46 JOURNAL OF MICROBIOLOGY, EPIDEMIOLOGY AND IMMUNOBIOLOGY. 2021; 98(1)
DOI: https://doi.org/10.36233/0372-9311-29
ORIGINAL RESEARCHES
Научная статья
https://doi.org/10.36233/0372-9311-29 ► Check for updates
Генетическое типирование штаммов Vibrio cholerae биовара El Tor, выделенных на территории Кавказа в период 1970-1998 гг., с применением MLVA-5 и wgSNP
Ковалев Д.А.Н, Шапаков Н.А., Писаренко С.В., Савельева И.В., Васильева О.В., Савельев В.Н., Сирица Ю.В., Жиров А.М., Ульшина Д.В., Кузнецова И.В., Бобрышева О.В., Куличенко А.Н.
Ставропольский противочумный институт, Ставрополь, Россия
Аннотация
Цель. Филогенетический анализ штаммов Vibrio cholerae O1 биовара El Tor, выделенных в разные годы на территории Кавказа, с использованием мультилокусного анализа числа вариабельных тандемных повторов (MLVA) и полногеномного анализа распределения единичных нуклеотидных полиморфизмов (wgSNP). Материалы и методы. Объектами исследования служили геномные последовательности 16 клинических штаммов V. cholerae O1 биовара El Tor из коллекции Ставропольского противочумного института, выделенных на территории Кавказа с 1970 по 1998 г, а также 87 полногеномных последовательностей V. cholerae из базы данных NCBI. MLVA проводили по 5 VNTR-локусам. Полногеномное секвенирование осуществляли на платформе «Ion Torrent PGM».
Результаты. Исследуемые штаммы относятся к 15 MLVA-типам и делятся на 3 группы в составе одного кластера. Осуществлен анализ структуры основных островов вирулентности и патогенности, а также нуклеотидных полиморфизмов в генах ctxB, tcpA и RstR. Проведен филогенетический анализ штаммов на основе wgSNP-типирования, описаны SNP, специфичные для каждой филогенетической группы. Заключение. Установлено поликлональное происхождение генетически измененных вариантов V. cholerae O1 биовара El Tor. Определено место штаммов V. cholerae биовара El Tor, выделенных с 1970 по 1998 г на территории Кавказа, в глобальной популяции возбудителя. Показано, что в указанный период на территории Кавказа циркулировали штаммы, принадлежащие к 1-й и 2-й волнам 7-й пандемии холеры. Подтверждено, что случаи холеры на Кавказе являются завозными с территории эндемичных стран, определены наиболее вероятные источники инфекции.
Ключевые слова: полногеномное секвенирование, филогенетический анализ, Vibrio cholerae, MLVA, wgSNP
Для цитирования: Ковалев Д.А., Шапаков Н.А., Писаренко С.В., Савельева И.В., Васильева О.В., Савельев В.Н., Сирица Ю.В., Жиров А.М., Ульшина Д.В., Кузнецова И.В., Бобрышева О.В., Куличенко А.Н. Генетическое типирование штаммов Vibrio cholerae биовара El Tor, выделенных на территории Кавказа в период 1970-1998 гг., с применением MLVA-5 и wgSNP. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2021; 98(1): 46-58. https://doi.org/10.36233/0372-9311-29
Original article
https://doi.org/10.36233/0372-9311-29
Genetic typing of Vibrio cholerae strains biovar El Tor isolated from the Caucasus region during the 1970-1998 period using MLVA-5 and wgSNP
Dmitry A. Kovalev®, Nikolay A. Shapakov, Sergey V. Pisarenko, Irina V. Savel'eva, Oksana V. Vasil'eva, Vilory N. Savel'ev, Yulia V. Siritsa, Andrey M. Zhirov, Diana V. Ul'shina, Irina V. Kuznetsova, Olga V. Bobrysheva, Aleksandr N. Kulichenko
Stavropol Plague Control Research Institute, Stavropol, Russia
Abstract
Aim. Our aim was to perform phylogenetic analysis of Vibrio cholerae O1 El Tor biovar strains, isolated from the Caucasus region over the years, using MLVA and wgSNP methods.
© Коллектив авторов, 2021
ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
Materials and methods. We studied genomic sequences of 16 clinical V. cholerae O1 strains of El Tor biovar isolated on the territory of Caucasus from 1970 to 1998. These strains were obtained from the State Collection of Pathogenic Microorganisms of Stavropol Plague Control Research Institute. 87 whole genome sequences of V. cholerae strains, obtained from NCBI database, were also included in the analysis. MLVA-typing was carried out at 5 VNTR-loci. Whole genome sequencing was performed on Ion Torrent PGM platform. Results. We determined that the studied strains belong to 15 MLVA-types and are divided in 3 groups of 1 cluster. We performed an analysis of the structure of the main virulence and pathogenicity islands, as well as nucleotide polymorphisms in ctxB, tcpA, RstR genes. We performed a wgSNP-based phylogenetic analysis of the strains, and described SNPs, specific for each phylogenetic group.
Conclusion. We confirmed the polyclonal origin of genetically modified variants of V. cholerae O1 biovar El Tor. We determined the place of V. cholerae strains of biovar El Tor, isolated from 1970 to 1998 on the territory of the Caucasus, in the global population of the pathogen. It is shown that during this period, strains belonging to the first and second waves of the seventh cholera pandemic circulated within the Caucasus. It was confirmed that cases of cholera in the Caucasus were imported from the territory of endemic countries, and the most probable sources of infection were identified.
Keywords: whole genome sequencing, phylogenetic analysis, Vibrio cholerae, MLVA, wgSNP
For citation: Kovalev D.A., Shapakov N.A., Pisarenko S.V., Savel'eva I.V., Vasil'eva O.V., Savel'ev V.N., Siritsa Yu.V., Zhirov A.M., Ul'shina D.V., Kuznecova I.V., Bobrysheva O.V., Kulichenko A.N. Genetic typing of Vibrio cholerae strains biovar El Tor isolated from the Caucasus region during the 1970-1998 period using MLVA-5 and wgSNP. Journal of microbiology, epidemiology and immunobiology = Zhurnal mikrobiologii, epidemiologii i immunobiologii. 2021;98(1): 46-58. https://doi.org/10.36233/0372-9311-29
Введение
Возбудитель холеры (V cholerae O1, ctxA+) вызывает особо опасное острое инфекционное заболевание. Эпидемиологический надзор за холерой осуществляется в соответствии с Международными медико-санитарными правилами [1]. Согласно принятой классификации внутри вида V. cholerae выделяют 3 эпидемически опасных варианта: холерные вибрионы серогруппы О1 (биовары classical и El Tor) и О139.
Исторически выделяют 7 пандемий холеры: возбудителем первых шести считается V. cholerae классического биовара, но с 1961 г. произошла смена биовара на El Tor, явившийся причиной 7-й пандемии, продолжающейся до настоящего времени. Начиная с 1991 г. по всему миру распространились генетически измененные высокопатогенные генова-рианты V. cholerae О1 биовара El Tor [2, 3].
Вспышки холеры, вызванные заносом инфекции, неоднократно фиксировались на территории Кавказа. Так, с начала 1970-х гг. в данном регионе было зарегистрировано несколько вспышек и эпидемий холеры: в 1970 г. — в Республике Дагестан, в 1985-1989 гг. — в Азербайджане, в 1990 г. — в Ставрополе, в 1994-1998 гг. — в Республике Дагестан [4-6].
Современные молекулярно-генетические методы исследования позволяют ретроспективно охарактеризовать геном штаммов возбудителя инфекции, вызвавших случаи заболевания холерой на различных территориях.
В последние годы для определения степени родства групп или отдельных штаммов V. cholerae [7-9] и типирования изолятов, выделенных как от людей во время вспышек, так и из объектов окружающей среды [10-12], широко применяется метод
мультилокусного анализа числа вариабельных тан-демных повторов (MLVA).
Один из актуальных методов генотипирования V. cholerae — определение единичных нуклеотид-ных полиморфизмов (SNP). При этом максимальную разрешающую способность демонстрирует полногеномный анализ распределения единичных нуклеотидных полиморфизмов (wgSNP) [13-17].
Безусловный научный интерес представляет изучение филогенетической принадлежности вариантов V. cholerae О1 биовара El Tor с последующим эволюционным и филогеографическим анализом.
Цель исследования — определение филогенетической принадлежности штаммов V. cholerae О1 биовара El Tor, выделенных в разные годы на территории Кавказа.
Материалы и методы
В работе исследованы геномные последовательности 16 штаммов V. cholerae О1 биовара El Tor из коллекции Ставропольского противочумного института, которые были изолированы из клинического материала во время эпидемических вспышек холеры на территории Кавказа с 1970 по 1998 г. Из них 7 — типичные V. cholerae биовара El Tor, выделенные в Республике Дагестан — 180Д (1970 г.); Азербайджане — 123Аз (1977 г.), 353Аз (1985 г.), 4017Аз (1989 г.); Ставрополе — С-347 (1980 г.), 454 (1990 г.); Краснодарском крае — 2278 (1987 г.). Остальные 9 — генетически измененные варианты V. cholerae биовара El Tor — выделены на территории Республики Дагестан — 157Д (1993 г.), 169Д (1993 г.), 1270Д (1994 г.), 17332 (1994 г.), 10213Д (1994 г.), 16241Д (1994 г.), 41Д (1998 г.); Краснодарского края — 286 (1994 г.); Ставропольского края — 8048 (1994 г.).
ORIGINAL RESEARCHES
MLVA-типирование. Для типирования исследуемых штаммов возбудителя холеры использовали предложенную ранее схему MLVA-5 [10]. Для экстракции ДНК применяли набор реагентов «GeneJET Genomic DNA Purification Kit» («Thermo Scientific»). С помощью специфических праймеров в ПЦР нарабатывали продукты амплификации по 5 локусам для каждого из 16 штаммов. ПЦР проводили с использованием амплификатора «Терцик» («ДНК-Технология»), анализ ампликонов — путем капиллярного электрофореза с помощью анализатора «ABI Prism 3500» («Applied Biosystems»). Для оценки вариабельности локусов исользовали индекс разнообразия Хантера-Гастона [18].
При проведении кластерного анализа в качестве группы сравнения использовали доступные MLVA-генотипы штаммов V. cholerae, выделенных в Индии, Бангладеш, на Гаити. Кластерный анализ на основе данных MLVA выполняли с использованием программного пакета «BioNumerics v7.6» («Applied Maths»). Минимальное остовное дерево было построено на основе количества тандемных повторов с использованием категориального коэффициента дистанции.
Полногеномное секвенирование. Подготовку геномных библиотек проводили с использованием набора «Ion Xpress Plus Fragment Library Kit» («Life Technologies»), моноклональную амплификацию выполняли на микросферах — набор «Ion OneTouch 400 Template Kit» («Life Technologies») в соответствии с протоколами производителя. Секвенирование геномов осуществляли на секвенаторе «Ion Torrent PGM» и чипах «Ion 316 Chips Kit v2» («Life Technologies»).
Анализ геномов штаммов V. cholerae. Оценку качества полученных прочтений проводили с помощью программы «FastQC v0.11.3» [19]. Прочтения, содержащие нуклеотиды с низким значением качества, были отфильтрованы в программе «Trimmomatic v0.33» [20]. Прочтения со средним значением качества Q <15 баллов, а также прочтения длиной <75 нуклеотидов были удалены. Сборку геномов проводили в программном обеспечении «Newbler v3.0» («Roche»). Качество сборки геномов оценивали с использованием программы «Quast 3.0» [21], геномную последовательность штамма V. cholerae O1 El Tor N16961 (GenBank: GCF_000006745.1) использовали для определения точности и эффективности сборки. Аннотацию геномов выполняли с помощью NCBI Prokaryotic Genome Annotation Pipeline.
Для описания филогенетического контекста исследуемых изолятов использовали 87 полногеномных последовательностей V. cholerae из общедоступной базы данных NCBI1.
Поиск SNP проводили в гомологичных регионах нуклеотидных последовательностей в онлайн-версии программы «REALPHY v1.10» [22]. Повторяющиеся и паралогичные последовательности были удалены в процессе множественного выравнивания с помощью алгоритма программы. Обнаруженные SNP были извлечены в файл VCF, после чего SNP, расположенные ближе чем 10 п.н. друг от друга, были отфильтрованы и удалены. Поиск SNP, отличающих близкородственные штаммы друг от друга, а также специфичных для отдельных групп штаммов, осуществляли среди SNP, прошедших фильтрацию с использованием собственных скриптов в программном обеспечении R.
Для филогенетической реконструкции на основе wgSNP-анализа штаммов V. cholerae применяли пакет программ «BEAST v2.3.0»2. Для определения параметров эволюционной модели тестировали 88 различных моделей замещения на матрице множественного выравнивания геномов (коровый геном) в программе «Jmodeltest2». Оптимальную модель нуклеотидных замен выбирали на основе значений байесовского информационного критерия.
Поиск генов, кодирующих факторы вирулентности, и генов устойчивости к антибактериальным препаратам, проводили при помощи программного обеспечения «ABRicate v.0.8.13»3.
Результаты
При анализе фенотипических свойств установлено, что исследуемые штаммы относятся к токси-генным и гемолизотрицательным. Штаммы, изолированные до 1993 г., способны лизироваться бактериофагами ХДФ 3, ХДФ 4, ХДФ 5 и El Tor. В то же время изоляты, выделенные позднее, не обладают указанным свойством.
Анализ полученных данных MLVA-5 позволил установить, что 16 штаммов V. cholerae биовара El Tor представлены 15 MLVA-типами (табл. 1). При этом 7 изученных типичных штаммов V. cholerae биовара El Tor принадлежат к 7 MLVA-типам, а 9 генетически измененных штаммов — к 8 различным MLVA-типам. Только 2 штамма геновариантов El Tor были отнесены к одному MLVA-типу (9-7-815-20): штамм 157Д, выделенный в 1993 г., и штамм 7332, выделенный в 1994 г. Это свидетельствует о заносе холеры из очага, существующего за пределами Республики Дагестан, в течение 2 лет. В целом полученные данные свидетельствуют о значительной вариабельности геномов обеих групп.
В результате проведенного MLVA-типирова-ния выявлены 3 аллели для локусов I хромосомы и 6-9 аллелей для II хромосомы. Индекс разнообразия Хантера-Гастона был >0,99. При этом для ло-
l National Center for Biotechnology Information. Available at: https://www.ncbi.nlm.nih.gov
2 URL: https://www.beast2.org
3 URL: https://github.com/tseemann/abricate
ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
Таблица 1. MLVA-профили штаммов V. ^olerae O1 биовара El Tor Table 1. MLVA profiles of V. ^olerae strains O1 biovar El Tor
№ No.
Штамм Strain
Число повторов в MLVA-локусе Number of repeats in the MLVA locus
Место и год I хромосома / I chromosome II хромосома / II chromosome
Location and year of isolation VC147 (белок FtsY) (protein FtsY) VC437 (межгенная область) (intergenic region) VC1650 (коллагеназа) (collagenase) VCA171 (гипотетический белок) (hypothetical protein) VCA283 (гипотетический белок) (hypothetical protein)
Республика Дагестан, 1970 Republic of Dagestan, 1970 9 6 7 15 26
Республика 10 7 7 18 28
180Д 180D
123A3 123Az
1Л
с
о
.5
>
та ш О
Азербайджан, 1977 Republic of Azerbaijan, 1977
353A3 353Az
4017АЗ 4017Az
С-347 C-347
454
a
■D I
0
S
a Ю s Ш
tu
1
a tu с
0
X tu
1
Республика 10
Азербайджан, 1985 Republic of Azerbaijan, 1985
Республика 10
Азербайджан, 1989 Republic of Azerbaijan, 1989
Ставрополь, 1980 9
Stavropol, 1980
Ставрополь, 1990 10
Stavropol, 1990
20
15
20
24
31
18
23
20
2278
Краснодар, 1987 Krasnodar, 1987
11
20
16
286
Краснодар, 1994 Krasnodar, 1994
15
21
1270Д 1270D
Республика Дагестан, 1994
Republic of Dagestan, 1994
10
15
22
10
157Д 157D
■a
о
E
>
Республика Дагестан, 1993
Republic of Dagestan, 1993
15
20
11
12
13
14
15
169Д 169D
8048
10213Д 10213D
16241Д 16241D
17332
ш с
tu О
i
re s CP re ш tu
i i
tu x
tu
г
м
Республика Дагестан, 1993
Republic of Dagestan, 1993
Кисловодск, 1994 Kislovodsk, 1994
Республика Дагестан, 1994
Republic of Dagestan, 1994
Республика Дагестан, 1994
Republic of Dagestan, 1994
Республика Дагестан, 1994
Republic of Dagestan, 1994
10
15
28
15
17
15
20
23
21
20
2
3
7
7
4
6
8
5
7
7
6
6
8
7
7
8
8
9
7
8
9
7
8
9
7
8
9
7
7
7
8
9
7
8
9
7
7
9
7
8
ORIGINAL RESEARCHES
Окончание табл. 1. End of Table 1.
Число повторов в MLVA-локусе Number of repeats in the MLVA locus
№ No. Штамм Strain Место и год I хромосома / I chromosome II хромосома / II chromosome
выделения Location and year of isolation VC147 (белок FtsY) (protein FtsY) VC437 (межгенная область) (intergenic region) VC1650 (коллагеназа) (collagenase) VCA171 (гипотетический белок) (hypothetical protein) VCA283 (гипотетический белок) (hypothetical protein)
16 41Д 41D Республика Дагестан, 1998 Republic of Dagestan, 1998 9 8 8 15 22
17 569B Индия, 1948 India, 1948 10 4 3 16 34
18 868 Индия, 1964 India, 1964 8 6 8 14 35
19 178 Индия, 2006 India, 2006 9 3 6 19 17
20 200 Индия, 2006 India, 2006 9 3 6 22 19
21 236 Индия, 2007 India, 2007 9 3 6 17 16
22 350 Индия, 2007 India, 2007 10 6 7 15 19
23 AR32732 Бангладеш, 2004 Bangladesh, 2004 9 3 6 22 12
24 MQ1795 Бангладеш, 2001 Bangladesh, 2001 9 3 6 16 11
25 MJ1236 Бангладеш, 1994 Bangladesh, 1994 8 7 8 12 19
26 MG116926 Бангладеш, 1991 Bangladesh, 1991 8 7 8 14 23
27 HC1037 Гаити, 2014 Haiti, 2014 7 3 6 14 8
кусов I хромосомы он варьировал в диапазоне 0,650,68, для локусов II хромосомы — 0,88-0,95, что свидетельствует об относительно высоком уровне стабильности первых хромосомных локусов. Полученные данные подтверждают результаты, описанные ранее [23-26].
Анализ построенной дендрограммы на основе MLVA-типирования по 5 вышеназванным локу-сам выявил деление всех штаммов на 2 кластера (рис. 1).
Первый кластер образован только генетически измененными штаммами, выделенными в Бангладеш в 2001 и 2004 гг. и в Индии в 2006 и 2007 гг. Сопоставление MLVA-генотипов указанных штаммов (табл. 1) показывает, что они различаются только по числу повторов 2 вариабельных локусов II хромосомы. При этом аллельные варианты VNTR
I хромосомы были идентичны (9-3-6), что говорит об общем происхождении изолятов. Также в этом субкластере отдельно расположен штамм из Гаити с аллельным профилем 7-3-4-14-8, что соответствует установленному происхождению холеры в Гаити из региона Непала [27]. Эти данные позволяют отметить продолжающиеся эволюционные изменения генома новых вариантов возбудителя холеры.
Во втором кластере можно выделить 3 группы: в первую вошли штаммы, выделенные в Республике Дагестан в 1970, 1993, 1994, 1998 гг., а также штаммы, изолированные в Краснодаре в 1987 и 1994 гг.
Вторую группу составили изоляты, выделенные в Республике Дагестан, Ставропольском крае (Кисловодск), Республике Азербайджан в 19891994 гг. Отдельное положение в группе занимает штамм 569В классического биотипа, выделенный в
ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
Рис. 1. Кластерный анализ на основе MLVA-типирования штаммов V. cholerae с использованием категориального коэффициента дистанции (программный пакет «BioNumerics v7.6»). Римскими цифрами обозначены основные кластеры, арабскими — субкластеры в структуре кластера II. Fig. 1. Cluster analysis based on MLVA typing of V. cholerae strains using the categorical distance coefficient
(BioNumerics v7.6).
Roman numerals indicate the main clusters, arabic numerals indicate the subclusters in the structure of cluster II.
Индии в 1948 г. Штаммы, выделенные в Республике Азербайджан в 1989 г. и в Ставропольском крае (Ставрополь) в 1990 г., являются типичными холерными вибрионами биовара El Tor и имеют сходные MLVA-профили (10-6-8-15-18/10-6-8-24-20), что подтверждает клональное происхождение штаммов. Близкородственность генетически измененного штамма 350 из Индии, выделенного в 2007 г., и типичного штамма V. cholerae биовара El Tor, изолированного в Республике Азербайджан в 1989 г., свидетельствует о том, что вариабельность MLVA-генотипов не ассоциирована с изменениями генома, приводящими к формированию гибридных вариантов биовара El Tor.
Третья группа: штаммы, выделенные в Республике Дагестан в 1994 г., в Индии в 1964 г., в Бангладеш в 1991 и 1994 гг., а также в Ставропольском крае (Ставрополь, 1980 г.). Относительно генетически измененного штамма, выделенного в Республике Дагестан в 1994 г., можно предположить его происхождение из Бангладеш. Этот факт подтверждается тем, что MLVA-генотип штамма отличается 2 локусами от штамма MG1236, выделенного в Бангладеш в 1991 г. Штаммы, изолированные на территории Республики Азербайджан в 1977 и 1985 гг. в 3-й группе, различаются по количеству повторов в 2 вариабельных локусах II хромосомы. В то же время аллельный вариант ло-
ORIGINAL RESEARCHES
кусов I хромосомы был идентичен (10-7-7/10-7-7), что позволило выделить их в отдельный кластерный комплекс.
В результате секвенирования de novo были получены незавершенные геномы со средним покрытием 76-105*, включающие от 91 до 169 контигов (>500 п.н.) Общий размер сборки геномов секве-нированных штаммов составил от 3 877 025 до 4 103 351 п.н. (табл. 2).
У каждого анализируемого штамма обнаружено 47 общих генов вирулентности, а также 2-7 гена устойчивости к антибактериальным препаратам (varG, dfrAl, catB9, aadAl, sull, sul2, floR, tet(A), aph(6)-ld и aph(3 '')-ld): карбапенемам, триметопри-му, хлорамфениколу, стрептомицину, сульфонами-дам, тетрациклинам.
Данные wgSNP позволили определить, что острова вирулентности (VPI-I и VPI-II) и патоген-ности (VSP-I и VSP-II), а также профаговая область CTX присутствуют в геномах всех исследуемых штаммов. При этом в структуре и нуклеотидных последовательностях данных областей установлены различия при сравнении с референсной последовательностью V. cholerae N16961.
Остров патогенности VPI-I всех исследуемых штаммов возбудителя холеры содержал несинони-
Таблица 2. Результаты полногеномного анализа Table 2. Results of genome-wide analysis
№ No. Штамм Strain Число контигов The number of contigs Длина генома, п.н. The length of genome, b.p. GC, % Всего генов Total number of genes GenBankID
1 180D 130 3906916 47,5 3666 GCA_004358215.1
2 123Az 120 3919566 47,5 3690 GCA_004358225.1
3 353Az 128 3953109 47,5 3660 GCA_009728505.1
4 4017Az 124 3907443 47,5 3594 GCA_009728295.1
5 С-347 125 3945425 47,5 3652 GCA_009728405.1
6 454 136 3893896 47,5 3572 GCA_009728525.1
7 2278 167 3877025 47,5 3544 GCA_009728225.1
8 157D 138 4078639 47,5 3843 GCA_004358245.1
9 169D 119 4102946 47,4 3936 GCA_003130485.1
10 1270D 133 4016316 47,5 3794 GCA_003130495.1
11 17332 144 4031067 47,4 3697 GCA_009728345.1
12 10213D 147 4020493 47,4 3487 GCA_003327445.1
13 16241D 141 4081404 47,5 3891 GCA_003130465.1
14 41D 140 4038688 47,5 3862 GCA_003130475.1
15 286 169 4068702 47,5 3802 GCA_004358285.1
16 8048 91 4103351 47,4 3823 GCA 009728375.1
мичную SNP в гене VC0817, кодирующем транспо-зазу, в позиции А937G.
При анализе структуры острова патогенности VSP-I показана его 100% гомология по всем ло-кусам с референсным геномом, кроме SNP в гене VC0180 (гипотетический белок) в позиции C1003T у всех генетически измененных штаммов. Данная мутация характерна исключительно для штаммов, выделенных после 1990 г.
Анализ структурной организации VSP-II (локусы VC0490-516) позволил установить наличие у штаммов 41D, 169D и 1270D общей де-леции, включающей ген VC513. При сравнении исследуемых геномов с референсным идентичность нуклеотидной последовательности VSP-II для указанных 3 штаммов составила 97,1-97,2 и 99,9% — для остальных штаммов. При этом у всех генетически измененных вариантов V. cholerae биовар El Tor отмечена SNP в позиции С526Т в гене VC496 (гипотетический белок). Кроме того, в геноме 7 штаммов из 10, выделенных в 1990-х гг., идентифицирована SNP в гене VC0513 в позиции Т71С (Helix-turn-helix transcriptional regulator — RstR). Следует отметить, что указанная мутация в гене VC0513 несинонимична и приводит к замене треонина на изолейцин.
Примечание. GC — доля гуанина (G) и цитозина (C) среди всех нуклеотидных остатков. Note. GC — the proportion of guanine (G) and cytosine (C) among all nucleotide residues.
ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
Последовательность острова VSP-II в геноме штамма V. cholerae 2278 (Краснодар, 1987 г.) содержит 34 SNP, в том числе 12 в составе гена VC494 (гипотетический белок), 7 — VC496 (гипотетический белок), 7 — VC498 (рибонуклеаза Н), 8 — VC506 (гипотетический белок).
Дальнейший анализ показал, что аллель гена ctxB субъединицы холерного токсина штаммов, выделенных в период с 1970 по 1990 г., принадлежит к типу El Tor (ctxB3). Для других штаммов выборки характерно наличие ранее описанных SNP в позициях 115 и 203 гена ctxB, соответствующих аллелю ctxBl [28].
Последовательность гена tcpA всех исследуемых штаммов была идентична и соответствовала референсному геному.
При сравнительном анализе структуры генов, кодирующих факторы патогенности, выявлен
ряд несинонимичных замен; в частности, в геноме штамма 157D в гене VC0983 (регуляторный белок ToxS) в позиции A117G; 2278 — VC0984 (белок-активатор холерного токсина) в позиции G410T; 454 — VC0984 (белок-активатор холерного токсина) в позиции G21T. У всех изучаемых генетически изменённых штаммов и 2 типичных V. cholerae O1 El Tor (454, 2278) идентифицирован SNP в гене VC1318 (белок наружной мембраны OmpV) в позиции G242T. Также ДНК штамма С-347 содержит SNP в кластере RTX гена VC1451, кодирующего RtxA, в позиции С1480Т.
Далее с целью определения филогенетических связей и регионов происхождения изолятов, выделенных на Кавказе, проведена филогенетическая реконструкция на основе wgSNP 103 геномов V. cholerae, изолированных в период 7-й пандемии (с 1937 по 2017 г.) на территории 23 стран (Аргентина, Бахрейн,
2
8
Рис. 2. Филогенетическое дерево на основе wgSNP-типирования штаммов V. cholerae, построенное с помощью «BEAST v2.3.0» с использованием строгих часов и модели замещения нуклеотидов GTR. Цветом и цифрами 1-11 обозначены филогенетические группы. Звездочкой отмечены штаммы, геномы которых были секвенированы в рамках данного исследования.
Fig. 2. Phylogenetic tree based on wgSNP typing of V. cholerae strains, constructed using BEAST v2.3.0 using strict clocks
and the GTR nucleotide substitution model. The color and numbers 1-11 indicate phylogenetic groups. Asterisk indicates the strains whose genomes were sequenced in this study.
ORIGINAL RESEARCHES
Бангладеш, Боливия, Китай, Колумбия, Джибути, Германия, Гаити, Индия, Индонезия, Кения, Мексика, Мозамбик, Перу, Филиппины, Россия, Южная Корея, Таиланд, Украина, США, Вьетнам).
Филогенетический анализ на основе wgSNP-типирования выявил деление изучаемых штаммов V. cholerae на 11 филогенетических групп (клад) (рис. 2).
К 1-й группе принадлежат штаммы классического V. cholerae, выделенные в постпериод 6-й пандемии холеры, содержащие на 2-й хромосоме 2 специфических SNP (921847 и 1024057). Данные штаммы по своим морфогенетическим свойствам соответствуют референсному штамму классического биотипа 0395 и выделены в США (1962, 1974, 2004, 2017 гг.), Южной Корее (2014, 2017 гг.), на Гаити (2012 г.), в Индии (1962, 1964, 1974 г), Индонезии (1937, 1957, 1961 г.), Китае (1962, 1964 гг.), Австралии (1977 г.).
Группа 2 включает штаммы V. cholerae El Tor ctxA+, ctxB3, изолированные в Мозамбике (1991 г.), Германии (1975 г.), Индии (1979 г.), Аргентине (1992, 1993 гг.), Мексике (1991 г.), Перу (1991, 1992 гг.), США (1992 г.), Колумбии (1992 г.), Боливии (1992 г.), содержащие специфические SNP на I и II хромосомах в позициях 775458 и 111100 соответственно. В эти годы завозов или заносов холеры из указанных стран на территорию Кавказа не зафиксировано.
Группа 3 представлена штаммами V. cholerae El Tor ctxA+, ctxB3, не содержащими специфические SNP и выделенными в Бангладеш (1971, 1979, 1987 гг.), Бахрейне (1978 г.), Кении (1985 г.). В эту же группу вошли штаммы, изолированные в Дагестане (1970 г.), Азербайджане (1977 г.), Ставропольском крае (1980 г.) и референсный штамм 16961, что свидетельствует о близком родстве данной группы штаммов, а также позволяет предполагать завоз холеры на Кавказ из перечисленных выше эндемичных по холере стран.
Группа 4 состоит из 2 штаммов V. cholerae El Tor — ctxA+, ctxB3, выделенных во Вьетнаме (1989 г.) и содержащих специфические полиморфизмы на I (4 SNP) и II (2 SNP) хромосомах. Штаммы V. cholerae, выделенные на территории Кавказа, с подобной характеристикой не обнаружены.
Группа 5 представлена 3 штаммами V. cho-lerae El Tor ctxA+, ctxB3, не содержащими специфические SNP, выделенными в Бангладеш (1987 г.), Индии (1980 г.), и филогенетически родственным им штаммом возбудителя холеры, обнаруженным в Сочи (Россия, 1987 г.), что было подтверждено при эпидемиологическом расследовании случая заражения туристки, прибывшей в Сочи из Бангладеш.
В группу 6 вошли штаммы V. cholerae El Tor ctxA+, ctxB3, содержащие специфические SNP на I и II хромосомах, выделенные как в Бангладеш (2013,
2014 гг.) и Индии (1992 г.), так и в Азербайджане (1989 г.) и Ставрополе (1990 г.), что свидетельствует о близком генетическом родстве данных микроорганизмов. Эпидемиологически подтвержден завоз в Азербайджан в 1989 г. и в Ставрополь в 1990 г. холеры, возбудитель которой имел генетические свойства V. cholerae, обнаруженных в Бангладеш и Индии.
Группа 7 представлена штаммами V. cholerae El Tor ctxA+, ctxB1, т.е. генетически измененными вариантами V. cholerae биовара El Tor, содержащими специфические SNP на I и II хромосомах, выделенными c 1995 по 2005 г. (2-я волна распространения 7-й пандемии холеры).
Группа 8 включает штаммы V. cholerae El Tor ctxA+, ctxB3, выделенные в Бангладеш и Индии в 1989-1991 гг., что свидетельствует о близком родстве с группой 3 штаммов V. cholerae El Tor сtxA+, ctxB3.
В состав групп 9-11 входят штаммы, изолированные в период с 2001 по 2017 г. и являющиеся представителями 3-й волны 7-й пандемии. Для штаммов группы 9, выделенных на территории Африки и Индийского полуострова (Кения, Джибути, Индия и Бангладеш), найдено 3 специфичных SNP.
Примечательно, что штаммы из группы 10 были выделены в основном на территории Индии в 1992-2007 гг., а штамм TSY216 — в Таиланде в 2010 г., что может свидетельствовать о заносе V. cholerae на территорию этой страны из Индии. Для штаммов указанной группы специфичных SNP не обнаружено.
Группа 11 состоит из штаммов, выделенных на территории Гаити, Китая, Бангладеш и Украины. Штаммы данной группы содержат 2 специфичных SNP, локализованные на I хромосоме.
Анализ нуклеотидных замен в геномах штаммов V. ^olerae выявил 1157 SNP, большая часть которых относительно равномерно распределена на I хромосоме (табл. 3).
Заключение
Проведенное MLVA-типирование 16 штаммов V. cholerae О1 биовара El Tor — как типичных, так и генетически измененных вариантов, выделенных от больных людей в разные периоды 7-й пандемии холеры, показало, что исследуемые штаммы относятся к 15 MLVA-типам и делятся на 3 группы в составе одного кластера. В то же время другой кластер образован только генетически измененными штаммами, использованными в качестве группы сравнения и изолированными после 2000 г. в Бангладеш (2001, 2004 гг.), Индии (2006 и 2007 гг.) и на Гаити (2014 г.). Принадлежность исследуемых штаммов к 15 разным MLVA-типам свидетельствует о продолжающихся эволюционных изменениях генома возбудителя холеры, что согласуется с данными, полученными ранее [25, 29].
ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
Таблица 3. Специфичные SNP в геноме различных групп V. cholerae, выделенных на Кавказе в период 6-й и 7-й пандемий
Table 3. Specific SNPs in the genome of various V. cholerae groups isolated in the Caucasus during the 6th and 7th pandemics
Хромосома,
№ группы Число специфичных SNP координаты SNP Ген/локус Белок/локус
Group No. Number of specific SNPs Chromosome, coordinates of the SNP Gene/locus Protein/locus
2 (921847) VCA0975
2 (1024057) VCA1073(putA)
АТФ-связывающий белок ATP-binding protein Бифункциональная пролиндегидрогеназа Bifunctional proline dehydrogenase
1 (775458)
2 (111100)
VC0722(ppx) Экзополифосфатаза
Exopolyphosphatase VCA0103 Белок-переносчик неорганических анионов
семейства SulP SulP family inorganic anion transporter
1 (1720436) VC1606 Белок семейства TolC
TolC family protein
1 (2285964) VC2132(fliG) Белок переключателя жгутиков FliG
Flagellar motor switch protein FliG 1 (2695072) VC2506(rapA) Связанный с РНК-полимеразой белок
RNA polymerase-associated protein
1 (2801737) VC2630 Белок семейства PilQ
Type IV pilus secretin PilQ family protein 2 (52695) VCA0044 Псевдоген
Pseudogen
2 (118960) VCA0109(tssE) Субъединица системы секреции TssE
Secretion system baseplate subunit TssE
1 (2766100)
2 (636413)
VC2599(rnr) Рибонуклеаза R
Ribonuclease R VCA0697 Дигуанилатциклаза, сенсорный домен
Sensor domain-containing diguanylate cyclase
1 (1317870)
1 (1830897) 2 (58725) 2 (62339)
2 (487649) 2 (796722)
Intergenic Межгенное пространство
Intergenic space VC1697 NAD(P)H-связывающий белок
NAD(P)H-binding protein VCA0051 Гипотетический белок
Hypothetical protein VCA0055 Белок, содержащий домен
Domain-containing protein VCA0550 Белок семейства site-2 протеаз
Site-2 protease family protein VCA0849 Белок, содержащий модуль сдерживания
Retention module-containing protein
1 (89430) 1 (2336676) 1 (2690901)
VC0091 VC2190(flgL) VC2503
SAM-зависимая метилтрансфераза SAM-dependent methyltransferase Белок FlgL, связанный с жгутиками Flagellar hook-associated protein FlgL Валин-тРНК лигаза Valine-tRNA ligase
10 11
1 (2424759) 1 (2669927)
VC2270 Рибофлавинсинтаза
Riboflavin synthase VC2489 Регулятор транскрипции семейства TetR/AcrR
TetR/AcrR family transcriptional regulator
2
2
2
7
6
Кроме того, данные MLVA-типирования подтвердили, что случаи холеры на Кавказе являются завозными с территории эндемичных стран и позволили определить наиболее вероятные источники инфекции, что важно для молекулярно-эпидемио-логического мониторинга за возбудителем холеры.
Основываясь на полученных данных wgSNP и анализа структурных особенностей геномов, установлено место штаммов V. cholerae O1 биовара El Tor, выделенных в период с 1970 по 1998 г. на территории Кавказа, в глобальной популяции V. cholerae. Показано, что в указанный период на Кавказе циркулировали штаммы, принадлежащие 1-й и 2-й волнам 7-й пандемии холеры.
С использованием wgSNP выявлены ранее не описанные несинонимичные SNP в генах, ассоциированных с экспрессией факторов патогенности, которые могут в дальнейшем быть использованы в качестве дополнительных генетических маркеров для характеристики изолятов V. cholerae O1 биовара El Tor.
СПИСОК ИСТОЧНИКОВ
1. ВОЗ. Международные медико-санитарные правила (2005 г.). Available at: https://www.who.int/ihr/IHR_2005_ru.pdf
2. Ramamurthy T., Mutreja A., Weill F.X., Das B., Ghosh A., Nair G.B. Revisiting the global epidemiology of cholera in conjuction with the genomics of Vibrio cholerae. Front. Public Health. 2019; 7: 203. https://doi.org/10.3389/fpubh.2019.00203
3. Greig D.R., Schaefer U., Octavia S., Hunter E., Chattaway M.A., Dallman T.J., et al. Evaluation of whole-genome sequencing for identification and typing of Vibrio cholerae. J. Clin. Microbiol. 2018; 56(11): e00831-18. https://doi.org/10.1128/JCM.00831-18
4. Москвитина Э.А., Тюленева Е.Г., Кругликов В.Д., Титова С.В., Водопьянов А.С., Куриленко М.Л. и др. Холера: оценка эпидемиологической обстановки в мире и России в 2008-2017 гг. Прогноз на 2018 г. Проблемы особо опасных инфекций. 2018; (1): 36-43. https://doi.org/10.21055/0370-1069-2018-1-36-43
5. Харченко Г.А., Кимирилова О.Г., Буркин В.С. Эпидемиология и клиника холеры 1970 года в Астраханской области. Детские инфекции. 2019; 18(1): 51-5. https://doi.org/10.22627/2072-8107-2019-18-1-51-55
6. Онищенко Г.Г., Москвитина Э.А., Водопьянов А.С., Монахова Е.В., Писанов Р.В., Водопьянов С.О. и др. Ретроспективный молекулярно-эпидемиологический анализ эпидемии холеры в Республике Дагестан в 1994 г. Проблемы особо опасных инфекций. 2016; (4): 33-41. https://doi.org/10.21055/0370-1069-2016-4-33-41
7. Челдышова Н.Б., Крицкий А.А., Лозовский Ю.В., Гусева Н.П. Сравнительный MLVA-анализ штаммов Vibrio cholerae классического биовара, выделенных в России и за рубежом. Проблемы особо опасных инфекций. 2016; (4): 88-92. https://doi.org/10.21055/0370-1069-2016-4-88-92
8. George C.M., Rashid M., Almeida M., Saif-Ur-Rahman K.M., Monira S., Bhuyian M.S.I., et al. Genetic relatedness of Vibrio cholerae isolates within and between households during outbreaks in Dhaka, Bangladesh. BMC Genomics. 2017; 18(1): 903. https://doi.org/10.1186/s12864-017-4254-9
9. Kachwamba Y., Mohammed A.A., Lukupulo H., Urio L., Majigo M., Mosha F., et al. Genetic characterization of Vibrio cholerae O1 isolates from outbreaks between 2011 and 2015 in
ORIGINAL RESEARCHES
Tanzania. BMC Infect. Dis. 2017; 17(1): 157. https://doi.org/10.1186/sl2879-017-2252-9
10. Garrine M., Mandomando I., Vubil D., et al. Minimal genetic change in Vibrio cholerae in Mozambique over time: multilocus variable number tandem repeat analysis and whole genome sequencing. PLoS Negl. Trop. Dis. 2017; 11(6): e0005671. https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0005671
11. Водопьянов А.С., Водопьянов С.О., Олейников И.П., Мишанькин Б.Н. INDEL-типирование штаммов Vibrio cholerae. Эпидемиология и инфекционные болезни. 2017; 22(4): 195-200.
https://doi.org/10.18821/1560-9529-2017-22-4-195-200
12. Водопьянов А.С., Мазрухо А.Б., Водопьянов С.О., Мишанькин Б.Н., Кругликов В.Д., Архангельская И.В. и др. VNTR-генотипирование штаммов Vibrio cholerae, выделенных из объектов внешней среды на территории Российской Федерации в 2012 году. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2014; 91(2): 46-51.
13. Селянская Н.А., Архангельская И.В., Водопьянов А.С., Водопьянов С.О., Кругликов В.Д., Водяницкая С.Ю. и др. Типирование штаммов Vibrio cholerae не О1/не О139, изолированных в Ростовской области в 2014 году. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2016; 93(1): 3-9. https://doi.org/10.36233/0372-9311-2016-1-3-9
14. Водопьянов А.С., Водопьянов С.О., Олейников И.П., Ми-шанькин Б.Н., Кругликов В.Д., Архангельская И.В. и др. INDEL- и VNTR-типирование штаммов Vibrio cholerae, выделенных в 2013 году из объектов окружающей среды на территории Российской Федерации. Здоровье населения и среда обитания. 2015; (5): 41-4.
15. Van Boeckel T.P., Brower C., Gilbert M., Grenfell B.T., Levin S.A., Robinson T.P., et al. Global trends in antimicrobial use in food animals. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2015; 112(18): 5649-54. https://doi.org/10.1073/pnas.1503141112
16. Сизова Ю.В., Писанов Р.В., Водопьянов А.С., Черепахи-на И.Я., Бурлакова О.С. Фенотипический и генотипический анализ токсинопродукции типичных и атипичных штаммов холерных вибрионов в стрессовых условиях окружающей среды. Современные проблемы науки и образования. 2017; (3): 141.
17. Челдышова Н.Б., Смирнова Н.И., Заднова С.П., Краснов Я.М., Крицкий А.А., Буаро М.И. и др. Молекуляр-но-генетические свойства штаммов Vibrio cholerae биовара Эль Тор, циркулирующих на Африканском континенте. Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2017; 35(1): 12-9. https://doi.org/10.18821/0208-0613-2017-35-1-12-1
18. Buroni S., Pollini S., Rossolini G.M., Perrin E. Editorial: evolution of genetic mechanisms of antibiotic resistance. Front. Genet. 2019; 10: 983. https://doi.org/10.3389/fgene.2019.00983
19. Andrews S. FastQC: a quality control tool for high throughput sequence data; 2010. Available at: http://www.bioinformatics. babraham.ac.uk/projects/fastqc
20. Bolger A.M., Lohse M., Usadel B. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinformatics. 2014; 30(15): 2114-20. https://doi.org/10.1093/bioinformatics/btu170
21. Gurevich A., Saveliev V., Vyahhi N., Tesler G. QUAST: quality assessment tool for genome assemblies. Bioinformatics. 2013; 29(8): 1072-5. https://doi.org/10.1093/bioinformatics/btt086
22. Bertels F., Silander O.K., Pachkov M., Rainey P.B., van Nimwegen E. Automated reconstruction of whole-genome phylogenies from short-sequence reads. Mol. Biol. Evol. 2014; 31(5): 1077-88. https://doi.org/10.1093/molbev/msu088
23. Dash H.R., Shrivastava P., Mohapatra B.K., Das S., eds. DNA Fingerprinting: Advancements and Future Endeavors. Singapore: Springer; 2018. https://doi.org/10.1007/978-981-13-1583-1
24. Савельева И.В., Куличенко А.Н., Савельев В.Н., Ковалев Д.А., Васильева О.В., Жиров А.М. и др. MLVA-типиро-
ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
вание клинических штаммов генетически измененных Vibrio cholerae biotype El tor, изолированных в России и Украине в период седьмой пандемии холеры. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2018; 95(6): 37-43. https://doi.org/10.36233/0372-9311-2018-6-37-43
25. Смирнова Н.И., Кульшань Т.А., Краснов Я.М. MLVA-типи-рование клинических штаммов Vibrio cholerae, изолированных в разные периоды текущей пандемии холеры. Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2015; 33(1): 15-22.
26. Nguyen D.T., Ngo T.C., Le T.H., Nguyen H.T., Morita M., Arakawa E., et al. Molecular epidemiology of Vibrio cholerae O1 in Northern Vietnam (2007-2009), using multilocus variable-number tandem repeat analysis. J. Med. Microbiol. 2016; 65(9): 1007-12. https://doi.org/10.1099/jmm.0.000317
27. Bwire G., Sack D.A., Almeida M., Li S., Voeglein J.B., Debes A.K., et al. Molecular characterization of Vibrio cholerae responsible for cholera epidemics in Uganda by PCR, MLVA and WGS. PLoS Negl. Trop. Dis. 2018; 12(6): e0006492. https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0006492
28. Mironova L.V., Gladkikh A.S., Ponomareva A.S., Feran-chuk S.I., Bochalgin N.O., Basov E.A., et al. Comparative genomics of Vibrio cholerae El Tor strains isolated at epidemic complications in Siberia and at the Far East. Infect. Genet. Evol. 2018; 60: 80-8.
https://doi.org/10.1016/j.meegid.2018.02.023
29. Hossain Z.Z., Leekitcharoenphon P., Dalsgaard A., Sultana R., Begum A., Jensen P.K.M., et al. Comparative genomics of Vibrio cholerae O1 isolated from cholera patients in Bangladesh. Lett. Appl. Microbiol. 2018; 67(4): 329-36. https://doi.org/10.1111/lam.13046
REFERENCES
1. WHO. International Health Regulations (2005). Available at: https://www.who.int/ihr/IHR_2005_en.pdf
2. Ramamurthy T., Mutreja A., Weill F.X., Das B., Ghosh A., Nair G.B. Revisiting the global epidemiology of cholera in conjuction with the genomics of Vibrio cholerae. Front. Public Health. 2019; 7: 203. https://doi.org/10.3389/fpubh.2019.00203
3. Greig D.R., Schaefer U., Octavia S., Hunter E., Chattaway M.A., Dallman T. J., et al. Evaluation of whole-genome sequencing for identification and typing of Vibrio cholerae. J. Clin. Microbiol. 2018; 56(11): e00831-18. https://doi.org/10.1128/JCM.00831-18
4. Moskvitina E.A., Tyuleneva E.G., Kruglikov V.D., Titova S.V., Vodop'yanov A.S., Kurilenko M.L., et al. Cholera: assessment of epidemiological situation on cholera around the world and in Russia in 2008-2017. Forecast for 2018. Problemy osobo opasnykh infektsiy. 2018; (1): 36-43. https://doi.org/10.21055/0370-1069-2018-1-36-43 (in Russian)
5. Kharchenko G.A., Kimirilova O.G., Burkin V.S. Epidemiology and clinic of Cholera 1970 in the Astrakhan region. Detskie in-fektsii. 2019; 18(1): 51-5. https://doi.org/10.22627/2072-8107-2019-18-1-51-55 (in Russian)
6. Onishchenko G.G., Moskvitina E.A., Vodop'yanov A.S., Mon-akhova E.V., Pisanov R.V., Vodop'yanov S.O., et al. Retrospective molecular-epidemiological analysis of cholera epidemic in the Republic of Dagestan in 1994. Problemy osobo opasnykh infektsiy. 2016; (4): 33-41.
https://doi.org/10.21055/0370-1069-2016-4-33-41 (in Russian)
7. Cheldyshova N.B., Kritskiy A.A., Lozovskiy Yu.V., Guseva N.P. Comparative MLVA-analysis of Vibrio cholerae strains of classical biovar, isolated in the Russian Federation and abroad. Problemy osobo opasnykh infektsiy. 2016; (4): 88-92. https://doi.org/10.21055/0370-1069-2016-4-88-92 (in Russian)
8. George C.M., Rashid M., Almeida M., Saif-Ur-Rahman K.M., Monira S., Bhuyian M.S.I., et al. Genetic relatedness of Vibrio cholerae isolates within and between households during out-
breaks in Dhaka, Bangladesh. BMC Genomics. 2017; 18(1): 903. https://doi.org/10.1186/sl2864-017-4254-9 9. Kachwamba Y., Mohammed A.A., Lukupulo H., Urio L., Maji-go M., Mosha F., et al. Genetic characterization of Vibrio cholerae O1 isolates from outbreaks between 2011 and 2015 in Tanzania. BMC Infect. Dis. 2017; 17(1): 157. https://doi.org/10.1186/s12879-017-2252-9
10. Garrine M., Mandomando I., Vubil D., et al. Minimal genetic change in Vibrio cholerae in Mozambique over time: Multilocus variable number tandem repeat analysis and whole genome sequencing. PLoS Negl. Trop. Dis. 2017; 11(6): e0005671. https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0005671
11. Vodop'yanov A.S., Vodop'yanov S.O., Oleynikov I.P., Mis-han'kin B.N. INDEL-genotyping of Vibrio cholerae strains. Epidemiologiya i infektsionnye bolezni. 2017; 22(4): 195-200. https://doi.org/10.18821/1560-9529-2017-22-4-195-200 (in Russian)
12. Vodop'yanov A.S., Mazrukho A.B., Vodop'yanov S.O., Mi-shan'kin B.N., Kruglikov V.D., Arkhangel'skaya I.V., et al. VNTR-genotyping of Vibrio cholerae strains isolated from objects in the territory of Russian Federation in 2012. Zhurnal mikrobiologii, epidemiologii i immunobiologii. 2014; 91(2): 46-51. (in Russian)
13. Selyanskaya N.A., Arkhangel'skaya I.V., Vodop'yanov A.S., Vodop'yanov S.O., Kruglikov V.D., Vodyanitskaya S.Yu., et al. Typing of Vibrio cholerae non O1/non O139 strains, isolated in Rostov region in 2014. Zhurnal mikrobiologii, epidemiologii i immunobiologii. 2016; 93(1): 3-9. https://doi.org/10.36233/0372-9311-2016-1-3-9 (in Russian)
14. Vodop'yanov A.S., Vodop'yanov S.O., Oleynikov I.P., Mis-han'kin B.N., Kruglikov V.D., Arkhangel'skaya I.V., et al. IN-DEL- and VNTR-typing Vibrio cholerae strains, isolated in 2013 from the environment objects in the Russian Federation. Zdor-ov'e naseleniya i sreda obitaniya. 2015; (5): 41-4. (in Russian)
15. Van Boeckel T.P., Brower C., Gilbert M., Grenfell B.T., Levin S.A., Robinson T.P., et al. Global trends in antimicrobial use in food animals. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2015; 112(18): 5649-54. https://doi.org/10.1073/pnas.1503141112
16. Sizova Yu.V., Pisanov R.V., Vodop'yanov A.S., Cherepakhi-na I.Ya., Burlakova O.S. Phenotypic and genotypic analysis of toxinproduction of typical and atypical stamps of Vibrio cho-lerae in stress environmental conditions. Sovremennye proble-my nauki i obrazovaniya. 2017; (3): 141. (in Russian)
17. Cheldyshova N.B., Smirnova N.I., Zadnova S.P., Krasnov Ya.M., Kritskiy A.A., Buaro M.I., et al. Molecular-genetic properties of Vibrio cholerae El tor strains circulating in Africa. Molekulyar-naya genetika, mikrobiologiya i virusologiya. 2017; 35(1): 12-9. https://doi.org/10.18821/0208-0613-2017-35-1-12-1
18. Buroni S., Pollini S., Rossolini G.M., Perrin E. Editorial: evolution of genetic mechanisms of antibiotic resistance. Front. Genet. 2019; 10: 983. https://doi.org/10.3389/fgene.2019.00983
19. Andrews S. FastQC: a quality control tool for high throughput sequence data; 2010. Available at: http://www.bioinformatics. babraham.ac.uk/projects/fastqc
20. Bolger A.M., Lohse M., Usadel B. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinformatics. 2014; 30(15): 2114-20.
https://doi.org/10.1093/bioinformatics/btu170
21. Gurevich A., Saveliev V., Vyahhi N., Tesler G. QUAST: quality assessment tool for genome assemblies. Bioinformatics. 2013; 29(8): 1072-5. https://doi.org/10.1093/bioinformatics/btt086
22. Bertels F., Silander O.K., Pachkov M., Rainey P.B., van Nim-wegen E. Automated reconstruction of whole-genome phylo-genies from short-sequence reads. Mol. Biol. Evol. 2014; 31(5): 1077-88. https://doi.org/10.1093/molbev/msu088
23. Dash H.R., Shrivastava P., Mohapatra B.K., Das S., eds. DNA Fingerprinting: Advancements and Future Endeavors. Singapore: Springer; 2018.
https://doi.org/10.1007/978-981-13-1583-1
24. Savel'eva I.V., Kulichenko A.N., Savel'ev V.N., Kovalev D.A., Vasil'eva O.V., Zhirov A.M., et al. MLVA-typing of clinical stamps of genetically changed Vibrio cholerae biotype El tor insulated in Russia and Ukraine in the period of seventh pandemic cholera. Zhurnal mikrobiologii, epidemiologii i immuno-biologii. 2018; 95(6): 37-43.
https://doi.org/10.36233/0372-9311-2018-6-37-43 (in Russian)
25. Smirnova N.I., Kul'shan' T.A., Krasnov Ya.M. MLVA typing of clinical Vibrio cholerae strains isolated during different periods of the current cholera pandemic. Molekulyarnaya genetika, mikrobiologiya i virusologiya. 2015; 33(1): 15-22. (in Russian)
26. Nguyen D.T., Ngo T.C., Le T.H., Nguyen H.T., Morita M., Arakawa E., et al. Molecular epidemiology of Vibrio cholerae O1 in Northern Vietnam (2007-2009), using multilocus variable-number tandem repeat analysis. J. Med. Microbiol. 2016; 65(9): 1007-12. https://doi.org/10.1099/jmm.0.000317
Информация об авторах
Ковалев Дмитрий Анатольевич — к.х.н., зав. лаб. биохимии Ставропольского противочумного института, Ставрополь, Россия, stavnipchi@mail.ru, https://orcid.org/0000-0002-9366-5647 Шапаков Николай Андреевич — м.н.с. лаб. биохимии Ставропольского противочумного института, Ставрополь, Россия, https://orcid.org/0000-0001-9152-4026
Писаренко Сергей Владимирович — к.х.н., в.н.с. лаб. биохимии Ставропольского противочумного института, Ставрополь, Россия, https://orcid.org/0000-0001-6458-6790
Савельева Ирина Вилорьевна — к.м.н., врач-бактериолог научно-производственной лаборатории препаратов для диагностики особо опасных и других инфекций Ставропольского противочумного института, Ставрополь, Россия, https://orcid.org/0000-0002-1254-2259
Васильева Оксана Васильевна — к.м.н., зав. лаб. диагностики бактериальных инфекций Ставропольского противочумного института, Ставрополь, Россия, http://orcid.org/0000-0002-8882-6477 Савельев Вилорий Николаевич — д.м.н., г.н.с. лаб. эпидемиологии Ставропольского противочумного института, Ставрополь, Россия, https://orcid.org/0000-0001-6458-3725
Сирица Юлия Владимировна — биолог лаб. диагностики бактериальных инфекций Ставропольского противочумного института, Ставрополь, Россия, https://orcid.org/0000-0001-9442-6966 Жиров Андрей Михайлович — м.н.с. лаб. биохимии Ставропольского противочумного института, Ставрополь, Россия, http://orcid.org/0000-0002-7698-7361
Ульшина Диана Васильевна — н.с. лаб. биохимии Ставропольского противочумного института, Ставрополь, Россия, https://orcid.org/0000-0001-7754-2201
Кузнецова Ирина Владимировна — врач-бактериолог лаб. биохимии Ставропольского противочумного института, Ставрополь, Россия, http://orcid.org/0000-0001-9513-0761
Бобрышева Ольга Викторовна — м.н.с. лаб. биохимии Ставропольского противочумного института, Ставрополь, Россия, https://orcid.org/0000-0001-6338-4476
Куличенко Александр Николаевич — д.м.н., проф., член-корр. РАН, директор Ставропольского противочумного института, Ставрополь, Россия, https://orcid.org/0000-0002-9362-3949
Участие авторов. Все авторы внесли существенный вклад в проведение поисково-аналитической работы и подготовку статьи, прочли и одобрили финальную версию до публикации.
Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.
Статья поступила в редакцию 28.05.2020; принята к публикации 28.10.2020; опубликована 25.02.2021.
ORIGINAL RESEARCHES
27. Bwire G., Sack D.A., Almeida M., Li S., Voeglein J.B., Debes A.K., et al. Molecular characterization of Vibrio cholerae responsible for cholera epidemics in Uganda by PCR, MLVA and WGS. PLoS Negl. Trop. Dis. 2018; 12(6): e0006492. https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0006492
28. Mironova L.V., Gladkikh A.S., Ponomareva A.S., Feran-chuk S.I., Bochalgin N.O., Basov E.A., et al. Comparative genomics of Vibrio cholerae El Tor strains isolated at epidemic complications in Siberia and at the Far East. Infect. Genet. Evol. 2018; 60: 80-8. https://doi.org/10.1016/j.mee-gid.2018.02.023
29. Hossain Z.Z., Leekitcharoenphon P., Dalsgaard A., Sultana R., Begum A., Jensen P.K.M., et al. Comparative genomics of Vib -rio cholerae O1 isolated from cholera patients in Bangladesh. Lett. Appl. Microbiol. 2018; 67(4): 329-36. https://doi.org/10.! 111/lam.13046
Information about the authors
Dmitry A. Kovale^ — PhD (Chem.), Head, Laboratory of biochemistry, Stavropol Plague Control Research Institute, Stavropol, Russia, stavnipchi@mail.ru, https://orcid.org/0000-0002-9366-5647 Nikolay A. Shapakov — junior researcher, Laboratory of biochemistry, Stavropol Plague Control Research Institute, Stavropol, Russia, https://orcid.org/0000-0001-9152-4026
Sergey V. Pisarenko — PhD (Chem.), leading researcher, Laboratory of biochemistry, Stavropol Plague Control Research Institute, Stavropol, Russia, https://orcid.org/0000-0001-6458-6790
Irina V. Savel'eva — PhD (Med.), doctor-bacteriologist, Research and production laboratory of drugs for the diagnosis of especially dangerous and other infections, Stavropol Plague Control Research Institute, Stavropol, Russia, https://orcid.org/0000-0002-1254-2259 Oksana V. Vasil'eva — PhD (Med.), Head, Laboratory of diagnosis of bacterial infections, Stavropol Plague Control Research Institute, Stavropol, Russia, http://orcid.org/0000-0002-8882-6477
Vilory N. Savel'ev — D. Sci. (Med.), main researcher, Laboratory of epidemiology, Stavropol Plague Control Research Institute, Stavropol, Russia, https://orcid.org/0000-0001-6458-3725
Yulia V. Siritsa — biologist, Laboratory of diagnosis of bacterial infections, Stavropol Plague Control Research Institute, Stavropol, Russia, https://orcid.org/0000-0001-9442-6966
Andrey M. Zhirov — junior researcher, Laboratory of biochemistry, Stavropol Plague Control Research Institute, Stavropol, Russia, http://orcid.org/0000-0002-7698-7361
Diana V. Ul'shina — researcher, Laboratory of biochemistry, Stavropol Plague Control Research Institute, Stavropol, Russia, https://orcid.org/0000-0001-7754-2201
Irina V. Kuznetsova — doctor-bacteriologist, Laboratory of biochemistry, Stavropol Plague Control Research Institute, Stavropol, Russia, http://orcid.org/0000-0001-9513-0761
Olga V. Bobrysheva — junior researcher, Laboratory of biochemistry, Stavropol Plague Control Research Institute, Stavropol, Russia, https://orcid.org/0000-0001-6338-4476
Aleksandr N. Kulichenko — D. Sci. (Med.), Prof., Associate Member of RAS, Director, Stavropol Plague Control Research Institute, Stavropol, Russia, https://orcid.org/0000-0002-9362-3949
Author contribution. All authors made a substantial contribution to the conception of the work, acquisition, analysis, interpretation of data for the work, drafting and revising the work, final approval of the version to be published.
Conflict of interest. The authors declare no apparent or potential conflicts of interest related to the publication of this article.
The article was submitted 28.05.2020; accepted for publication 28.10.2020; published 25.02.2021.