CC BY
26СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫЕ НАУКИ
УДК 577.21
Н.А. ГЛИНСКАЯ, канд. с-х. наук, доцент, доцент кафедры биохимии и биоинформатики1
Е.С. СИЛЬЧЕНКО
лаборант кафедры биохимии и биоинформатики1
В.В. НИКОЛАЕВА
магистрант1
Е.И. ПРИЛОВСКАЯ
ассистент кафедры биохимии и биоинформатики1 1 Полесский государственный университет, г. Пинск, Республика Беларусь
Статья поступила 1 апреля 2021 г.
ПОЛИМОРФИЗМ ГЕНА БЕТА-КАЗЕИНА (CSN2) И АНАЛИЗ БИОХИМИЧЕСКОГО СОСТОЯНИЯ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА БЕЛОРУССКОЙ ЧЕРНО-ПЕСТРОЙ ПОРОДЫ
В данной статье приведены результаты генотипирования крупного рогатого скота белорусской черно-пестрой породы по гену CSN2. Выявлена взаимосвязь гена CSN2 с молочной продуктивностью в исследуемой группе животных. Проанализированы биохимические показатели крови крупного рогатого скота белорусской черно-пестрой породы различных по генотипам гена бета-казеина (CSN2). Показана целесообразность и эффективность проведения молекулярно-генетического тестирования исследуемых животных по изучаемому гену для объективной оценки их генетического потенциала и накопления в стадах «желательных генотипов».
Ключевые слова: полиморфизм, ген CSN2, частота встречаемости, молочная продуктивность, биохимические показатели.
GLINSKAYA N., PhD in Agric. Sc., Associate Professor Associate Professor of the Department of Biochemistry and Bioinformatics1
SILCHENKO Е.
Laboratory Assistant at the Department of Biochemistry and Bioinformatics1 NIKOLAEVA V.
Undergraduate1
PRILOVSKAYA E.
Assistant at the Department of Biochemistry and Bioinformatics1 1Polessky State University, Pinsk, Republic of Belarus
POLYMORPHISM OF BETA-CASEIN GENE (CSN2)
AND ANALYSIS OF BIOCHEMICAL STATE OF BOVINE CATTLE
OF BELARUSIAN BLACK-AND-POTTED BREEDS
This article presents the results of genotyping by CSN2 gene of cattle of the Belarusian black-and-white breed. The relationship of the CSN2 gene with milk productivity in the studied group of animals was revealed. The biochemical parameters of the blood of cattle of the Belarusian black-and-white breed of dif-
ferent genotypes of the beta-casein gene (CSN2) were analyzed. The expediency and effectiveness of molecular genetic testing of the studied animals for the studied gene to evaluate objectively the genetic situation and the accumulation of "desirable genotypes" in herds is shown.
Keywords: polymorphism, CSN2 gene, frequency of occurrence, milk production, biochemical parameters.
Введение. Молочное скотоводство является одной из важнейших отраслей сельского хозяйства Беларуси, которое стремится к достижению положительных результатов в вопросах как увеличения производства молока, так и к улучшению его качества [1].
Современная молекулярная генетика позволяет на уровне ДНК определять гены, контролирующие хозяйственно-полезные признаки животных [2, 3].
В качестве потенциальных маркеров молочной продуктивности могут рассматриваться аллели генов молочных белков и гормонов. В последнее время все чаще ученые обращают внимание на исследование полиморфизма гена бета-казеина (CSN2) у крупного рогатого скота (КРС) и выявление связей между его генотипами и признаками продуктивности животных [2].
В связи с вышеизложенным, задачами проведенных исследований явились оценка частоты встречаемости аллелей и генотипов гена бета-казеина, определение эффективности его влияния на молочную продуктивность крупного рогатого скота белорусской черно-пестрой породы, а также изучение биохимических показателей крови исследуемой группы животных.
Материалы и методы исследования. Исследования были проведены в отраслевой лаборатории ДНК и клеточных технологий в растениеводстве и животноводстве на базе УО «Полесский государственный университет».
В качестве биологического материала использовали ткань (выщип уха) 100 животных белорусской черно-пестрой породы, разводимых в филиале ОАО «Лунинецкий молочный завод» Брестской области. В процессе отработки режимов использовался свежий материал.
Лабораторно адаптирована амплификация в обьеме 14,5 мкл реакционной смеси в составе: 100 нг выделенной ДНК; 3 мМ - Mg2+; 1,4 мМ - дНТФ (mix); 1Х - буфер (с KCl); 20
пМ - прямой праймер; 20 пМ - обратный праймер; 2,5 е.а. - тад-полимеразы; Н20 - до 14,5 мкл.
При подборе оптимальных условий было обращено особое внимание на экстрагирование ДНК, которое проводилось перхлорат-ным методом с двойной очисткой.
Для успешного проведения ПЦР были подобраны праймеры так, чтобы фрагмент между ними включал в себя сайты узнавания для А1 и А2 аллельных вариантов гена бета-казеина. Были использованы следующие последовательности прямого (Б) и обратного (Я) праймеров:
(Б): С8ГО: 5'-
алатсалстаслалттттсллслтслат алалатслаассста- з';
(Я): С8ГО: 5' -
сстаслаллттстлатстлтсссттссст ааассслтса - з'.
Проведение реакции амплификации по гену бета-казеина (С8№) проводили на автоматическом термоциклере (амплификато-ре) типа Вюшейа используя следующую программу режима ПЦР: горячий старт - 940С -5 мин; денатурация - 940С - 1 мин; отжиг -650С - 1 мин; синтез - 720С - 1 мин (35 циклов); элонгация - 72 0С - 10 мин.
Концентрацию и специфичность ампли-фиката оценивали в 1,5%-ном агарозном геле при напряжении У=110 в течение 35 мин. Длина амплификационного фрагмента гена с8Ш - 251 п.н.
Для рестрикции амплификационного участка гена использовали эндонуклеа-
зу Тад1. Рестрикцию проводили в термостате при температуре 370С в течение 1,5 часа. Детекцию результатов рестрикции проводили в 3%-ном агарозном геле, У=130, 60 мин. При расщеплении продуктов амплификации по гену идентифицировались следующие
генотипы:
с§шА2А2 - фрагмент 251 п. н.; с§шА1А2 - фрагменты 251, 213 п.н.; с§шА1А1 - фрагменты 213, 38 п.н. (рисунок).
60 54 99 39 86 36 79 L L 100 37 93 16 1 58 13 42
Рисунок - Электрофореграмма фрагментов рестрикции участка гена CSN2
Примечание - 1, 2, 3, 5, 6, 7, 11, 12, 14, 15, 16, 17, 18 - генотипы A2A2 (251 п.н.); 4, 8, 13 - генотипы А1А2 (251 и 213 п.н.); 9 - размерный маркер 50 + bp DNA Ladder; 10 - размерный маркер 100 bp DNA Ladder.
Визуализацию и анализ результатов осуществляли с помощью системы гель-документирования Quantum.
Результаты и их обсуждение. В результате молекулярно-генетического тестирования животных белорусской черно-пестрой породы был выявлен полиморфизм гена бета-казеина CSN2 и исследовано его влияние на молочную продуктивность.
Анализ полиморфизма 100 исследуемых животных по гену бета-казеина CSN2 показал, что в стаде большинство животных (76%) являются носителями генотипа CS^^2, 17% - CS^^2 и только 7% -CS^^^. Частота встречаемости аллелей CSN2M и CSN2M составила 0,845 и 0,155 соответственно.
Результаты по молочной продуктивности коров за 305 дней лактации показали, что наибольшая величина удоя молока отмеча-
лась у коров с С8ША1/А2(5488,8±506,57 кг) и С8ША2/А2(5084,3±131,86 кг) генотипами. При этом гомозиготные коровы по аллели С8№А1 отставали по удою от гетерозиготных особей (С8ША1/А2), разница составила более 1450 кг молока (Р<0,01). По качественному составу молока (белок и жир) коровы разных генотипов различались незначительно (таблица 1).
Одним из важных качественных показателей физиологического состояния животных и их здоровья является состав крови. По данным биохимических показателей крови можно судить об интенсивности обменных процессов, следовательно, об уровне молочной продуктивности животных. Нами получены результаты биохимических показателей крови у исследуемых групп животных различных по генотипам гена бета-казеина (С8№), позволяющие дать общую оценку состояния их организма (таблица 2).
Таблица 1. - Показатели качества молока животных белорусской черно-пестрой породы, дифференцированных по генотипам гена С8К2
генотип голов, n жир, % белок, % мочевина, % удой за 305 дней, кг
CS^^1 7 4,03±0,329** 3,97±0,133* 23,43±1,9** 4030±605,05**
CS^^2 17 4,15±0,185** 3,92±0,098* 25,41±1,57** 5488,80±5 06,57**
CS^^2 76 4,43±0,074** 3,86±0,042* 22,30±0,069** 5084,30±130,86**
Примечание - *Р<0,05; **Р<0,01
Таблица 2. - Результаты биохимических исследований крови
Показатель Ед. изм. Норма I группа А1А1 II группа А1А2 III группа А2А2
Общий белок г/л 72-86 82,66±3,35 85,62±2,65 79,44±6,39
Креатинин мкмоль/л 62,0-97,0 75,94±8,85 77,1±3,23 82,96±9,94
Мочевина ммоль/л 3,0-5,6 4,14±0,36 3,86±0,37 4,26±0,25
Общий билирубин мкмоль/л 1,7-5,1 4,86±0,11 4,04±0,36 4,04±0,45
АлТ Ед/л 7-35 25,68±10,82 25,86±3,23 35,58±5,82
АсТ Ед/л 45-80 83,28±22,98 73,52±10,38 67,80±7,29
Щелочная фосфатаза Ед/л 55-80 66,66±7,90 81,96±6,78 82,08±12,98
Кальций ммоль/л 2,5-3,1 2,99±0,07 2,74±0,17 2,90±0,08
Магний ммоль/л 0,9-1,5 1,22±0,07 1,30±0,06 1,07±0,09
Фосфор ммоль/л 1,4-1,9 1,74±0,10 1,56±0,12 1,72±0,07
Общий холестерин ммоль/л 4,5-6,0 4,56±0,55 4,64±0,07 4,38±0,07
Глюкоза ммоль/л 2,0-2,7 2,78±0,18 2,86±0,15 2,88±0,08
Уровень общего белка в сыворотке крови исследуемых животных варьировал от 79,44 до 85,62 г/л. Из полученных данных видно, что наибольший показатель содержания уровня белка отмечался у животных с гетерозиготным генотипом (с8№А1/А285,62±2,65 г/л (99,55%)), что на 3,4 п.п. больше, чем у сверстников с гомозиготным генотипом по аллелю А1, и на 7,1 п.п. больше, чем у животных с гомозиготным генотипом по алле-лю А2.
Креатинин в крови у исследуемой группы животных белорусской черно-пестрой породы находился в верхних пределах физиологической нормы. Наибольшее содержание креатина в крови отмечалось у КРС третьей группы (с8ША2А2 82,96±9,94 мкмоль/л (85,52%)), что на 3,4 п.п. больше, чем у сверстников второй группы. Показатели кре-атинина у животных первой группы имели наименьший показатель, однако находились в пределах нормы.
По содержанию мочевины в крови показатели варьировали от 3,86 до 4,26 ммоль/л. Наибольшее содержание мочевины в крови наблюдается у животных с гомозиготным генотипом по аллелю А2 (с8К2А2А2 (4,26±0,25ммоль/л).
Уровень общего билирубина в крови у исследуемых групп животных белорусской черно-пестрой породы варьировал от 4,04 до 4,86 мкмоль/л в пределах нормы. Наименьший показатель содержания билирубина в крови отмечался у животных с гетерозиготным генотипом (с8ША1/А2(4,04±0,36мкмоль/л (79,21%)) и гомозиготным генотипом по аллелю А2 (с8ША2/А2(4,04±0,45 мкмоль/л (79,21%)), что
на 16,08 п.п. меньше, чем у сверстников первой группы.
Содержание аланинаминотрансферазы (АлТ) в крови исследуемых животных находилось в пределах нормы, однако показатели АлТ животных с гомозиготным генотипом по аллелю А2 превосходили своих сверстников с альтернативными генотипами и составили 35,58±5,82 Ед/л.
Содержание траснсаминазы (АсТ) в крови исследуемых животных белорусской черно-пестрой породы варьировало в интервале от 67,8 до 83,28 Е/л. Сравнивая животных с различными генотипам гена бета-казеина (с8№) можно отметить, что наибольший показатель содержания транссаминазы отмечался у животных с гомозиготным генотипом по аллелю А1 (с8ША1/А1(83,28±22,98)), коровы же с гомозиготным генотипом по аллелю А2 (с8ША2/А2(67,80±7,29)) и гетерозиготным генотипом (с8ША1/А2(73,52±10,38)) находились в пределах нормы.
Уровень щелочной фосфотазы у исследуемых коров варьировал от 66,66 до 82,08 Ед/л и находился в пределах нормы. Наибольший показатель содержания уровня щелочной фосфотазы отмечался у животных с гомозиготным генотипом по аллелю А2 (с8№А2/А2 (82,08±12,98)) и гетерозиготным генотипом с8ША1/А2(81,96±6,78). Показатели щелочной фосфотазы у группы животных с гомозиготным генотипом по аллелю А1 были значительно ниже, чем у сверстников с альтернативными генотипами, но находились в пределах нормы.
По содержанию кальция в сыворотке крови выявлены незначительные колебания от 2,74 до 2,99 ммоль/л. Сравнивания содержа-
ние кальция в крови у КРС белорусской черно-пестрой породы, можно отметить, что наибольшее содержание отмечалось у коров с гомозиготным генотипом по аллелю А1 (С8ША1/А1(2,99±0,07)) и гомозиготным генотипом по аллелю А2 (С8ША2/А2(2,90±0,08)), в то время как показатели кальция у сверстников с гетерозиготным генотипом были ниже, но находились в пределах нормы.
Уровень магния в крови исследуемых животных белорусской-черной пестрой породы находился в норме. Наибольший показатель уровня магния отмечался у коров с гетерозиготным генотипом (С8ША1/А2 (1,30±0,06)) и гомозиготным генотипом по аллелю А1 (С8ША1/А1(1,22±0,07)).
Содержание фосфора в крови у всех исследуемых животных находилось в пределах нормы и составило 1,56-1,74 ммоль/л.
Уровень общего холестерина в сыворотке крови исследуемой группы животных варьировал от 4,38 до 4,64 ммоль/л. Сравнивая животных с различным генотипам гена бета-казеина (С8№) можно отметить, что наименьший показатель содержания уровня холестерина отмечался у животных с гомозиготным генотипом по аллелю А2 (С8К2А2/А2 (4,38±0,07 ммоль/л), в то время как у групп животных с альтернативными генотипами показатели общего холестерина были выше, но находились в пределах нормы.
Содержание глюкозы в крови у всех исследуемых групп животных с различными генотипами по гену бета-казеина (С8№) варьировало от 2,78 до 2,88 ммоль/л, что незначительно превышает норму.
Заключение.
1. Проведена ДНК-диагностика трех генотипов, сформированных нормальным Р-СКА2 и мутантным Р-СКА1 аллелями. Показана встречаемость генотипов и аллелей в локусе бета-казеина у исследованных коров белорусской черно-пестрой породы, наиболее широко разводимой в условиях Беларуси. Выявлена необходимость осуществления строгого генетического контроля используемого генетического материала в этой области.
2. Выявлена ассоциация полиморфизма гена с молочной продуктивностью крупного рогатого скота белорусской черно-пестрой породы. Результаты по молочной продуктивности коров за 305 дней лактации показали, что наибольшая величина удоя молока отмечалась у коров с С8ША1/А2 и С8№А2/А2 генотипами. При этом гомозигот-
ные коровы по аллели CSN2^ отставали по удою от своих сверстников с альтернативными генотипами на 1450 и 1050 кг соответственно.
3. Достоверных различий между генотипами гена CSN2 по биохимическим показателям сыворотки крови у исследуемой группы животных не обнаружено. В целом, содержание изученных компонентов в сыворотке крови соответствует физиологическим нормам, что свидетельствует о высоком уровне приспособления животных к изменяющимся внешним условиям (кормление, содержание, климат).
Список литературы
1. Валитов, Ф. Р. Полиморфизм гена бета-казеина коров плановых пород Республики Башкортостан / Ф. Р. Валитов, Л. Ф. Давлетова // Аграрная наука в инновационном развитии АПК: материалы Международной научно-практической конференции в рамках XXVI Международной специализированной выставки «Агроком-плекс-2016». - Ч. II. - Уфа, 2016. - С. 2730.
2. Иргашев, Т. А. Гематологические показатели бычков разных генотипов в горных условиях Таджикистана / Т. А. Иргашев, В. И. Косилов // Известия Оренбургского государственного аграрного университета. - 2014. - № 1 (45). - С. 89-91.
3. Kaminski, S. Polymorphism of bovine beta-casein and its potential effect on human health / S. Kaminski, A. Cieslinska, E. Kostyra // J. Appl. Genet. - 2007. - № 48. -P.189-198.
References
1. Valitov F.R., Davletova L.F. Polimorfizm gena beta-kazeina korov planovykh porod Respubliki Bashkortostan [Polymorphism of the beta-casein gene of planned cows in the Republic of Bashkortostan]. Agrarnaya nau-ka v innovaczi-onnom razvitii APK [Agrarian science in the innovative development of the agro-industrial complex: materials of the International scientific and practical conference in the framework of the XXVI International specialized exhibition «Agrocomplex -2016»]. Part II. Ufa, 2016, pp. 27-30. (In Russian)
2. Irgashev TA, Kosilov V.I. Gematologicheskie pokazateli bychkov raznykh genotipov v gornykh usloviyakh Tadzhikistana [Hemato-logical indicators of bulls of different geno-
types in mountainous conditions of Tajikistan]. Izvestiya Orenburgskogo gosudar-stvennogo agrarnogo universiteta [Bulletin of the Orenburg State Agrarian University]. 2014, no. 1 (45), pp. 89-91. (In Russian)
3. Kaminski S., A. Cieslinska, E. Kostyra Polymorphism of bovine beta-casein and its potential effect on human health. J. Appl. Genet. 2007, no. 48,pp. 189-198.
Received 1 April 2021
