжёлое течение ротавирусного гастроэнтерита может быть ассоциировано с конкретными генотипами РВА [32].
Особый интерес представляет штамм с генотипом G3P[8]I2, впервые выявленный нами в
ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
2018 г. Его доля в общей структуре РВА составила 18%; по этому показателю он уступает только генотипу G9P[8]I1 (рис. 1). По результатам секвени-рования и филогенетического анализа (рис. 3) мы предположили, что G3P[8]I2 является родственным реассортантному штамму, впервые выявленному в Таиланде в 2013 г. [25] и широко распространившемуся в последние годы на территории Европы, Азии и Австралии [7, 22, 33, 34]. Данный штамм имеет ВБ-1 -подобную констелляцию генов ^3-Р[8]-П-Я2-С2-М2-А2-т-П-Е2-т), за исключением гена белка УР7, который в обычных для данной констелляции случаях представлен генова-риантом О2, в то время как для геноварианта ОЗ более характерна Жа-подобная констелляция [35]. По предположению некоторых исследователей [21, 22, 25], штамм G3P[8]I2 образовался в результате реассортации человеческого ВБ-1 -подобного штамма и лошадиного штамма Е^105 (номер GenBank: DQ981479.1), поскольку с геном белка УР7 этого штамма выявлено наибольшее сходство. При выполнении настоящего исследования мы, как и некоторые другие научные группы [22], столкнулись с невозможностью генотипировать новый штамм вируса методом типоспецифической ПЦР. Тест-система собственной разработки, как и праймеры, предложенные ВОЗ [4], не смогли выявить ген белка УР7 штамма G3P[8]I2. В то же время секвени-рование по Сэнгеру и проведённый BLAST-анализ позволили достоверно определить геновариант как ОЗ. Из-за точечных мутаций в генах VP4 и VP7 ти-поспецифические праймеры ПЦР всё чаще не могут идентифицировать их вариант [17]. Этот факт повышает значимость методов секвенирования в эпидемиологическом мониторинге РВИ.
Ещё один нетипичный штамм — Moscow-1Р/2015 с генотипом G4P[6]I1, выявленный в единичном случае, — вероятно, также является результатом реассортации РВА человека и животных либо полностью имеет животное происхождение. В данном случае не ясно, произошло ли заражение данным штаммом в результате передачи от человека к человеку, либо человек заразился вирусом от животных. По данным литературы, доля РВА с генотипом G4P[6]I1 в общей структуре выявляемых у человека штаммов РВА невысока [6, 38]. Это может быть свидетельством какого-то ограничения для распространения G4P[6]I1 в человеческой популяции, например видового барьера, если предположить, что это штамм животного происхождения. В то же время следует принимать во внимание, что в большинстве подобных исследований обследованы дети, госпитализированные с ротавирусным энтеритом, тогда как случаи лёгкого протекания заболевания не рассматриваются. Поэтому мы не можем по этим данным судить о реальной распространённости того или иного штамма РВА.
Штаммы РВА свиней филогенетически близки штаммам ротавирусов человека [34], поэтому сложно установить, является ли исследуемый штамм следствием прямой передачи или реассортации [37-39]. Случаи реассортации или прямой межвидовой передачи РВА с генотипом G4P[6]I1 уже были описаны ранее как в Азии [6, 25, 40], так и в Европе [36].
Заключение
В 2015-2020 гг. в генетической структуре РВА, циркулирующих на территории московского региона, произошли существенные изменения: снизилась встречаемость генотипа G4P[8]I1, который занимал лидирующую роль в предыдущие годы; в то же время выросло количество случаев госпитализации с РВИ, вызванной штаммом G9P[8]I1. Также в исследуемый период отмечено появление штаммов РВА предположительно животного происхождения как в единичных случаях (G4P[6]I1), так и в значительном количестве (реассортантный G3P[8]I2), что является свидетельством важной роли межвидовой трансмиссии в эволюции РВА, патогенных для человека. Проведённое нами исследование подчёркивает необходимость постоянного мониторинга РВИ. Эпидемиологический мониторинг РВИ позволяет своевременно выявлять появление новых реас-сортантов РВА животных и человека, потенциально ускользающих от поствакцинального иммунитета. Выявленные нами и рядом авторов штаммы РВА, не типируемые методом ОТ-ПЦР-РВ (генотипы G3P[8]I2 и G4P[6]I1) [6, 22], подчёркивают необходимость выборочного секвенирования генов РВА и оптимизации последовательностей типоспецифи-ческих праймеров для ОТ-ПЦР-РВ.
СПИСОК ИСТОЧНИКОВ
1. Troeger C., Khalil I.A., Rao P.C., Cao S., Blacker B.F., Ahmed T., et al. Rotavirus vaccination and the global burden of rotavirus diarrhea among children younger than 5 years. JAMA Pediatr. 2018; 172(10): 958-65. https://doi.org/10.1001/jamapediatrics.2018.1960
2. Hoog M.L.A., Vesikari T., Giaquinto C., Huppertz H.I., Martinon-Torres F., Bruijning-Verhagen P. Report of the 5th European expert meeting on rotavirus vaccination (EEROVAC). Hum. Vaccin. Immunother. 2018; 14(4): 1027-34. https://doi.org/10.1080/21645515.2017.1412019
3. Matthijnssens J., Ciarlet M., Rahman M., Attoui H., Banyai K., Estes M.K., et al. Recommendations for the classification of group A rotaviruses using all 11 genomic RNA segments. Arch. Virol. 2008; 153(8): 1621-9. https://doi.org/10.1007/s00705-008-0155-1
4. WHO. Manual of rotavirus detection and characterization methods. Geneva; 2009.
Available at: https://www.who.int/vaccines-documents
5. Doro R., Laszlo B., Martella V., Leshem E., Gentsch J., Para-shar U., et al. Review of global rotavirus strain prevalence data from six years post vaccine licensure surveillance: is there evidence of strain selection from vaccine pressure? Infect. Genet. Evol. 2014; 28: 446-61. https://doi.org/10.1016/j.meegid.2014.08.017
6. Zhou X., Wang Y.H., Ghosh S., Tang W.F., Pang B.B., Liu M.Q., et al. Genomic characterization of G3P[6], G4P[6] and G4P[8] human rotaviruses from Wuhan, China: Evidence for interspecies transmission and reassortment events. Infect. Genet. Evol. 2015; 33: 55-71. https://doi.org/10.10167j.meegid.2015.04.010
7. Salamunova S., Jackova A., Csank T., Mandelik R., Novotny J., Beckova Z., et al. Genetic variability of pig and human rotavirus groupA isolates from Slovakia.Arch. Virol.2020; 165(2):463-70. https://doi.org/10.1007/s00705-019-04504-6
8. Doro R., Farkas S.L., Martella V., Banyai K. Zoonotic transmission of rotavirus: surveillance and control. Expert. Rev. Anti. Infect. Ther. 2015; 13(11): 1337-50. https://doi.org/10.1586/14787210.2015.1089171
9. Velasquez D.E., Jiang B. Evolution of P[8], P[4], and P[6] VP8* genes of human rotaviruses globally reported during 1974 and 2017: possible implications for rotavirus vaccines in development. Hum. Vaccin. Immunother. 2019; 15(12): 3003-8. https://doi.org/10.1080/21645515.2019.1619400
10. Hungerford D., Vivancos R., Read J.M., Iturriza-Gomicronmara M., French N., Cunliffe N.A. Rotavirus vaccine impact and socioeconomic deprivation: an interrupted time-series analysis of gastrointestinal disease outcomes across primary and secondary care in the UK. BMC Med. 2018; 16(1): 10. https://doi.org/10.1186/s12916-017-0989-z
11. Freeman M.M., Kerin T., Hull J., McCaustland K., Gentsch J. Enhancement of detection and quantification of rotavirus in stool using a modified real-time RT-PCR assay. J. Med. Virol. 2008; 80(8): 1489-96. https://doi.org/10.1002/jmv.21228
12. Kiseleva V., Faizuloev E., Meskina E., Marova A., Oksanich A., Samartseva T., et al. Molecular-genetic characterization of human rotavirus a strains circulating in Moscow, Russia (20092014). Virol. Sin. 2018; 33(4): 304-13. https://doi.org/10.1007/s12250-018-0043-0
13. Iturriza-Gomara M., Isherwood B., Desselberger U., Gray J. Reassortment in vivo: driving force for diversity of human rotavirus strains isolated in the United Kingdom between 1995 and 1999. J. Virol. 2001; 75(8): 3696-705. https://doi.org/10.1128/JVI.75.8.3696-3705.2001
14. Simmonds M.K., Armah G., Asmah R., Banerjee I., Daman-ka S., Esona M., et al. New oligonucleotide primers for P-typing of rotavirus strains: Strategies for typing previously untypeable strains. J. Clin. Virol. 2008; 42(4): 368-73. https://doi.org/10.1016/jjcv.2008.02.011
15. Froussard P. rPCR: a powerful tool for random amplification of whole RNA sequences. PCR MethodsAppl. 1993; 2(3): 185-90. https://doi.org/10.1101/gr.2.3.185
16. Li H. Minimap2: pairwise alignment for nucleotide sequences. Bioinformatics. 2018; 34(18): 3094-100. https://doi.org/10.1093/bioinformatics/bty191
17. Maes P., Matthijnssens J., Rahman M., Van Ranst M. RotaC: a web-based tool for the complete genome classification of group A rotaviruses. BMC Microbiol. 2009; 9: 238. https://doi.org/10.1186/1471-2180-9-238
18. Faizuloev E., Mintaev R., Petrusha O., Marova A., Smirno-va D., Ammour Y., et al. New approach to genetic characterization of group A rotaviruses by the nanopore sequencing method. J. Virol. Methods. 2021; 292: 114114. https://doi.org/10.1016/jjviromet.2021.114114
19. Kumar S., Stecher G., Li M., Knyaz C., Tamura K. MEGA X: Molecular Evolutionary Genetics Analysis across Computing Platforms. Mol. Biol. Evol. 2018; 35(6): 1547-9. https://doi.org/10.1093/molbev/msy096
20. Kimura M. A simple method for estimating evolutionary rates of base substitutions through comparative studies of nucleotide sequences. J. Mol. Evol. 1980; 16(2): 111-20. https://doi.org/10.1007/BF01731581
ORIGINAL RESEARCHES
21. Cowley D., Donato C.M., Roczo-Farkas S., Kirkwood C.D. Emergence of a novel equine-like G3P[8] inter-genogroup reassortant rotavirus strain associated with gastroenteritis in Australian children. J. Gen. Virol. 2016; 97(2): 403-10. https://doi.org/10.1099/jgv.0.000352
22. Arana A., Montes M., Jere K.C., Alkorta M., Iturriza-Go-mara M., Cilla G. Emergence and spread of G3P[8] rotaviruses possessing an equine-like VP7 and a DS-1-like genetic backbone in the Basque Country (North of Spain), 2015. Infect. Genet. Evol. 2016; 44: 137-44. https://doi.org/10.1016/j.meegid.2016.06.048
23. Doro R., Marton S., Bartokne A.H., Lengyel G., Agocs Z., Jak-ab F., et al. Equine-like G3 rotavirus in Hungary, 2015 — Is it a novel intergenogroup reassortant pandemic strain? Acta. Microbiol. Immunol. Hung. 2016; 63(2): 243-55. https://doi.org/10.1556/030.63.2016.2.8
24. Guerra S.F.S., Soares L.S., Lobo P.S., Penha Junior E.T., Sousa Junior E.C., Bezerra D.A.M., et al. Detection of a novel equine-like G3 rotavirus associated with acute gastroenteritis in Brazil. J. Gen. Virol. 2016; 97(12): 3131-8. https://doi.org/10.1099/jgv.0.000626
25. Komoto S., Tacharoenmuang R., Guntapong R., Ide T., Haga K., Katayama K., et al. Emergence and characterization of unusual DS-1-Like G1P[8] rotavirus strains in children with diarrhea in Thailand. PLoS One. 2015; 10(11): e0141739. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0141739
26. Kaira A.N., Fayzuloyev E.B., Lavrov V.F., Svitich O.A., Solo-may T. V., Nikonova A.A., et al. Epidemiological trends of morbidity and issues of rotavirus vaccination at the present stage. Sanitary Doctor. 2020; 6: 16-25. https://doi.org/0.33920/med-08-2006-02
27. Ivashechkin A.A., Yuzhakov A.G., Grebennikova T.V., Yuzha-kova K.A., Kulikova N.Y., Kisteneva L.B., et al. Genetic diversity of group A rotaviruses in Moscow in 2018-2019. Arch. Virol. 2020; 165(3): 691-702. https://doi.org/10.1007/s00705-020-04534-5
28. Yuzhakov G., Yuzhakova K., Kulikova N., Kisteneva L., Chere-pushkin S., Smetanina S., et al. Prevalence and genetic diversity of group a rotavirus genotypes in Moscow (2019-2020). Pathogens. 2021; 10: 674.
https://doi.org/10.3390/pathogens10060674
29. Sashina T.A., Morozova O.V., Epifanova N.V., Novikova N.A. Predominance of new G9P[8] rotaviruses closely related to Turkish strains in Nizhny Novgorod (Russia). Arch. Virol. 2017; 162(8): 2387-92.
https://doi.org/10.1007/s00705-017-3364-7
30. Новикова Н.А., Сашина T.A., Солнцев Л.А., Епифанова Н.В., Кашников A^., Погодина Л.В. и др. Проявление эпидемического процесса ротавирусного процесса в Нижнем Новгороде в предвакцинальный период. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2017; 94(5): 46-52.
https://doi.org/10.36233/0372-9311-2017-5-46-52
31. Денисюк Н.Б. Генетическая характеристика ротавирусов группы А, циркулирующих в Оренбургском регионе в сезон 2016-2017 гг. Детские инфекции. 2017; 16(4): 42-5. https://doi.org/10.22627/2072-8107-2017-16-4-42-45
32. Мескина Е.Р., Ушакова А.Ю., Файзулоев Е.Б., Бахтоя-ров Г.Н., Киселева В.В. Сравнительная характеристика гастроэнтерита, вызванного ротавирусами генотипов G4P[8] и G9P[8], у детей, госпитализированных в стационар г. Москвы (эпидсезон 2012-2013 гг.). Инфекционные болезни. 2017; 15(1): 23-8.
https://doi.org/10.20953/1729-9225-2017-1-23-28
33. Katz E.M., Esona M.D., Betrapally N.S., De La Cruz De Leon L.A., Neira Y.R., Rey G.J., et al. Whole-gene analysis of inter-genogroup reassortant rotaviruses from the Dominican Republic: Emergence of equine-like G3 strains and evidence
ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
of their reassortment with locally-circulating strains. Virology. 2019; 534: 114-31.
https://doi.Org/10.1016/j.virol.2019.06.007
34. Fujii Y., Oda M., Somura Y., Shinkai T. Molecular characteristics of novel mono-reassortant G9P[8] rotavirus a strains possessing the NSP4 gene of the E2 genotype detected in Tokyo, Japan. Jpn J. Infect. Dis. 2020; 73(1): 26-35. https://doi.org/10.7883/yoken.JJID.2019.211
35. McDonald S.M., Matthijnssens J., McAllen J.K., Hine E., Overton L., Wang S., et al. Evolutionary dynamics of human rotaviruses: balancing reassortment with preferred genome constellations. PLoS Pathog. 2009; 5(10): e1000634. https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1000634
36. Papp H., Borzak R., Farkas S., Kisfali P., Lengyel G., Molnar P., et al. Zoonotic transmission of reassortant porcine G4P[6] rotaviruses in Hungarian pediatric patients identified sporadically over a 15 year period. Infect. Genet. Evol. 2013; 19: 71-80. https://doi.org/10.1016/j.meegid.2013.06.013
37. Esona M.D., Geyer A., Banyai K., Page N., Aminu M., Ar-mah G.E., et al. Novel human rotavirus genotype G5P[7] from child with diarrhea, Cameroon. Emerg. Infect. Dis. 2009; 15(1): 83-6. https://doi.org/10.3201/eid1501.080899
38. Wang Y.H., Kobayashi N., Nagashima S., Zhou X., Ghosh S., Peng J.S., et al. Full genomic analysis of a porcine-bovine reassortant G4P[6] rotavirus strain R479 isolated from an infant in China. J. Med. Virol. 2010; 82(6): 1094-102. https://doi.org/10.1002/jmv.21760
39. Zeller M., Patton J.T., Heylen E., De Coster S., Ciarlet M., Van Ranst M., et al. Genetic analyses reveal differences in the VP7 and VP4 antigenic epitopes between human rotaviruses circulating in Belgium and rotaviruses in Rotarix and RotaTeq. J. Clin. Microbiol. 2012; 50(3): 966-76. https://doi.org/10.1128/JCM.05590-11
40. Imagawa T., Saito M., Yamamoto D., Saito-Obata M., Masa-go Y., Ablola A.C., et al. Genetic diversity of species A rotavi-ruses detected in clinical and environmental samples, including porcine-like rotaviruses from hospitalized children in the Philippines. Infect. Genet. Evol. 2020; 85: 104465. https://doi.org/10.1016/j.meegid.2020.104465
REFERENCES
1. Troeger C., Khalil I.A., Rao P.C., Cao S., Blacker B.F., Ahmed T., et al. Rotavirus Vaccination and the Global Burden of Rotavirus Diarrhea Among Children Younger Than 5 Years. JAMA Pediatr. 2018; 172(10): 958-65. https://doi.org/10.1001/jamapediatrics.2018.1960
2. Hoog M.L.A., Vesikari T., Giaquinto C., Huppertz H.I., Marti-non-Torres F., Bruijning-Verhagen P. Report of the 5th European expert meeting on rotavirus vaccination (EEROVAC). Hum. Vaccin. Immunother. 2018; 14(4): 1027-34. https://doi.org/10.1080/21645515.2017.1412019
3. Matthijnssens J., Ciarlet M., Rahman M., Attoui H., Banyai K., Estes M.K., et al. Recommendations for the classification of group A rotaviruses using all 11 genomic RNA segments. Arch. Virol. 2008; 153(8): 1621-9. https://doi.org/10.1007/s00705-008-0155-1
4. Manual of rotavirus detection and characterization methods. World Health Organization; 2009.
Available at: https://www.who.int/vaccines-documents/
5. Doro R., Laszlo B., Martella V., Leshem E., Gentsch J., Parashar U., et al. Review of global rotavirus strain prevalence data from six years post vaccine licensure surveillance: is there evidence of strain selection from vaccine pressure? Infect. Genet. Evol. 2014; 28: 446-61. https://doi.org/10.1016/j.meegid.2014.08.017
6. Zhou X., Wang Y.H., Ghosh S., Tang W.F., Pang B.B., Liu M.Q., et al. Genomic characterization of G3P[6], G4P[6] and G4P[8] human rotaviruses from Wuhan, China: Evidence for interspe-
cies transmission and reassortment events. Infect. Genet. Evol. 2015; 33: 55-71.
https://doi.Org/10.1016/j.meegid.2015.04.010
7. Salamunova S., Jackova A., Csank T., Mandelik R., Novotny J., Beckova Z., et al. Genetic variability of pig and human rotavirus group A isolates from Slovakia. Arch. Virol. 2020; 165(2): 463-70. https://doi.org/10.1007/s00705-019-04504-6
8. Doro R., Farkas S.L., Martella V., Banyai K. Zoonotic transmission of rotavirus: surveillance and control. Expert. Rev. Anti. Infect. Ther. 2015; 13(11): 1337-50. https://doi.org/10.1586/14787210.2015.1089171
9. Velasquez D.E., Jiang B. Evolution of P[8], P[4], and P[6] VP8* genes of human rotaviruses globally reported during 1974 and 2017: possible implications for rotavirus vaccines in development. Hum. Vaccin. Immunother. 2019; 15(12): 3003-8. https://doi.org/10.1080/21645515.2019.1619400
10. Hungerford D., Vivancos R., Read J.M., Iturriza-Gomicron-mara M., French N., Cunliffe N.A. Rotavirus vaccine impact and socioeconomic deprivation: an interrupted time-series analysis of gastrointestinal disease outcomes across primary and secondary care in the UK. BMC Med. 2018; 16(1): 10. https://doi.org/10.1186/s12916-017-0989-z
11. Freeman M.M., Kerin T., Hull J., McCaustland K., Gentsch J. Enhancement of detection and quantification of rotavirus in stool using a modified real-time RT-PCR assay. J. Med. Virol. 2008; 80(8): 1489-96. https://doi.org/10.1002/jmv.21228
12. Kiseleva V., Faizuloev E., Meskina E., Marova A., Oksanich A., Samartseva T., et al. Molecular-genetic characterization of human rotavirus a strains circulating in Moscow, Russia (20092014). Virol. Sin. 2018; 33(4): 304-13. https://doi.org/10.1007/s12250-018-0043-0
13. Iturriza-Gomara M., Isherwood B., Desselberger U., Gray J. Reassortment in vivo: driving force for diversity of human rota-virus strains isolated in the United Kingdom between 1995 and 1999. J. Virol. 2001; 75(8): 3696-705. https://doi.org/10.1128/JVI.75.8.3696-3705.2001
14. Simmonds M.K., Armah G., Asmah R., Banerjee I., Daman-ka S., Esona M., et al. New oligonucleotide primers for P-typing of rotavirus strains: Strategies for typing previously untypeable strains. J. Clin. Virol. 2008; 42(4): 368-73. https://doi.org/10.1016/jjcv.2008.02.011
15. Froussard P. rPCR: a powerful tool for random amplification of whole RNA sequences. PCR Methods Appl. 1993; 2(3): 185-90. https://doi.org/10.1101/gr.2.3.185
16. Li H. Minimap2: pairwise alignment for nucleotide sequences. Bioinformatics. 2018; 34(18): 3094-100. https://doi.org/10.1093/bioinformatics/bty191
17. Maes P., Matthijnssens J., Rahman M., Van Ranst M. RotaC: a web-based tool for the complete genome classification of group A rotaviruses. BMC Microbiol. 2009; 9: 238. https://doi.org/10.1186/1471-2180-9-238
18. Faizuloev E., Mintaev R., Petrusha O., Marova A., Smirno-va D., Ammour Y., et al. New approach to genetic characterization of group A rotaviruses by the nanopore sequencing method. J. Virol. Methods. 2021; 292: 114114. https://doi.org/10.1016/jjviromet.2021.114114
19. Kumar S., Stecher G., Li M., Knyaz C., Tamura K. MEGA X: Molecular Evolutionary Genetics Analysis across Computing Platforms. Mol. Biol. Evol. 2018; 35(6): 1547-9. https://doi.org/10.1093/molbev/msy096
20. Kimura M. A simple method for estimating evolutionary rates of base substitutions through comparative studies of nucleotide sequences. J. Mol. Evol. 1980; 16(2): 111-20. https://doi.org/10.1007/BF01731581
21. Cowley D., Donato C.M., Roczo-Farkas S., Kirkwood C.D. Emergence of a novel equine-like G3P[8] inter-genogroup reassortant rotavirus strain associated with gastroenteritis in Australian children. J. Gen. Virol. 2016; 97(2): 403-10. https://doi.org/10.1099/jgv.0.000352
22. Arana A., Montes M., Jere K.C., Alkorta M., Iturriza-Go-mara M., Cilla G. Emergence and spread of G3P[8] rotaviruses possessing an equine-like VP7 and a DS-1-like genetic backbone in the Basque Country (North of Spain), 2015. Infect. Genet. Evol. 2016; 44: 137-44. https://doi.org/10.10167j.meegid.2016.06.048
23. Doro R., Marton S., Bartokne A.H., Lengyel G., Agocs Z., Jak-ab F., et al. Equine-like G3 rotavirus in Hungary, 2015 — is it a novel intergenogroup reassortant pandemic strain? Acta. Microbiol. Immunol. Hung. 2016; 63(2): 243-55. https://doi.org/10.1556/030.63.2016.2.8
24. Guerra S.F.S., Soares L.S., Lobo P.S., Penha Junior E.T., Sousa Junior E.C., Bezerra D.A.M., et al. Detection of a novel equine-like G3 rotavirus associated with acute gastroenteritis in Brazil. J. Gen. Virol. 2016; 97(12): 3131-8. https://doi.org/10.1099/jgv.0.000626
25. Komoto S., Tacharoenmuang R., Guntapong R., Ide T., Haga K., Katayama K., et al. Emergence and characterization of unusual DS-1-like G1P[8] rotavirus strains in children with diarrhea in Thailand. PLoS One. 2015; 10(11): e0141739. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0141739
26. Kaira A.N., Fayzuloyev E.B., Lavrov V.F., Svitich O.A., Solo-may T.V., Nikonova A.A., et al. Epidemiological trends of morbidity and issues of rotavirus vaccination at the present stage. Sanitary Doctor. 2020; 6: 16-25. https://doi.org/0.33920/med-08-2006-02
27. Ivashechkin A.A., Yuzhakov A.G., Grebennikova T.V., Yuzha-kova K.A., Kulikova N.Y., Kisteneva L.B., et al. Genetic diversity of group A rotaviruses in Moscow in 2018-2019. Arch. Virol. 2020; 165(3): 691-702. https://doi.org/10.1007/s00705-020-04534-5
28. Yuzhakov G., Yuzhakova K., Kulikova N., Kisteneva L., Chere-pushkin S., Smetanina S., et al. Prevalence and genetic diversity of group a rotavirus genotypes in Moscow (2019-2020). Pathogens. 2021; 10: 674. https://doi.org/10.3390/pathogens10060674
29. Sashina T.A., Morozova O.V., Epifanova N.V., Novikova N.A. Predominance of new G9P[8] rotaviruses closely related to Turkish strains in Nizhny Novgorod (Russia). Arch. Virol. 2017; 162(8): 2387-92. https://doi.org/10.1007/s00705-017-3364-7
30. Novikova N.A., Sashina T.A., Solntsev L.A., Epifanova N.V., Kashnikov A.Yu., Pogodina L.V., et al. Manifestations of epidemic process of rotavirus infection in Nizhny Novgorod in pre-vaccination period. Zhurnal mikrobiologii, epidemiologii i immunobiologii. 2017; 94(5): 46-52. https://doi.org/10.36233/0372-9311-2017-5-46-52 (in Russian)
31. Denisyuk N.B. Genetic characteristics of rotaviruses group a circulating in the Orenburg region in season 2016-2017. Detskie infektsii. 2017; 16(4): 42-5. https://doi.org/10.22627/2072-8107-2017-16-4-42-45
(in Russian)
ORIGINAL RESEARCHES
32. Meskina E.R., Ushakova A.Yu., Fayzuloev E.B., Bakhtoya-rov G.N., Kiseleva V.V. A Comparative characteristic of gastroenteritis associated with G4P[8] and G9P[8] genotype rotaviruses in children hospitalized in Moscow (2012-2013 epidemic season). Infektsionnye bolezni. 2017; 15(1): 23-8. https://doi.org/10.20953/1729-9225-2017-1-23-28
(in Russian)
33. Katz E.M., Esona M.D., Betrapally N.S., De La Cruz De Leon L.A., Neira Y.R., Rey G.J., et al. Whole-gene analysis of inter-genogroup reassortant rotaviruses from the Dominican Republic: Emergence of equine-like G3 strains and evidence of their reassortment with locally-circulating strains. Virology. 2019; 534: 114-31.
https://doi.org/10.1016/j.virol.2019.06.007
34. Fujii Y., Oda M., Somura Y., Shinkai T. Molecular characteristics of novel mono-reassortant G9P[8] rotavirus a strains possessing the NSP4 gene of the E2 genotype detected in Tokyo, Japan. Jpn J. Infect. Dis. 2020; 73(1): 26-35. https://doi.org/10.7883/yoken.JJID.2019.211
35. McDonald S.M., Matthijnssens J., McAllen J.K., Hine E., Overton L., Wang S., et al. Evolutionary dynamics of human rotavi-ruses: balancing reassortment with preferred genome constellations. PLoSPathog. 2009; 5(10): e1000634. https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1000634
36. Papp H., Borzak R., Farkas S., Kisfali P., Lengyel G., Molnar P., et al. Zoonotic transmission of reassortant porcine G4P[6] rotaviruses in Hungarian pediatric patients identified sporadically over a 15 year period. Infect. Genet. Evol. 2013; 19: 71-80. https://doi.org/10.1016Zj.meegid.2013.06.013
37. Esona M.D., Geyer A., Banyai K., Page N., Aminu M., Ar-mah G.E., et al. Novel human rotavirus genotype G5P[7] from child with diarrhea, Cameroon. Emerg. Infect. Dis. 2009; 15(1): 83-6. https://doi.org/10.3201/eid1501.080899
38. Wang Y.H., Kobayashi N., Nagashima S., Zhou X., Ghosh S., Peng J.S., et al. Full genomic analysis of a porcine-bovine reassortant G4P[6] rotavirus strain R479 isolated from an infant in China. J. Med. Virol. 2010; 82(6): 1094-102. https://doi.org/10.1002/jmv.21760
39. Zeller M., Patton J.T., Heylen E., De Coster S., Ciarlet M., Van Ranst M., et al. Genetic analyses reveal differences in the VP7 and VP4 antigenic epitopes between human rotaviruses circulating in Belgium and rotaviruses in Rotarix and RotaTeq. J. Clin. Microbiol. 2012; 50(3): 966-76. https://doi.org/10.1128/JCM.05590-11
40. Imagawa T., Saito M., Yamamoto D., Saito-Obata M., Masa-go Y., Ablola A.C., et al. Genetic diversity of species A rotavi-ruses detected in clinical and environmental samples, including porcine-like rotaviruses from hospitalized children in the Philippines. Infect. Genet. Evol. 2020; 85: 104465. https://doi.org/10.1016/j.meegid.2020.104465
Информация об авторах
Петруша Ольга Александровнаи — м.н.с. лаб. молекулярной вирусологии НИИВС им. И.И. Мечникова, Москва, Россия, petrusha. olga@gmail.com, https://orcid.org/0000-0002-5022-7962 Корчевая Екатерина Романовна — м.н.с. лаб. молекулярной вирусологии НИИВС им. И.И. Мечникова, Москва, Россия, https://orcid.org/0000-0002-6417-3301
Минтаев Рамиль Рафаилович — м.н.с. лаб. генетики РНК-со-держащих вирусов НИИВС им. И.И. Мечникова, Москва, Россия, https://orcid.org/0000-0001-5398-3627
Никонова Александра Александровна — к.б.н., зав. лаб. молекулярной биотехнологии НИИВС им. И.И. Мечникова, Москва, Россия, https://orcid.org/0000-0001-9610-0935
Исаков Игорь Юрьевич — м.н.с. лаб. молекулярной биотехнологии НИИВС им. И.И. Мечникова, Москва, Россия, https://orcid.org/0000-0002-5742-6550
Information about the authors
Olga A. PetrushaM — junior researcher, Laboratory of molecular virology, I. Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera, Moscow, Russia, petrusha.olga@gmail.com, https://orcid.org/0000-0002-5022-7962
Ekaterina R. Korchevaya — junior researcher, Laboratory of molecular virology, I. Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera, Moscow, Russia, https://orcid.org/0000-0002-6417-3301
Ramil R. Mintaev—junior researcher, Laboratory of genetics of RNA viruses, I. Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera, Moscow, Russia, https://orcid.org/0000-0001-5398-3627 Alexandra A. Nikonova — Cand. Sci. (Biol.), Head, Laboratory of molecular biotechnology, I. Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera, Moscow, Russia, https://orcid.org/0000-0001-9610-0935 Igor Yu. Isakov—junior researcher, Laboratory of molecular biotechnology, I. Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera, Moscow, Russia, https://orcid.org/0000-0002-5742-6550
ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
Мескина Елена Руслановна — д.м.н., зав. отд. детских инфекций отдела терапии МОНИКИ им. М.Ф. Владимирского, Москва, Россия, https://orcid.org/0000-0002-1960-6868
Ушакова Анна Юрьевна — к.м.н., ассистент кафедры хирургии МОНИКИ им. М.Ф. Владимирского, Москва, Россия, https://orcid.org/0000-0001-84387609
Хадисова Марима Касумовна — к.м.н., н.с. отд. детских инфекций, отдел терапии МОНИКИ им. М.Ф. Владимирского, Москва, Россия. https://orcid.org/0000-0001-8293-6643 Зверев Виталий Васильевич — д.м.н., профессор, академик РАН, зав. кафедрой микробиологии, вирусологии, иммунологии ПМГМУ им. И.М. Сеченова, Москва, Россия, https://orcid.org/0000-0002-0017-1892
Файзулоев Евгений Бахтиерович — к.б.н., зав. лаб. молекулярной вирусологии НИИВС им. И.И. Мечникова, Москва, Россия, https://orcid.org/0000-0001-7385-5083
Участие авторов. Все авторы внесли существенный вклад в проведение поисково-аналитической работы и подготовку статьи, прочли и одобрили финальную версию до публикации.
Статья поступила в редакцию 12.11.2021; принята к публикации 02.02.2022; опубликована 28.02.2022
Elena R. Meskina — D. Sci. (Med.), Professor, Department of children's infections, Therapy department, M. Vladimirsky Moscow Regional Research Clinical Institute, Moscow, Russia, https://orcid.org/0000-0002-1960-6868
Anna Yu. Ushakova — Cand. Sci. (Med.), assistant, Department of children's infections, M. Vladimirsky Moscow Regional Research Clinical Institute, Moscow, Russia, https://orcid.org/0000-0001-84387609 Marima K. Khadisova — Cand. Sci. (Med.), Department of children's infections, Therapy department, M. Vladimirsky Moscow Regional Research Clinical Institute, Moscow, Russia, https://orcid.org/0000-0001-8293-6643
Vitaly V. Zverev — D. Sci. (Med.), Professor, Academician of the Russian Academy of Sciences, Head, Department of microbiology, virology and immunology, I.M. Sechenov First Moscow State Medical University (Sechenov University), Moscow, Russia, https://orcid.org/0000-0002-0017-1892
Evgeny B. Faizuloev — Cand. Sci. (Biol.), Head, Laboratory of molecular virology, I. Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera, Moscow, Russia, https://orcid.org/0000-0001-7385-5083
Author contribution. All authors made a substantial contribution to the conception of the work, acquisition, analysis, interpretation of data for the work, drafting and revising the work, final approval of the version to be published.
The article was submitted 12.11.2021; accepted for publication 02.02.2022;
published 28.02.2022
