CC BY
0INTERNATIONAL SCIENTIFIC AND PRACTICAL CONFERENCE
"ACTUAL PROBLEMS OF LIVESTOCK DEVELOPMENT, MODERN METHODS AND
DEVELOPMENT PROSPECTS" _SEPTEMBER 26-27, 2024_
УДК: 636.2.034
ГЕНОТИП ПЛЕМЕННОГО БЫКА-ПРОИЗВОДИТЕЛЯ БУШУЕВСКОЙ ПОРОДЫ УЗБЕКИСТАНА ПО Р-
КАЗЕИНУ(С8Ш)
1Гиясов Хусанжон Абдуллаевич, 2Шеримбетов Анвар Гульмирзаевич, 3Адилов
Бахтиёр Шухратович
1Зав.отделом скотоводства Узбекского НИИ, животноводства и птицеводства, канд. с.х.
наук - руководитель проекта, 2д.б.н., зав.лаборатории института Генетики и экспериментальной биологии растений АН РУз, 3д.б.н., в. н. с. института Генетики и экспериментальной биологии растений АН РУз. https://doi.org/10.5281/zenodo.13860041
Аннотация. В статье приведены предварительные результаты молекулярно-генетических исследований гена бета-казеина (CSN2) узбекской молочной Бушуевской породы КРС в рамках научно-практического проекта «Разработка молекулярных панелей для генетической паспортизации уникальных пород животных».
Ключевые слова: бушуевская порода, генофонд, молекулярно-генетические исследования, ДНК маркеры, SNP-маркеры, ПЦР, генетический паспорт, селекция.
Аннотация. Мацолада Узбекистоннинг сутдор бушуев зотининг бета-казеин (CSN2) гени буйича "Ноёб зотли цайвонларни генетик жихатдан паспортлаштириш учун молекуляр панеллар ишлаб чициш" мавзусидаги илмий-амалий лойща доирасида амалга оширилган молекуляр-генетик тадцицотларнинг дастлабки натижалари келтирилган.
Калит сузлар: бушуев зоти, генофонд, молекуляр-генетик тадцицотлар, ДНК маркерлар, SNP-маркерлар, ПЗР, генетик паспорт, селекция.
Abstract. The article presents preliminary results of molecular genetic studies of the beta-casein gene (CSN2) of the Uzbek dairy Bushuevskaya cattle breed within the framework of the scientific and practical project "Development of molecular panels for genetic passportization of unique animal breeds".
Keywords: Bushuevskaya breed, gene pool, molecular genetic studies, DNA markers, SNP markers, PCR, genetic passport, selection.
ВВЕДЕНИЕ. Анализ проведенных исследований показывает, что для повышения продуктивности животных важным фактором являются уклепление кормовой базы животноводства, полноценное кормление и применение современных методов выращивания и воспроизводства. (Б.Д.Аллашов, С.Г.Жамалов, А.А.Нурматов, Н.Рузибаев, И.Хафизов и др.). А также очень важное значение имеет совершенствование племенных качеств животных используя генетические факторы.
Успех селекционной работы в значительной степени зависит от точности определения племенной ценности животных. В связи с этим возрастает значение молекулярно-генетических методов, позволяющих выявлять лучших животных и прогнозировать их племенные качества в раннем возрасте.
Достижения современной молекулярной генетики позволяют определять гены, контролирующие хозяйственно-полезные признаки. Выявление вариантов генов позволит дополнительно к традиционному отбору животных проводить селекцию непосредственно на уровне ДНК. Преимущество ДНК-технологий заключается в том, что можно определить
INTERNATIONAL SCIENTIFIC AND PRACTICAL CONFERENCE
"ACTUAL PROBLEMS OF LIVESTOCK DEVELOPMENT, MODERN METHODS AND
DEVELOPMENT PROSPECTS" _SEPTEMBER 26-27, 2024_
генотип животного независимо от пола, возраста и физиологического состояния, что является важным фактором в селекционной работе[5].
Главным белком молока является казеин. Казеины составляют около 78-82% от общего количества белков молока коров. На долю Р-казеина приходится 22-23% общего белка молока. У крупного рогатого скота выявлено 13 различных генетических вариантов Р-казеина (CSN2), среди которых наиболее распространены аллели А1 и А2 (Hanusova et al., 2018 ). Также была выявлена потенциальная польза потребления Р-казеинового молока А2 для улучшения работы желудочно-кишечного тракта, детского питания и иммунной системы человека.
В качестве потенциальных маркеров молочной продуктивности могут рассматриваться аллели генов молочных белков и гормонов. Ген бета-казеина (CSN2) -связан с белковомолочностью и технологическими свойствами молока. Аллель гена бета казеина CSN3B ассоциирован с более высоким содержанием белка в молоке. Ген бета-лактоглобулина (LGB) отвечает за белковомолочность и показатель биологической ценности молока (Stralkowska N., 2002; Зиновьева Н А и др., 2003). Вариант LGBB связан с высоким содержанием в молоке казеиновых белков, высоким процентом жира, а вариант LGBA характеризуется высоким содержанием сывороточных белков. Основная функция пролактина (PRL) у млекопитающих - стимуляция развития молочных желез, а также образования и секреции молока. Данные научных публикаций свидетельствуют о возможности использования генов CSN2, LGB, PRL и GH в качестве ДНК-маркеров молочной продуктивности, жирномолочности и белковомолочности КРС [6,9,11].
С помощью ДНК маркеров можно оценить частоту предпочтительных аллелей для породы или линий, и с учетом этого проводить селекцию животных, имеющих определенные желательные аллели[6].
По утверждению О.Л.Гетманцева, А.И. Клименко и др. ДНК-маркеры имеют ряд преимуществ: позволяют однозначно отличить гомозиготный генотип от гетерозиготного, не подвержены влиянию условий среды и имеют коэффициент наследуемости h2 =1,0. Кроме того, ДНК-маркеры, как правило, определяются независимо от возраста (в клетках эмбриона, в образцах крови, ткани животного и т.д.), могут быть определены у обоих полов животного. И наконец позволяет проводить маркирование признака, который может быть определен после убоя [2].
В молекулярно-генетических исследованиях русских ученых М.А.Леонова, А.Ю.Колосова, А.В.Радюка и др. выявлены перспективные гены-маркеры КРС[5].
Внедрение этих генетических маркеров в селекционно-племенную работу позволяет раннее прогнозирование племенных и продуктивных показателей животных, а также использовать эту информацию о наследственном потенциале отбираемых животных, повысить точность оценки и эффективность результатов селекции.
АКТУАЛЬНОСТЬ ТЕМЫ. Проблема сохранения и восстановления генетического разнообразия животных, особенно исчезающих пород, в настоящее время приобрела приоритетный характер и ей уделяется огромное внимание во всем мире.
Бушуевская порода КРС является одной из уникальной молочной породой крупного рогатого скота выведенного в Узбекистане. Как порода она зарегистрирована в 1967 году. Эта порода занимает первое место по жирномолочности среди разводимых пород в Узбекистане. От других пород она отличается хорошей адаптацией к жарким условиям республики и устойчивостью паразитарным заболеваниям крови. При нормальных
INTERNATIONAL SCIENTIFIC AND PRACTICAL CONFERENCE
"ACTUAL PROBLEMS OF LIVESTOCK DEVELOPMENT, MODERN METHODS AND
DEVELOPMENT PROSPECTS" _SEPTEMBER 26-27, 2024_
условиях кормления, содержания и селекционно-племенных работ от бушуевских коров надоено в среднем по 3500-4500 кг молока в год. Молочная продуктивность некоторых коров-рекордсменов данной породы в племенных хозяйствах страны составило 10-10,6 тысч кг в год[3].
Однако, в последние годы в Узбекистане из-за импорта других высокопродуктивных пород КРС и ненадлежащего внимания к разведению отечественной бушуевской породы во многих хозяйствах поголовье данной породы уменьшается.
В племенных хозяйствах Республики Узбекистан количество чистопородных коров и телок старше двух лет бушуевской породы на сегодняшний день составляет меньше 500 голов. Исходя из этого, можно сделать вывод о том, что этой уникальной бушуевской породе КРС грозит исчезновение [3].
Рис. 1. Корова и бык-производитель бушуевской породы
Согласно известной классификации количественного статуса пород Данкверта С.А., Охапкина С.К., Дунина И.М. и др. при угрожающем статусе количество самок исчезающей породы составляет в пределах 100-1000 голов, популяция находится под угрозой вымирания[5].
С целью сохранения ценного генофонда отечественной породы учёными НИИ Животноводства и птицеводства совместно учёными института Генетики и экспериментальной биологии растений АН Республики Узбекистан на примере уникальной бушевской породы осуществляется научно-практический проект на тему «Разработка молекулярных панелей для генетической паспортизации уникальных пород животных».
МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЙ. На первом этапе объектом исследований явился племенной бык-производитель бушуевской породы по кличке "Шерхан", используемый в отборе семени в Госплемпредприятии «Узнаслчилик». Кровь, полученную у быка-производителя, вносили в пробирки с 100 мМ ЭДТА до конечной концентрации 10 мМ.
Выделение ДНК осуществляли с использованием набора для очистки геномной ДНК GeneJET (Thermo Fisher Scientific). Ген бета-казеина быка амплифицировали с использованием праймеров CSN2_F1(5'-GTCCCAGCCAAGGTCTGTAG-3') и CSN2_R1 (5'-A GCTCACCCTATCTTTTCCCTCT -3'), с последующим секвенированием полученного ПЦР продукта (табл.1)
Измерение количества и качества геномной ДНК проводили с помощью спектрофотометра NanoDrop Eight (Thermo Fisher Scientific, США), затем образцы ДНК хранили при -20°С до проведения ПЦР.
Для ПЦР использовали смесь реагентов для амплификации "Platinum™ SuperFi™ DNA Polymerase" (Thermo Fisher Scientific, США). ПЦР-смесь (25 мкл) содержала ДНК (4
INTERNATIONAL SCIENTIFIC AND PRACTICAL CONFERENCE "ACTUAL PROBLEMS OF LIVESTOCK DEVELOPMENT, MODERN METHODS AND
DEVELOPMENT PROSPECTS" _SEPTEMBER 26-27, 2024_
мкл), 13,35 мкл dd H2O, 5 мкл 5X SuperFi™ Buffer, 0.4 мкл 10 мМ смеси dNTP, 1 мкл 10 мМ прямого праймера, 1 мкл 10 мМ обратного праймера, 0.25 мкл ДНК-полимеразы Platinum™ SuperFi™. ПЦР проводили на амплификаторе "MiniAmp Plus" (Thermo Fisher Scientific, США).
Таблица 1
Используемые праймеры
Праймер Нуклеотидная последовательность
CSN2_F1 GTCCCAGCCAAGGTCTGTAG
CSN2_R1 GCTCACCCTATCTTTTCCCTCT
Для ПЦР использовали следующую программу термоциклирования: начальная денатурация (95°С, 10 мин), денатурация (94°С, 10 с), отжиг (60°С, 30 с), элонгация (72°С, 1 мин). 40 циклов, финальная элонгация (72°С, 5 мин). Полученные продукты ПЦР исследовали методом гель-электрофореза с буфером lxTBE (рН 8,3) в 2% агарозном геле с последующим окрашиванием геля раствором бромистого этидия (EtBr) 0,5 мкг/мл.
Электрофорез проводили на системе горизонтального электрофореза СЭ-1 («Геликон», Россия) при напряжении 100 W в течение 100 минут. Продукты ПЦР визуализировали в УФ-свете и фото документировали с помощью гель-документирующей системы BK-AG100 (Biobase Kings Co., Ltd, Китай).
Секвенирование проводили c использованием технологии Oxford Nanopore с помощью секвенатора GridlON (в Швейцарии), оснащенного проточной ячейкой R10.3. Процесс секвенирования контролировался программой MinKNOW (v.19.12.5). Base-calling был выполнен с помощью Guppy (версия 3.2.10).
Биоинформатический анализ. Анализ сходства нуклеотидной последовательности гена бета-казеина проводили с использованием базы данных GenBank при помощи программы BLAST Национального центра биотехнологической информации США^СВ1) (Altschul et al. 1990; https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) и близкородственные нуклеотидные последовательности данного гена были взяты из базы данных GeneBank NCBI для последующего филогенетического анализа. Множественное выравнивание нуклеотидных последовательностей проводили с помощью алгоритма ClustalW и построение филогенетических деревьев проводили методом Maximum Likelihood (максимального правдоподобия) с использованием модели Tamura-Nei (1000 boostrap-повторов) с использованием программы MEGA 11 (Molecular Evolutionary Genetics Analysis version 11 (Tamura, et al, 2021)[4].
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ. В результате амплификации участка гена бета-казеина был получены ПЦР продукт ожидаемого размера (~8900 п. н). Выявлено 8 SNP и 3 делеционных полиморфизма. Полученный ампликон был очищен и секвенирован c использованием технологии Oxford Nanopore.
У племенного быка-производителя Бушуевской породы по кличке «Шерхан» выявлен гомозиготный генотип A2A2, которое можно эффективно использовать для селекции коров с A2A2 генотипом, дающих молоко А2, которое является наиболее безопасным и наиболее полезным для организма человека. Производитель идеально подходит для повышения выхода сухого молочного остатка на гектар с.х. угодий и производства сыра.
INTERNATIONAL SCIENTIFIC AND PRACTICAL CONFERENCE
"ACTUAL PROBLEMS OF LIVESTOCK DEVELOPMENT, MODERN METHODS AND
DEVELOPMENT PROSPECTS" _SEPTEMBER 26-27, 2024_
Результаты Blast-анализа секвенированной нуклеотидной последовательности гена бета-казеина в базе данных GenBank NCBI, а также филогенетический анализ показали, что данная порода имеет наибольшее генетическое сходство (99,83%) с породами Leiqiong, Yiling, Guanling китайского зебувидного КРС (Bos indicus), (идент. номера Genbank JAKQXS010000026, JAJUAW010000026, JAJUAI010000026 соответственно), а также 99,51% генетическое сходство с индийской зебувидной породой КРС "Gir" (ID номер Genbank PRDE01000026) (табл.2).
Нуклеотидная последовательность гена бета-казеин (CSN2) депонирована в международную базу данных GenBank NCBI в Европейский нуклеотидный архив EMBL-EBI (Великобритания) и в базу ДНК данных DDBJ Япония, под номером PP504900.
Следует также отметить, что по этому гену бушуевская порода показала 99, 83% генетическое сходство с китайскими породами КРС Bos indicus "Leiqiong" и "Yiling" и 99,51% генетическое сходство с индийской зебу видной породой KPC"Gir" (ID номер Genbank PRDE01000026).
Таблица 2
Результаты Blast-анализа секвенирования гена бета-казеина (CSN2) быка-производителя Бушуевской породы "Шерхан"
Идентификационные номера(accession number) нуклеотидной последовательности гена бета-казеина (CSN2) пород КРС наиболее близкородственных по отношению к быку-производителю Бушуевской породы и степень сходства нуклеотидной последовательности (nucleotide sequence identity %) по гену бета-казеина (CSN2)
JAKQXS010000026 JAJUAW010000026
Bos indicus порода "Leiqiong" - 99,83% Bos indicus порода "Yiling" -99, 83%
JAJUAI010000026 Bos indicus PRDE01000026
порода "Guanling" (Китай) 99,83% pos indicus порода "Gir" (Индия) -99,51%
В результате множественного элаймента (ClustalW) нуклеотидной последовательности гена бета-казеина (CSN2) быка-производителя Бушуевской породы с китайской зебувидной (Bos indicus) породы "Leiqiong" выявлено 8 SNP и 3 делеционных
INTERNATIONAL SCIENTIFIC AND PRACTICAL CONFERENCE
"ACTUAL PROBLEMS OF LIVESTOCK DEVELOPMENT, MODERN METHODS AND
DEVELOPMENT PROSPECTS" _SEPTEMBER 26-27, 2024_
полиморфизма. Также было выявлено, что племенной бык-производитель Бушуевской породы «Шерхан» имеет гомозиготный генотип A2A2.
ВЫВОДЫ: Бушуевская молочная порода КРС по гену бета-казеина имеет наибольшее генетическое сходство с породами Leiqiong, Yiling, Guanling китайского зебувидного КРС (Bos indicus) а также с индийской зебувидной породой "Gir". Выявлено 8 SNP и 3 делеционных полиморфизма. Племенной бык-производитель Бушуевской породы по кличке «Шерхан» имеет гомозиготный генотип A2A2. Быков-производителей с данным генотипом можно эффективно использовать для селекции коров с A2A2 генотипом, дающих молоко А2, которое является наиболее безопасным и наиболее полезным для организма человека. Производитель идеально подходит для повышения выхода сухого молочного остатка на гектар с.х. угодий и производства сыра.
REFERENCES
1. Аллашов Б., С.Жамолов. Подбор сортов кормовых культур устойчивых к жаре и водному дефициту. Ж. Актуальные проблемы пустынного животноводства, экологии и создания пастбищных агрофитоценозов. 2023/11/11. С.230-233
2. Гетманцева О.Л., Клименко А.И. и др. "Молекулярно-генетические исследования сельскохозяйственных животных методом ПЦР-ПДРФ" Учебное пособие. Донской ГАУ, Персиановский, 2018., с.119.
3. Гиясов Х.А., Бойбулов Б.Ш. "Сохраним породу скота единственно выведенного в Узбекистане" Ж. "Животноводство и племенное дело" Ташкент, 2021 г. №03, с. 8-11.
4. Данкверт С.А., Охапкин С.К., и др. «Система сохранения, восстановления и рационального использования генофонда отечественных малочисленных пород крупного рогатого скота» Москва 2001.
5. Леонова М.А., Колосов А.Ю., Радюк А.В. и др. "Перспективные гены-маркеры продуктивности сельскохозяйственных животных" Москва 2013.
6. Марзанова С.Н., Девришов Д.А. и Алексеев Я.И. "Набор последовательности праймеров и аллель специфических зондов для одновременной генодиагностики четырёх мутантных аллелей каппа казеина у КРС". № RU 2646140. МПК (C12Q1/68).
7. Mamadov F.K, Xolmatov A.X, Hasanov H.T. PARRANDACHILIK XO'JALIKLARIDA KUNLAR ISIY BOSHLASHI BILAN AMALGA OSHIRILADIGAN TADBIRLAR. 2024, DOI: https://doi.org/10.5281/zenodo.11474052
8. Нурматов А.А. Научно-исследовательские работы проводимые НИИ Животноводства и птицеводства, перспективы их внедрения в производство. Сборник материалов международной конференции. Ташкент, 2019 г.С.5
9. Рузибаев Н.Р., Мадрахимов Ш.Н. и др. Содержание, разведение и повышение продуктивности бушуевской породы крупного рогатого скота - задача актуальная. Ж. Животноводство и племенная работа. -2019, -№6 (11). Т, -С. 9-12
10. Хабибрахманова Я.А. Полиморфизм генов молочных белков и гормонов крупного рогатого скота. Автореф. дисс. канд. биол. наук. Лесные поляны, 2009 г., 19 с.
11. Хафизов И.И. ^орабайир зотли отлар генофондининг генетик хилма-хиллиги., "Узбекистон кишлок ва сув хужалиги" Ж., Тошкент, 2023, махсус сони (3) (96), 45-47 б.
12. Giyasov Kh.A. Molecular Genetic Studies with the Bushuev Breed of Uzbekistan INTERNATIONAL JORNAL OF BIOLOGICAL ENGENERING AND AGRICULTURE,
INTERNATIONAL SCIENTIFIC AND PRACTICAL CONFERENCE "ACTUAL PROBLEMS OF LIVESTOCK DEVELOPMENT, MODERN METHODS AND
DEVELOPMENT PROSPECTS" SEPTEMBER 26-27, 2024
PUBLISHED: In Vol. 1 No. 4 (2022): 2022-10-22, Page 30-33 13. Hanusova E, Huba J, Oravcova M, Polak P, Vrtkova I. Genetic variants of beta-casein in Holstein dairy cattle in Slovakia. Slovak J Anim Sci. 2010;43(2):63-66.
