CC BY
101
Генный перенос в опухолевые клетки с помощью новых комплексов кардиолипиноподобных дикатионных липидов и плазмидной ДНК
Р.И. Жданов 12, А.А. Московцев 2■3, Д.Ю. Блохин 3, А.Н. Дойникова 1,
Р.И. Шакирова 1, ЮЛ. Себякин 4
1 Казанский (Приволжский) федеральный университет, Казань
2 НИИ общей патологии и патофизиологии РАМН, Москва
3 Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина PAMH, Москва
4 Московский государственный университет тонких химических технологий, Москва
Gene transfer using new complexes between cardiolipin-like dicationic lipids and plasmid DNA to tumor cells
R.I. Zhdanov1-2, A.A. Moskovtsev23, D.Yu. Blokhin 3, A.N. Doynikova 1, R.I. Shakirova 1, Yu.L. Sebyakin 4
1 Kazan (Volga region) Federal University, Kazan
2 Institute General Pathology and Pathophysiology of RAMS, Moscow
3 Blokhin Russian Cancer Research Center of RAMS, Moscow
4 Moscow State University of Fine Chemical Technology, Moscow
Липидные везикулы бисамфифилов кардиолипиноподобных дикатионных липидов (КДЛ) I-IV исследованы для получения липоплексов с плазмидными ДНК разных размеров для генного переноса в целях генотерапии. Размеры (300±100 нм) и стабильность (> 2 ч) липоплексов КДЛ оказались достаточны для использования в переносе генов в монослойные и суспензионные культуры клеток. Общая цитотоксичность по МТТ-тесту КДЛ оказалась ниже, чем у контрольной группы (липофектин). Оптимизированы условия трансфекции линий опухолевых клеток липоплексами бисамфифилов КДЛ и плазмидных ДНК. Наиболее эффективной трансфекция для липоплексов «КДЛ — плазмидная ДНК» оказалась при соотношении липид-ДНК (L/D) равном 5 (для липофектина при 2). Для монослойных культур клеток липоплексы КДЛ-I сравнимы по эффективности трансфекции с липофектином, а в случае суспензионной культуры их эффективность на 50% ниже. Это позволяет использовать их в качестве медиаторов для переноса генетических конструкций в опухолевые клетки человека.
Ключевые слова: дикатионные липиды, липофекция, репортерные гены, генный перенос, культуры клеток.
The lipid vesicles of bisamphiphiles cardiolipin-like dicationic lipids (CDL) I-IV were studied for creation of lipoplexes with plasmid DNA of different sizes to obtain stable lipoplexes for gene transfer to gene therapy. Lipoplexes’ sizes (300± 100nm) and stablity (> 2 hrs) of CDL were sufficient to be used in gene transfer against monolayer and suspension cell cultures. The CDL total cytotoxicity determined by MTT-test was lower compare to lipofectin as a control. Transfection conditions against tumor cells lines were optimized by lipoplexes of CDL and plasmid DNA. The most efficient transfection for lipoplexes CDL-plasmid DNA was at the lipid-DNA (L/D) ratio equal to 5 (for lipofectin, it was 2). For monolayer cell cultures, lipoplexes CDL-I are comparable in terms of transfection efficacy with lipofectin; in the case of suspension culture, their efficiency was lower by one order of magnitude. It permits a usage of lipoplexes suggested as mediators for gene transfer and delivery to human tumor cells.
Key words: dicationic lipids, lipofection, reporter gene, gene transfer, cell culture.
Одной из наиболее распространенных невирусных систем переноса терапевтических генов в целях генотерапии являются катионные (фосфо)липидные везикулы (липосомы) [1—4]. ДНК спонтанно связывается с катионными липосомами, нейтрализуя свой отрицательный заряд, а образующиеся при этом комплексы — липоплексы — взаимодействуют с клеточной мембраной, интернализуются в клетку [5, 6]. Таким способом — липофекцией — могут быть трансфицированы большинство клеточных линий. Наиболее важен для интернализации липоплексов (гено-сом) в клетку процесс адсорбционного эндоцитоза [7, 8]. В экспериментах in vitro показано, что чем больше размер геносом (200—400 нм), тем выше эффективность трансфекции. Для экспериментов in vivo имеет место обратная ситуация [9—11]. Необходимо, чтобы липоплексы были стабильны в биологических средах, поскольку нестабильность комплексов
e-mail: zrenad@gmail.com
in vivo могла бы приводить к закупорке капилляров. Возрастающий интерес к активности липоплексов на основе дикатионных поверхностных агентов обусловлен их необычными физико-химическими свойствами, отличающимися от мономерных аналогов [12-14].
Целью работы являлось создание липоплексов на основе бисамфифилов кардиолипиноподобных дикатионных липидов (КДЛ) и плазмидной ДНК, анализ их размеров и стабильности, а также эффективности генного переноса в монослойные и суспезионную культуры клеток. Описанные в работе липидные везикулы и липоплексы характеризовались устойчивостью к агрегации, субмикронными размерами и относительной нетоксичностью КДЛ в экспериментах in vitro, что позволит использовать их для переноса терапевтических генов в опухолевые клетки человека. Трансфекция линий клеток 293, MCF7 и Jurkat
липоплексами КДЛ достаточна эффективна и зависит от длины алифатического спейсера катионных бисамфифилов, определяющего морфологию липо-плексов.
Материал и методы
Все использованные в работе реагенты были химически чистые или чистые для анализа, растворители — свежеперегнанные, а вода — деионизованная, чистоты милли-Q.
КДЛ синтезированы как описано ранее [15] и их строение подтверждено совокупностью данных элементного анализа, 1Н-ЯМР- и ИК-спектроскопии, а также масс-спектрометрии.
НззС1бОСО(СИ2)^ (CH2)2COOC16H33
I С С I
I + 1+1
Н33С16ОСОСН—N+—(СН2)т—№^-СНСООС16Н33
г I I г
1 СН3 СН3г
Рис. 1. Структурные формулы
синтезированных бисамфифилов
[N,N'-бис[1,4-дигексадецил-N,N'-диметил-L-
глутамил)1,т-алкандииодиды),
где m = 3 [I), 7 [II), 11 [III) или 22 [IV) в зависимости
от типа КДЛ
Культуры клеток. Исследования проводились in vitro на культурах клеток MCF7, HEK293 и Jurkat. Клетки получены из Российской коллекции культур клеток позвоночных (Институт цитологии РАН). Все клетки паспортизованы, прошли контроль видовой специфичности (во всех случаях проведен кариоти-пический анализ) и контроль контаминации (бактерии, грибы и микоплазма не обнаружены) [16, 17].
Плазмидные ДНК pCMV-SPORT-ß-gGal (7,2 kb) и pEGFP-N1 (4,7 kb) (обе — под контролем immediate early CMV promoter) наращивались в препаративном количестве в культуре Echerichia coli, были очищены и проанализированы согласно общепринятым протоколам [18].
Липосомы. Липидные везикулы получали согласно стандартным протоколам [2, 19]. Липиды КДЛ I-IV растворяли в хлороформе, липидную пленку получали выпариванием растворителя в роторном испарителе, затем сушили в вакууме. Далее ее снимали добавлением в колбу испарителя 130 мМ раствора NaCl при встряхивании на вортексе. К полученной суспензии больших мультиламеллярных ли-посом применяли последовательно диспергирование на ультразвуковой бане (Avanti Polar Lipids) 10 мин при 60°С и экструзию (экструдер LiposoFast, Avestin) через поликарбонатные фильтры 100—400 нм при 50°С. Устойчивость и размеры везикул определяли методом динамического лазерного светорассеяния, (ДЛС) на приборе NICOMP 380 (Submicron Particle Sizer Nicomp Model 370, Santa Barbara, USA), оборудованном He-Ne лазером с длиной волны 632,8 нм.
Липоплексы. Комплексы ДНК:липид получали смешиванием растворов ДНК и везикул КДЛ I-IV с весовыми соотношениями 1:0,5; 1:1; 1:2,5;1:5; 1:7,5; 1:10 с последующей 30 мин. инкубацией. Комплексы ДНК: LipofectinR (Invitrogen, США) готовили согласно инструкции производителя с теми же весовыми соотношениями [2].
Культуры клеток и определение цитотоксичности липидов. Адгезионные клетки MCF7, HEK293 культивировали в среде DMEM (Gibco TM Invitrogen Corporation, США) c 10% FBS (Gibco TM Invitrogen Corporation, США) в атмосфере 5% СО2, суспензионные Jurkat — RPMI (Gibco TM Invitrogen Corporation, США) c 10% FBS (Gibco TM Invitrogen Corporation, США) в атмосфере 5% СО2. Цитотоксичность ли-посом КДЛ, LipofectinR и всех видов липоплексов, а также чистых плазмидных ДНК определяли с помощью MTT-теста [2, 16, 20].
Трансфекция. Свежеприготовленные липоплексы добавляли к клеткам в бессывороточной среде без антибиотиков и инкубировали в стандартных условиях культивирования в течение 2 ч. После этого клетки отмывали от липоплексов и среду заменяли на полную ростовую. Эффективность трансфекции оценивали с помощью световой и флуоресцентной микроскопии (в случае pEGFP-N1 и pCMV-SPORT-P-gal) с последующим цифровым анализом изображений с помощью программ Image Pro Plus (Media Cybernetics, США), а также посредством проточной цитометрии (pEGFP-N1) через 24 ч после липофекции по экспрессии репортерных белков и количественно рассчитывали как долю клеток, экспрессирующих ген к общему числу клеток в процентах [2, 19].
Проточная цитометрия. Для подсчета трансфицированных клеток использовали метод проточной цитометрии (pEGFP-N1) через 24 ч после липофекции по экспрессии репортерных белков. Эффективность трансфекции рассчитывали как долю клеток, экспрессирующих ген, к общему числу клеток в процентах. Анализ клеточных суспензий осуществлялся на проточном цитометре «Partec Pas» (Partec, Германия), оснащенном лазером с длиной волны 488 нм [2, 16].
Результаты и обсуждение
Химический дизайн и синтез КДЛ был проведен в МИТХТ с использованием блоков на основе пальмитоил-производных глутаминовой кислоты с заместителями при атомах азота [15]. Характерными особенностями химического строения молекул таких бисамфифилов являются гидрофобная часть, две четвертичные аммониевые группы, а также алифатический мостик (спейсер), соединяющий эти две полярные группы (рис. 1). Физико-химические свойства этих бисамфифилов являются перспективными для направленного формирования липоплексов в целях генного переноса в клетки-мишени [21].
Анализ размеров липидных везикул КДЛ I-IV и морфологии их липоплексов. В результате исследования размеров везикул обнаружено, что везикулы как КДЛ, так и DOTMA-DOPE (контроль) относительно устойчивы во времени в условиях полярного растворителя (вода) и постоянства pH (7,4), поддерживаемого буферной системой PBS при 37°C. Везикулы сохраняли свои размеры 50—70 нм (DOTME-DOPE) или 300±100 (КДЛ) в течение достаточно длительного времени (6 ч). Липоплексы КДЛ III и IV и pEGFP-N1 агрегировали с неравновесной кинетикой, приведшей к большим размерам и значительной ошибке определения. Катионный димер КДЛ II образовывал с плазмидной ДНК pEGFP-N1 две фракции липоплексов с исходными размерами 210 и 360 нм, последняя агрегировала интенсивнее. Полидисперсность размеров была выше у липоплексов, чем у
липосомных препаратов. Липоплексы КДЛ-1 и II характеризуются достаточной устойчивостью (> 2 ч) и имеют заряд, близкий к нейтральному.
Методом атомно-силовой микроскопии изучена пространственная структура комплексов, образующихся при смешении катионных липосом на основе димерных амфифилов с ДНК (данные не представлены). Так, для липоплексов катионных липосом КДЛ-1 со спейсером т = 3 основной геометрической формой являлся тороид, тогда как для липоплексов КДЛ-11 со спейсером т = 7 реализуется стержневидная структура, хотя присутствовало небольшое количество сферических частиц [21].
Цитотоксичность катионных димеров КДЛ. Общая низкая токсичность комплексов «катионный липид — плазмидная ДНК» является одним из основных условий использования в протоколах генной терапии [5, 9]. Для определения общей цитотоксичности КДЛ был использован МТТ-тест [20]. МТТ-тест был проведен на клетках НЕК293, MCF7, Juгkat в двух временных интервалах — 12 и 24 ч для диапазона концентраций КДЛ, верхний предел которого более чем в 10 раз превышает рабочую концентрацию липидов (данные не представлены). Показано, что общая цитотоксичность КДЛ достоверно ниже, чем у липо-фектина; в диапазоне концентраций и при временах экспозиции, соответствующих условиям трансфекции, токсичность всех соединений незначительна, что делает возможным их применение в качестве агентов для переноса генов [16].
Эффективность трансфекции клеточных культур. Преимуществом невирусных систем трансфекции по сравнению с вирусными является, в частности, отсутствие жестких ограничений на размер генетических конструкций, что делает возможным применение сравнительно больших и сложных плазмидных ДНК. Для исследования влияния на эффективность транс-
фекции размеров КДЛ и генетических конструкций и оценки возможности применения их липоплексов использовали два вида репортерных систем: а) основанная на экспрессии в трансфицированных клетках фермента ß-галактозидазы, идентифицируемой по хромогенной реакции с субстратом X-Gal; и б) основанная на экспрессии в транфицированных клетках мутантной формы зеленого флуоресцентного белка с оптимизированными спектральными свойствами (EGFP). Плазмидные ДНК перед образованием липоплексов находились преимущественно в суперскру-ченной форме (электрофоретическая подвижность).
В оценке эффективности трансфекции методами светлопольной и флуоресцентной микроскопии с прямым подсчетом клеток, экспрессирующих ре-портерный ген, статистически достоверных отличий между репортерными системами обнаружено не было (табл. 1). Наиболее эффективной трансфекция для липоплексов КДЛ-pEGFP-NI оказалась при соотношении липид/ДНК (L/D) равном 5, для DOTMA-DOPE/pEGFP-N1 — при 2. Для данных генетических конструкций влияния их размеров на эффективность трансфекции не выявлено. Доля трансфицированных клеток для липоплексов КДЛ I, II, III и IV была в случае монослойных культур MCF7 (39,20; 21,20; 3,27; и 1,52) и HEK293 (40,23; 25,40; 1,91; и 1,98), соответственно (табл. 1). В случае липофектина эта величина была 40,12 и 43,32 для MCF7 и HEK293, соответственно. Эффективность липоплексов в случае суспензионной культуры Jurkat была на порядок ниже (2,23 у КДЛ-I и 1,78 у КДЛ-II), как для липофектина (4,12). Наибольшая трансфицирующая способность была отмечена у липоплексов КДЛ-I в адгезионных культурах MCF7 и HEK293. Для суспензионной культуры Jurkat ни одна из предложенных невирусных систем не оказалась эффективной.
Таблица 1. Оценка эффективности трансфекции липоплексами с помощью светлопольной (pCMV-SPORT-|J>-gall и флуоресцентной микроскопии (pEGFP-N1)
Липид % трансфицированных клеток
MCF7 HEK293 Jurkat WT
КДЛ-I, с. м. 30,43 31,21 2,1
КДЛ-I, ф. м. 35,13 42,72 3,2
КДЛ-II, с. м. 18,24 27,12 0,5
КДЛ-II, ф. м. 16,12 20,45 1,2
КДЛ-III, с. м. 0,93 0,51 0
КДЛ-III, ф. м. 1,31 1,27 0
КДЛ-IV с. м. 0,12 0,23 0
КДЛ-IV, ф. м. 0,54 1,43 0
DOTMA-DOPE, с. м. 30,51 45,11 3,3
DOTMA-DOPE, ф. м. 38,72 37,28 5,2
Примечание: с. м. — светлопольная микроскопия; ф. м. — флуоресцентная микроскопия.
Метод проточной цитометрии по флуоресценции EGFP с применением репортерной системы pEGFP-N1 был использован для определения различий в эффективности трансфекции среди катионных липидов (КДЛ 1-М и йОТМА/йОРЕ) и между клеточными культурами (MCF7, НЕК293, Juгkat). Наиболь-
шая эффективность трансфекции была отмечена нами у липоплексов на основе КДЛ-1 и липофек-тина на культурах клеток MCF-7 («39% для КДЛ-1) и НЕК293 («40% для КДЛ-1). Для суспензионной культуры Juгkat ни одна из изученных невирусных систем не оказалась эффективной (рис. 2).
Рис. 2. Анализ эффективности трансфекции липоплексами КДЛ I-IV и липофектина в культуры клеток MCF-7, HEK293, Jurkat методом проточной цитофлуориметрии: ось Y - число клеток [counts], ось Х - время [логарифм, FL-I stain], поле RN-1 - число трансфицированных клеток.
HEK293: А - контроль; Б - КДЛ-I; В - КДЛ-II; Г - КДЛ-III; Д - КДЛ-IV; Е - DOTMA-DOPE; MCF7:
Ж - контроль; З - КДЛ-I; И - КДЛ-II; К - КДЛ-III; Л - КДЛ-IV; М - DOTMA-DOPE
Выводы
1. Размеры (300±100 нм) и стабильность (> 2 ч) липоплексов КДЛ оказались достаточны для использования в переносе генов против монослойных и суспензионных клеточных культур. Общая цитотоксичность липидов КДЛ по МТТ-тесту оказалась ниже, чем у контольной группы (липофектин).
2. Оптимизированы условия трансфекции линий опухолевых клеток липоплексами бисамфифилов КДЛ и плазмидных ДНК. Для монослойных культур клеток липоплексы КДЛ I сравнимы по эффективности трансфекции с липофектином, а в случае суспензионной культуры их эффективность значительно ниже.
Благодарности
Работа выполнена при поддержке грантов Института экспериментальной диагностики и терапии РОНЦ им. Н.Н. Блохина, Москва и Минобрнауки РФ (КФУ № 12-26; РФФИ 12-03-97089-р_поволжье_а). Авторы благодарят академика РАМН А.А. Кубатиева за поддержку проекта и помощь в выполнении работы. Дикатионные липиды КДЛ синтезированы и охарактеризованы в МИТХТ им. М.В. Ломоносова, Москва под руководством профессора Ю.Л. Себякина.
ЛИТЕРАТУРА:
1. Feigner P.L., Gadek T.R., Holm M. et al. Lipofectin: a highly efficient lipid-mediated DNA transfection procedure. PNAS USA 1987; 84: 7413-7.
2. Zhdanov R.I., Bogdanenko E.V., Moskovtsev A.A. et al. Liposomemediated gene delivery: dependence on lipid structure, glycolipid mediated targeting, and immunological properties. In: Duzgunes N., editor. Methods in Enzymol. Liposomes. Part C: Gene Transfer and Therapy: Elsevier. 2003; 373: 433-65.
3. Жданов Р.И., Хусаинова Р.С., Иваницкий Г.Р. и др. Невирусные векторы в генной терапии. Новый подход в липофекции. Вопросы Биол. Мед. Фарм. Химии. 2000; 1: 10-17.
4. Duzgunes N. de Ilarduya C., Simoes S. et al. Cationic liposomes for gene delivery: novel cationic lipids and enhancement by proteins and peptides. Curr. Med. Chem. 2003; 10(14): 1213-20.
5. Zhdanov R.I., Podobed O.V., Vlassov V.V. Cationic lipid-DNA complexes - lipoplexes-for gene transfer and therapy. Bioelectrochem. 2002; 58(1): 53-64.
6. Akinc A., Anderson D.G., Lynn D.M. et al. Synthesis of poly(beta-amino ester)s optimized for highly effective gene delivery. Bioconjug. Chem. 2003; 14(5): 979-88.
7. Zabner J., Fasbender A.J., Moninger T. et al. Cellular and molecular barriers to gene transfer by a cationic lipids. J. Biol. Chem. 1995; 270(18): 18997-9007.
8. Wrobel I., Collins D. Fusion of cationic liposomes with mammalian cells occurs after endocytosis. Biochim Biophys Acta. 1995; 1235(2): 296-304.
9. Lasic D.D. Liposomes in gene delivery. NY: CRC Press, Boca Raton; 1997.
10. Leong K.W., Mao H.Q., Truong-Le V.L. et al. DNA-polycation nanospheres as non-viral gene delivery vehicles. J. Control. Release. 1998; 53(1-3): 183-93.
11. Ravi Kumar M.N., Bakowsky U., Lehr C.M. Preparation and characterization of cationic PLGA nanospheres as DNA carriers. Biomaterials 2004; 25(10): 1771-7.
12. Templeton N.S., Lasic D.D., Frederik P.M. et al. Improved DNA: liposome complexes for increased systemic delivery and gene expression. Nature Biotechnology 1997; 15: 647—52.
13. Menger F.M., Keiper J.S. Gemini surfactants. Angew. Chem. Int. Ed. 2000; 39: 1906-20.
14. Hattori T., Adachi K., Shizuri Y. New ceramide from marine sponge Haliclona koremella and related compounds as antifouling substances against macroalgae. J. Nat. Prod. 1998; 61: 823-6.
15. Полякова А.А., Панченкова И.А., Скрипникова М.А. и др. Мембранообразующие свойства димерных катионных амфифи-лов на основе L-глутаминовой кислоты. Биологические мембраны 2003; 20(2): 178-83.
16. Московцев А.А. Индукция гибели опухолевых клеток человека новой невирусной системой на основе дикатионных липидов, гена тимидинкиназы HVS-tk и ганцикловира [диссертация]. Москва: НИИОПП РАМН; 2007.
17. Соколовская А.А., Заботина Т.Н., Блохин Д.Ю. и др. СD95-дефицитные клетки сублинии Jurkat/A4, устойчивые к лекарственно-индуцированному апоптозу. Экспер. Онкология 2001; 23: 175-80.
18. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование Методы генетической инженерии. Москва: Мир; 1984.
19. Mozafari M.R., Flanagan J., Zhu X. et al. Sample protocols for the preparation and characterisation of lipid vesicles In: Mozafari M.R., Mortazavi S.M., editors. Nanoliposomes: From fundamentals to recent developments. Oxford: Trafford Publishing Ltd; 2005. p. 125-45.
20. Niks M., Otto M. Towards an optimized MTT assay. J. Immunol. Meth. 1990; 130(1): 149-51.
21. Жданов Р.И., ЭльКади А., Московцев А.А. и др. Зависимость активности генного переноса липоплексами на основе новых дикатионных липидов от их строения. Докл. Акад. наук 2004; 398(1): 118-21.
Поступила 12.08.2012
