CC BY
58
Эффективность и механизм противоопухолевой активности липоплексов кардиолипиноподобного липида и гена тимидинкиназы HSV-tk в присутствие ганцикловира
А.А. Московцев 1, А.А. Соколовская1, М.Я. Ибрагимова 2, А.Н. Дойникова 2,
ЮЛ. Себякин 3, Р.И. Жданов 12
1 НИИ общей патологии и патофизиологии РАМН, Москва
2 Казанский (Приволжский) федеральный университет, Казань
3 Московский государственный университет тонких химических технологий, Москва
Efficiency and mechanism of antitumor activity of cardiolipin-like lipid/thymidine kinase gene HSV-tk lipoplexes in the presence of gancyclovir
A.A. Moskovtsev1, A.A. Sokolovskaya 1, M.Ya. Ibragimova 2, A.N. Dojnikova 2, U.L. Sebyakin 3, R.I. Zhdanov1-2
1 SRI General Pathology and Pathophysiology of RAMS, Moscow
2 Kazan (Volga region) Federal University, Kazan
3 Moscow State University of Fine Chemical Technology, Moscow
Система тимидинкиназы вируса простого герпеса/ ганцикловир (HSV-tk/GCV] исследована в составе липоплексов на основе дикатионного кардиолипиноподобного липида КДЛ-I. Она предложена в качестве невирусной системы для использования в протоколах генотерапии онкологических заболеваний. Ранее на культурах опухолевых клеток MCF7 и HEC293 была показана эффективная трансфекция клеток этими бисамфифилами. Невирусная система на основе липоплекса дикатионного КДЛ-I/HSV-tk и ганцикловира эффективно вызывает гибель опухолевых клеток с вовлечением ключевых стадий апоптоза. Деполяризация митохондриальной мембраны обнаружена также при использовании липоплексов дикатионного липида КДЛ-I в экспрессирующих тимидинкиназу клетках в ответ на ганцикловир и активацию фактора NF-kB. Предполагается раннее вовлечение митохондриального пути апоптоза также и в механизм действия «суицидальных» липоплексов дикатионного липида.
Ключевые слова: генотерапия, онкологические заболевания, апоптоз, дикатионные липиды, невирусные системы, ген тимидинкиназы вируса простого герпеса первого типа, ганцикловир.
The herpes simplex virus thymidine kinase/gancyclovir (HSV-tk/GCV.) system is studied as cytotoxic lipoplex based on cardiolipin-like dicationic lipid CDL-I. It is proposed to be used as nonviral gene transfer system in cancer gene therapy protocols. An efficient transfection of MCF7 and HEC293 cell lines with this lipoplex was earlier demonstrated. Non-viral system based on the CDL-I/HSV-tk lipoplex and ganciclovir treatment causes efficiently death of tumor cells with an involvement of apoptosis key stages. It was proved that depolarization of mitochondrial membrane and increased level of NF-kB transcription factor take place as a response to CDL-I / HSV-tk lipoplex action followed by gancyclovir treatment. It suggests an early involvement of apoptosis mitochondrial way to an action of this certain «suicide» system, delivered using dicationic lipid.
Key words: cancer gene therapy, apoptosis, dicationic lipids, non-viral of gene transfer systems, «suicide» herpes simplex virus thymidine kinase gene system, gancyclovir, NF-kB transcription factor.
В последние годы предпринимаются успешные попытки восстановить нормальное функциональное состояние ткани при патогенезе методами генной терапии [1—4]. Возрастающее внимание уделяется использованию в протоколах генотерапии невирусных систем трансфекции, которые, по сравнению с вирусными системами, не имеют жестких ограничений размера генетических конструкций [5—9]. В частности, при первом использовании невирусного переноса генов in vivo у человека с помощью липосом DC-Chol: DOPE с геном HLA B7 у всех исследуемых пациентов с меланомой была обнаружена экспрессия этого гена [10]. Недостатком всех невирусных методов переноса генов является непродолжительное время экспрессии, невысокая эффективность, ограниченная эндосомно-лизосомальной деградацией, а также отсутствие тканеспецифичности [5, 8].
e-mail: zrenad@gmail.com
Среди клеточных реакций, участвующих в ингибировании опухолеобразования, одной из наиболее изучаемых и важных клеточной реакцией в настоящее время является апоптоз [11]. Система тимидинки-наза вируса простого герпеса первого типа / ганцикловир (HSV-tk/GCV) («suicide gene»), применяемая в ряде клинических протоколов генной терапии, способна запускать в клетках опухоли процессы, приводящие к их гибели, среди которых важное место занимает апоптоз [12—17]. Целью работы является оценка эффективности и исследование механизма противоопухолевого действия нового липоплекса на основе дикатионного кардиолипиноподобного липида КДЛ-I и плазмиды pUT649, кодирующей ген HSV-tk, после применения ганцикловира на линиях опухолевых клеток по сравнению с липоплексами на основе монокатионных липидов.
Материал и методы
Кардиолипиноподобный дикатионный липид КДЛ-I синтезирован, как описано ранее [18], и его строение подтверждено совокупностью данных элементного анализа, 1Н-ЯМР- и ИК-спектроскопии, а также масс-спектрометрии. Структура кардиолипиноподобного липида — КДЛ-I (m = 3) приведена в нашей предыдущей работе [19].
Культуры клеток. Исследования проводились in vitro на культурах клеток MCF-7 и HEK293. Клетки получены из Российской коллекции культур клеток позвоночных (Институт цитологии РАН). Все клетки паспортизованы, прошли контроль видовой специфичности (во всех случаях проведен карио-типический анализ) и контроль контаминации (бактерии, грибы и микоплазма не обнаружены) [17]. Клетки культивировали на среде DMEM с 10% FBS (GibcoTM Invitrogen Corporation) в атмосфере 5% СО2. MCF-7 и HEK293 снимали с культуральных матрасов и пересаживали в 96-луночную плашку с исходной плотностью 104 клетки на лунку в ростовую среду [7].
Трансфекция. Через 24 ч культуру клеток (96-луночная плашка, плотность 104 клетки/лунку, DMEM и 10% FBS) промывали бессывороточной средой и добавляли липоплексы в бессывороточной среде. Клетки инкубировали 6 часов при 37°С и 5% СО2, затем среду заменяли на полную ростовую. Для трансфекции использовали липоплексы на основе кардиолипиноподобного дикатионного липида КДЛ-I и плазмиды pUT649 с геном тимидинкиназы HSV-tk (Cayla, ZI Montaudran — BP4437, France), полученные как описано ранее [17].
В качестве контроля в исследованиях трансфекции использовали Lipofectin®Reagent (смесь катионных липидов DOTMA и DOPE, w/w 1:1, Invitrogen Corporation, U.S.A.). Для индукции гибели трансфицированных HSV-tk позитивных клеток добавляли противовирусный препарат ганцикловир. Селекцию трансфицированных клеток проводили с помощью антибиотика Zeocin (Cayla, France — InVivoGen, USA.) с постепенным увеличением его концентрации до 100 мкг/мл. Продолжительность селекции была в среднем 3,5 нед.
Регистрация экспрессии гена HSV-tk клетками методом RT-PCR. На первом этапе из клеток MCF-7 и HEK293 выделяли тотальную РНК (наборы «MBI Fermentas», Вильнюс, Литва). Экспрессия мРНК генa HSV-tk тимидинкиназы вируса простого герпеса первого типа была подтверждена с помощью RT-PCR с применением пары праймеров (sense: 5' GCTGCTTGCAATACGGTGCG-3'; antisense: 5' CGCAGATCGTCGGTATGGAGCC-3').
Получение и цифровой анализ видеоизображений флуоресцентной и конфокальной микроскопии. Статическую, цейтраферную микросъемку производили на флуоресцентном микроскопе Zeiss Axioskop 20 с помощью видеосистемы на базе цветной интегрирующей 3-х матричной (3CCD) камеры Sony, видеозахват и оцифровку — с помощью фреймграббера Matrox Meteor [7]. Конфокальную лазерную сканирующую микроскопию выполняли на инвертированном микроскопе Nikon Eclipse TE 2000, оснащенном контрастом Хоффмана и конфокальным модулем C1 с лазерами 488 и 543 нм. Для цифровой обработки изображений использовалось программное обеспечение KS100 (Zeiss), MS Office 2010, Ulead Media
Studio, Image Pro Plus (Media Cybernetics), для трехмерной реконструкции — EZ-C1 v2.30 (Nikon). Детекция деполяризации митохондриальной мембраны производилась с помощью зонда JC-1 как описано ранее [20, 21].
Активация фактора транскрипции NF-kB (p65). Определение активации транскрипционного фактора NF-kB (p65) в ответ на действие системы HSV-tk производили с помощью методики и тест-системы NoShift Transcription Factor Assay Kit (EMD Biosciences, Inc, an affiliate of Merck KGaA, Germany) как описано ранее [22]. Технология обеспечивает быструю и чувствительную детекцию транскрипционных факторов или других белков, связывающихся с ДНК и основан на колориметрии в планшете. Активированные ДНК-связывающие белки локализуются в ядре клеток, поэтому для анализа экстрагировали белки ядра клеток с помощью NucBuster Protein Extraction Kit (EMD Millipore Bioscience).
Статистическая обработка результатов производилась с помощью программного обеспечения Statistics ver.6.0 (StatSoft Inc, U.S.A.), а также Microsoft Excel. Использовались однофакторный дисперсионный анализ и критерий Крускала-Уоллиса. Различия считались достоверными при p < 0,05.
Результаты и обсуждение
Цитотоксическое действие комплекса «КДЛ-I — pUT649/GCV». Цитотоксическое действие комплекса «КДЛ-I — pUT649/GCV» спустя 48 ч. после добавления в среду культивации ганцикловира было зарегистрировано нами с помощью МТТ-теста. Оно заключалось в существенном уменьшении количества жизнеспособных клеток как MCF7, так и HEK293. Была отмечена корреляция концентрации ганцикловира с выраженностью цитотоксического эффекта: доля выживших клеток уменьшалась с увеличением GCV от 0,1 к 1,0 и до 5 мкг/мл: для MCF7 доля 42,03; 28,45; и 24,76%., и для HEK293 — 61,10; 35,23; и 29,01%. Высокий процент клеточной гибели (до 75% для MCF7 и до 71% для НЕК293) на фоне сравнительно невысокой эффективности трансфекции, возможно, обусловлен так называемым эффектом летального соседства (bystander effect), характерным для «суицидной» системы HSV-tk/GCV [13, 16].
Экспрессия мРНК тимидинкиназы вируса простого герпеса первого типа. Селекция трансфицированных pUT649 клеток с целью обогащения популяции HSV-tk -положительными клетками стала возможна благодаря тому, что продукт экспрессии представляет собой рекомбинантный белок — тимидин-киназу, конъюгированную с продуктом экспрессии Sh ble гена (375 п.о.) — небольшим белком — Sh ble protein (м.м. 13665 Дa), обладающим высокой афинностью к антибиотикам флеомицинового ряда (в частности, Zeocin) и тем самым сообщающим устойчивость трансфицированным клеткам. Экспрессия гена HSV-tk была подтверждена нами методом RT-PCR с применением пары праймеров: -sense: 5'GCTGCTTGCAATACGGTGCG3'; -antisense:
5'CGCAGATCGTCGGTATGGAGCC-3'. Для обеих культур клеток MCF7 и HEK293, трансфицированных геном HSV-tk, была зарегистрирована полоса на электро-фореграмме размером 368 п.о. Это свидетельствует об экспрессии мРНК гена тимидинкиназы вируса простого герпеса первого типа (ее не было в контрольных клетках без HSV-tk/GCV).
Рис. 1. HSV-tk-позитивные (опыт) и HSV-tk-негативные клетки MCF7 через 6, 12 и 24 ч. после добавления в среду ганцикловира (БШ):
А, Б, В - HSV-tk-негативные клетки (1контроль), без Б^, 0 ч;
Г, Д, Е) HSV-tk-негативные клетки (2 контроль), с Б^, 24 ч;
Ж, З, И - HSV-tk-позитивные клетки (опыт), с Б^, 6 ч;
К, Л, М - HSV-tk-позитивные клетки (опыт), с Б^, 12 ч;
Н, О, П - HSV-tk-позитивные клетки (опыт), с Б^, 24 ч.
Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия.
Гистограммы яркости соотношения красный/зеленый канал.
Окраска потенциалозависимым, тропным к митохондриям красителем иС-1
Кинетика деполяризации митохондриальной мембраны при действии системы HSV-tk/GCV. Деполяризация митохондриальной мембраны свидетельствует о вовлечении митохондрий в индуцированный повреждением каскад клеточных реакций [22]. Для проверки, имеет ли она место в случае системы ли-поплекса дикатионного липида КДЛ-I/HSV-tk, а не только для липоплексов монокатионных липидов, использовали конфокальную лазерную сканирующую микроскопию клеток MCF7, прошедших селекцию как HSV-tk позитивных и обработанных ганцикловиром, так и контрольных, нетрансфицированных. Для детекции трансмембранного потенциала митохондриальной мембраны использовали флуоресцентный краситель JC-1, обладающий высоким сродством к митохондриям и способностью к спектральному сдвигу эмиссии с 527 нм в мономерной форме (зеленая флуоресценция) при снижении потенциала и деполяризации до 59O нм (оранжево-красная) при образовании J-агрегатов (рис. А—П). Полученные данные позволяют утверждать, что в ответ на действие системы дикатионного липида и гена HSV-tk в клетках MCF7 развивается деполяризация мито-
хондриальной мембраны, начиная с 6 часов после начала инкубации с ганцикловиром (рис. А—И). Из данных рисунка, а именно: значительного усиления зеленого окрашивания от поля К к полю Н — следует, что в ответ на действие системы HSV-tk в клетках MCF7 имеет место деполяризация митохондриальной мембраны спустя 24 ч после начала инкубации с ганцикловиром. Это говорит о вовлечении митохондриального каскада в цепь событий, являющихся реакцией клетки на действие системы HSV-tk/GCV.
Определение активации транскрипционного фактора NF-kB (p65). В клетках MCF7 при действии системы HSV-tk/GCV спустя 24 ч после добавления ганцикловира в среду культивации было обнаружено также повышение содержания фактора транскрипции NF-kB. Это определялось по увеличению оптической плотности (табл.). Первые 4 строки являются контролями: без ганцикловира отличий нет. В его присутствии содержание фактора NF-kB возрастает в 3—4 раза как в присутствии специфических и неспецифических полинуклеотидов, конкурентно взаимодействующих с фактором.
Таблица 1. Содержание транскрипционного фактора NF-kB при действии системы HSV-tk/GCV в культуре клеток MCF7 (по сравнению с контрольным воздействием Н2О2), оптическая плотность, относит. единицы
Варианты опыта Контроль HSV-tk
контроль, без обработок 0,1+0,05 0,23+0,07
30 мкМ Н2О2, 90 мин 1,43+0,24 1,56+0,17
30 мкМ Н2О2, 90 мин, ННкП эквимолярно 1,55+0,30 1,42+0,30
30 мкМ Н2О2, 90 мин, СНкП эквимолярно 0,62+0,11 0,53+0,18
HSV-tk/GCV, 3 часа 0,27+0,11 0,87+0,15
HSV-tk/GCV, ННкП эквимолярно 0,19+0,08 0,82+0,21
HSV-tk/GCV, СНкП эквимолярно 0,08+0,05 0,34+0,18
Приложение: ННКП—неспецифическая нуклеотидная конкурентная последовательность, СНКП—специфическая к ЫР-кВ нуклеотидная конкурентная последовательность.
Таким образом, обнаруженные клеточные ответы в виде деполяризации митохондриальной мембраны и активации NF-kB позволяют предположить комплексное действие системы HSV-tk/GCV, индуцирующее каскад реакций, ведущий к клеточной гибели. Помимо классического р53-опосредован-ного пути в ответ на повреждение ДНК, имеющего место при действии HSV-tk [12—16], можно предположить подключение дополнительных стимулов, например, связанных с возможным нарушением репарации ядерной ДНК, синтеза митохондриальной ДНК (ядерно-митохондриальное взаимодействие). Каждый из этих сигналов может быть подпороговым и недостаточным для принятия клеткой решения о самоубийстве, но интегральной суммы сигналов может хватить для исполнения апоптоза [17, 18]. С этой точки зрения повреждение ядерной ДНК может являться основной (но не единственной) причиной апоптоза. Известно, что транскрипционный фактор NFkB влияет на регуляцию апоптоза
по нескольким механизмам [22]. Предполагается, что ЫРкВ кооперирует с р53, регулируя некоторые гены, необходимые для индукции апоптоза, в частности, рецептор клеточной смерти KILLER/DR5 [22]. Этот факт свидетельствует о неспецифическом модулировании этим транскрипционным фактором апоптотического каскада, так как значительное количество промоторов содержит сайты связывания с ЫР-кВ.
Выводы
1. Предложенная новая невирусная система на основе дикатионного липида КДЛ-1, HSVtk и ганцикловира эффективно вызывает гибель опухолевых клеток с вовлечением ключевых стадий апоптоза.
2. В случае генного переноса липоплексом на основе дикатионного липида обнаружена деполяризация митохондриальной мембраны и повышенный уровень фактора ЫР-кВ в экспрессирующих тимидин-киназу клетках в ответ на ганцикловир.
Благодарности
Работа выполнена при поддержке грантов Института экспериментальной диагностики и терапии РОНЦ им. Н.Н. Блохина, Москва и Минобрнауки РФ (КФУ № 12-26; РФФИ 12-03-97089-р_поволжье_а). Авторы благодарят академика РАМН А.А. Кубатиева
ЛИТЕРАТУРА:
1. Anderson W.F. Human gene therapy. Science 1992; 256: 808-13.
2. Lewis R. The Forever fix: Gene therapy and the boy who saved it. N.Y.: St. Martin's press; 2012.
3. Жданов Р.И., Семенова Н.В., Арчаков А.И. Реальности и надежды генной терапии. Специальный выпуск журнала «Вопросы мед. химии» под редакцией А.И. Арчакова и Р.И. Жданова, посвященный вопросам генного переноса и генотерапии. 2000; 3: 197-206.
4. Северин Е.С., Жданов Р.И., редакторы. Специальный выпуск журнала «Вопр. Биол. Мед. Фарм. Химии», посвященный проблемам генного переноса и генотерапии; 1999.
5. Жданов Р.И., Куценко Н.Г., Федченко В.И. Невирусные методы переноса генов в генной терапии. Вопр. Мед. Химии. 1997; 43 (1): 3-11.
6. Duzgunes N., Ilarduya С., Simoes S. et al. Cationic liposomes for gene delivery: novel cationic Llipids and enhancement by proteins and peptides; Curr. Med. Chem. 2003; 10(14): 1213-20.
7. Zhdanov R.I., Bogdanenko E.V., Moskovtsev A.A. et al. Liposomemediated gene delivery: dependence on lipid structure, glycolipid mediated targeting, and immunological properties. In: Duzgunes N., editor. Methods in Enzymol. Liposomes. Part C: Gene Transfer and Therapy. Elsevier; 2003; 373: 433-65.
8. Zhdanov R.I., Podobed O.V., Vlassov V.V. Cationic lipid-DNA complexes - lipoplexes-for gene transfer and therapy. Bioelectrochem. 2002; 58(1): 53-64.
9. Daniels A., Noor-Mahomed N., Singh M. et al. Cytofectin amine head group modification and degree of liposome pegylation: factors influencing gene transfer. Indian J. Pharm Sci. 2011; 73(4): 381-86.
10. Lasic D.D. Liposomes in gene delivery. Boca Raton: CRC Press; 1997.
11. Заридзе Д.Г. редактор. Канцерогенез. Москва: Медицина; 2004.
12. Tang Q., Zhang D., Wan M. et al. Experimental study of the RV-HSV-TK/GCV suicide gene therapy system in gastric cancer. Cancer Biother. Radiopharm. 2007; 22(6): 755-61.
за поддержку проекта и помощь в выполнении работы и профессора Д.Ю. Блохина (РОНЦ РАМН, Москва) — за помощь и обсуждение результатов. Дикатионный липид КДЛ-1 синтезирован и охарактеризован в МИТХТ им. М.В. Ломоносова, Москва под руководством профессора Ю.Л. Себякина.
13. Craperi D., Vicat J.M., Nissou M.F. et al. Increased bax expression is associated with cell death induced by gancyclovir in a herpes thymidine kinase gene-expressing glioma cell line. Hum. Gene Ther. 1999; 10(4): 679-88.
14. Huang Q., Pu P., Xia Z. et al. Exogenous wt-p53 enhances the antitumor effect of HSV-TK/GCV on C6 glioma cells. J Neurooncol. 2007; 82(3): 239-48.
15. Tang Y., Li J., Zhao S. et al. Killing effect of the herpes simplex virus thymidine kinase/ganciclovir enzyme/prodrug system on human nasopharyngeal carcinoma cells. J. Int. Med. Res. 2007; 35(4): 433-41.
16. Shibata M.A., Horiguchi T., Morimoto J. et al. Massive apoptotic cell death in chemically induced rat urinary bladder carcinomas following in situ HSVtk electrogene transfer. J. Gene Med. 2003; 5(3): 219-31.
17. Московцев А.А. Индукция гибели опухолевых клеток человека новой невирусной системой на основе дикатионных липидов, гена тимидинкиназы HVS-tk и ганцикловира [диссертация]. Москва: НИИОПП РАМН; 2007.
18. Полякова А.А., Панченкова И.А., Скрипникова М.А. и др. Мембранообразующие свойства димерных катионных амфифи-лов на основе L-глутаминовой кислоты. Биологические мембраны 2003; 20(2): 178-83.
19. Жданов Р.И., Московцев А.А., Блохин Д.Ю. и др. Генный перенос в опухолевые клетки с помощью новых комплексов кардио-липиноподобных дикатионных липидов и плазмидной ДНК. Клеточная Трансплантология и Тканевая Инженерия 2012; 7(3): в печати.
20. Smiley S.T., Reers M., Mottola-Hartshom C. et al. Intracellular heterogeneity in mitochondrial membrane potentials revealed by J-aggregate-forming lipophilic cation JC-1. pNAS USA 1991; 88: 3671-75.
21. Соколовская А.А., Заботина Т.Н., Московцев А.А. и др. Характеристика методов детекции апоптоза и их использование в экспериментальной и клинической онкологии. Рос. Биотерап. Ж. 2003; 2 (3): 53-60.
22. Tergaonkar V., Pando M., Vafa O. et al. p53 stabilization is decreased upon NFkB activation: A role for NFkB in acquisition of resistance to chemotherapy. Cancer Cell. 2002; 1(5): 493-503.
Поступила 09.08.2012
