ГЕНЕТИЧЕСКОЕ РАЗНООБРАЗИЕ VIBRIO CHOLERAE О1 EL TOR ПРИ ЭПИДЕМИЧЕСКИХ ОСЛОЖНЕНИЯХ В СИБИРСКОМ И ДАЛЬНЕВОСТОЧНОМ РЕГИОНАХ

Миронова Л.В.; Пономарева А.С.; Хунхеева Ж.Ю.; Гладких А.С.; Балахонов С.В.

https://doi.org/10.17116/molgen201937041165

Генетическое разнообразие Vibrio cholerae О1 El Tor при эпидемических осложнениях в Сибирском и Дальневосточном регионах

ФКУЗ «Иркутский научно-исследовательский противочумный институт» Роспотребнадзора, Иркутск, Россия, 664047 Резюме

Эпидемические проявления холеры в Сибири и на Дальнем Востоке России в период VII пандемии регистрировались в виде отдельных случаев завоза инфекции на территорию или ассоциированных с завозом острых местных вспышек в 1970-е и 1990-е годы. Проведено изучение генетического разнообразия и родства 83 выделенных при эпидемических осложнениях в регионе штаммов V. cholerae O1 El Tor на основе мультилокусного анализа числа вариабельных тандемных повторов по пяти локусам — VcA, VcB, VcQ VcD, VcG. Установлено, что максимальным полиморфизмом в исследуемой выборке штаммов характеризуется локус VcВ, минимальным — VcC. При кластерном анализе выявлена дифференциация штаммов V. cholerae периода эпидемических осложнений на 7 кластеров в зависимости от структуры детерминант патогенности (типичные и атипичные вибрионы Эль-Тор), времени и направления завоза возбудителя. В пределах отдельных вспышек на Дальнем Востоке 1999 г. показана гетерогенность популяций этиологического агента (5 генотипов выявлено среди вспышечных штаммов из Южно-Сахалинска, 6 — среди штаммов из Приморского края) с идентификацией доминирующих MLVA-профилей и их однолокусных вариантов. Установлено отсутствие строгой территориальной приуроченности генотипов вспышечных штаммов V. cholerae (один штамм из Южно-Сахалинска демонстрирует идентичность аллельного профиля с изолятами из Владивостока), а также соответствия генотипа V. cholerae определенному очагу инфекции. На основании данных MLVA-типирования можно заключить, что изолированные при эпидемических осложнениях в Сибирском и Дальневосточном регионах России штаммы V. cholerae О1 El Tor характеризуются гетерогенностью генетической организации, согласующейся с периодом и направлением их импортации на территорию. При отдельных вспышках холеры выявлена клональность этиологического агента с идентификацией близкородственных субклонов, формирование которых могло быть результатом пребывания возбудителя в объектах окружающей среды или пассажа через восприимчивый организм.

Ключевые слова: Vibrio cholerae, MLVA-типирование, эпидемические осложнения, клональность. ИНФОРМАЦИЯ ОБ АВТОРАХ:

Миронова Л.В. — e-mail: mironova-lv@yandex.ru; https://orcid.org/0000-0001-8481-6442 Пономарева А.С. — e-mail: ackozh@mail.ru; https://orcid.org/0000-0002-0674-6159 Хунхеева Ж.Ю. — e-mail: khunkheeva2015@yandex.ru; https://orcid.org/0000-0002-5388-4300 Гладких А.С. — e-mail: angladkikh@gmail.com; https://orcid.org/0000-0001-6759-1907 Балахонов С.В. — e-mail: balakhonov.irk@mail.ru; https://orcid.org/0000-0003-4201-5828

АВТОР, ОТВЕТСТВЕННЫЙ ЗА ПЕРЕПИСКУ:

Миронова Лилия Валерьевна — д.м.н., заведующая лабораторией холеры ФКУЗ «Иркутский научно-исследовательский противочумный институт» Роспотребнадзора; 664047, Иркутск, ул. Трилиссера, 78; e-mail: mironova-lv@yandex.ru

КАК ЦИТИРОВАТЬ:

Миронова Л.В., Пономарева А.С., Хунхеева Ж.Ю., Гладких А.С., Балахонов С.В. Генетическое разнообразие Vibrio cholerae О1 El Tor при эпидемических осложнениях в Сибирском и Дальневосточном регионах. Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2019;37(4):165-172. https://doi.org/10.17116/molgen201937041165

Genetics diversity of Vibrio cholerae О1 El Tor during epidemic complications in Siberian and the Far Eastern regions

Irkutsk Antiplague Research Institute of Rospotrebnadzor, Irkutsk, Russia, 664047 Abstract

The manifestations of cholera in Siberia and the Far East of Russia during the seventh pandemic were recorded as separate cases of the infection importation into the territory or associated with the importation acute local outbreaks in the 1970s and the 1990s. The study of genetic diversity and relation of 83 V. cholerae O1 El Tor strains isolated from epidemic complications in the region on the basis of multilocus analysis of the number of variable tandem repeats at five loci — VcA, VcB, VcC, VcD, VcG — was carried out. It was established that the VcB locus is defined by the maximum polymorphism in the sample of strains studied, and the VcC locus by minimum. Cluster analysis revealed differentiation of V. cholerae strains of epidemic complications period into seven clusters depending on the structure of the pathogenic determinants (typical and atypical El Tor), the time and direction of the pathogen importation. Within the individual outbreaks at the Far East in 1999, heterogeneity of the etiological agent populations

was shown (five genotypes were detected among outbreak strains from Yuzhno-Sakhalinsk, six among strains from Primorsky Krai) and identification of dominant MLVA-profiles and their one-locus variants was provided. The absence of strict territorial accessory of the genotypes of V. cholerae outbreaks strains (one strain from Yuzhno-Sakhalinsk demonstrates the identity of the allele profile with isolates from Vladivostok) as well as the correspondence of the V. cholerae genotype to a specific infection foci was determined. Based on the MLVA-typing data, it can be concluded that the V. cholerae O1 El Tor strains isolated from epidemic complications in the Siberian and the Far Eastern regions of Russia are characterized by the heterogeneity of the genetic organization that is consistent with the period and direction of their importation into the territory. Within separate outbreaks of cholera, the clonality of the etiological agent with the identification of closely related subclones was identified, the formation of which could be the result of the causative agent presence in the environment or passage through a susceptible organism.

Keywords: Vibrio cholerae, MLVA-typing, epidemic complications, clonality. INFORMATION ABOUT AUTHORS:

Mironova L.V. — e-mail: mironova-lv@yandex.ru; https://orcid.org/0000-0001-8481-6442 Ponomareva A.S. — e-mail: ackozh@mail.ru; https://orcid.org/0000-0002-0674-6159 Khunkheeva Zh.Yu. — e-mail: khunkheeva2015@yandex.ru; https://orcid.org/0000-0002-5388-4300 Gladkikh A.S. — e-mail: angladkikh@gmail.com; https://orcid.org/0000-0001-6759-1907 Balakhonov S.V. — e-mail: balakhonov.irk@mail.ru; https://orcid.org/0000-0003-4201-5828

CORRESPONDING AUTHOR:

Mironova L.V. — chief of the laboratory of cholera, Irkutsk Antiplague Research Institute of Siberia and the Far East; Irkutsk, Trilisser St., 78; e-mail: mironova-lv@yandex.ru

TO CITE THIS ARTICLE:

Mironova LV, Ponomareva AS, Khunkheeva ZhYu., Gladkikh AS, Balakhonov SV. Genetics diversity of Vibrio cholerae 01 El Tor during epidemic complications in Siberian and the Far Eastern regions. Molekulyarnaya Genetika, Mikrobiologiya i Virusologiya (Molecular Genetics, Microbiology and Virology). 2019;37(4):165-172 (In Russ.). https://doi.org/10.17116/molgen201937041165

Эпидемические проявления холеры в Сибири и на Дальнем Востоке России в период седьмой пандемии регистрировались в виде отдельных случаев завоза инфекции на территорию или ассоциированных с завозом острых местных вспышек в 1970-е и 1990-е годы. В частности, в 1970-е годы протекали крупные вспышки холеры в Омске, Новосибирске и Барнауле. В 1990-е годы были зарегистрированы завозы инфекции в Омске, Новосибирске, Барнауле (1994 г.), Иркутске и Ачинске (1997 г.), Уссурийске, Владивостоке, Южно-Сахалинске (1999 г.) и вспышки — во Владивостоке и Южно-Сахалинске в 1999 г. [1-3].

Ретроспективный анализ особенностей структурной организации детерминант патогенности в геномах, изолированных при эпидемических осложнениях в регионе штаммов возбудителя холеры, показал дифференциацию их на группы в зависимости от периода пандемии [4]. При этом было показано, что этиологическим агентом холеры в Сибири и на Дальнем Востоке в 1990-е годы послужили атипичные генетически измененные варианты вибриона Эль-Тор с классической аллелью гена субъединицы В холерного токсина, характеризующиеся вариабельностью дополнительных ассоциированных с патогенностью детерминант. Однако генотипирование V. cholerae по комплексу указанных детерминант позволяет идентифицировать лишь крупные кластеры штаммов, распределение на которые согласуется с периодом и направлением завоза возбудителя на территорию. Вместе с тем для понимания закономерностей развития

осложнений по холере на территории, реконструкции эпидемической цепи и установления родства разных групп штаммов необходимо дальнейшее изучение генетического разнообразия популяций патогена.

Известно, что углубленная молекулярно-генетиче-ская характеристика микробных патогенов основывается на изучении отдельных локусов генома с применением различных подходов к молекулярному типиро-ванию. Один из таких подходов — мультилокусный анализ числа вариабельных тандемных повторов (MLVA — Multiple Locus Variable-Number Tandem Repeats Analysis) в геноме микроорганизмов, достаточно широко используется в молекулярной эпидемиологии инфекционных болезней, изучении популяцион-ной динамики возбудителей, оценке их генетического разнообразия [5, 6]. Метод характеризуется относительной простотой выполнения протокола, хорошей воспроизводимостью, высокой дискриминирующей способностью и возможностью межлабораторного сопоставления результатов. В геноме холерного вибриона, как и ряда других микроорганизмов, идентифицированы содержащие короткие повторяющиеся последовательности участки, используемые в качестве мишеней для MLVA-типирования [7, 8].

С учетом изложенного цель исследования — изучение генетического разнообразия и родства штаммов V. cholerae O1 El Tor, выделенных в завозных очагах и в период вспышек холеры в Сибири и на Дальнем Востоке, на основе мультилокусного анализа числа вариабельных тандемных повторов.

Материал и методы

Штаммы. В исследование включено 83 штамма V. cholerae О1 El Tor, изолированных от больных, ви-бриононосителей и из объектов окружающей среды в завозных очагах и в период вспышек холеры в Сибири и на Дальнем Востоке. Кроме того, проведен анализ 4 изолятов V. cholerae О1 классического биовара, 4 нетоксигенных изолированных от людей в период эпидемиологического благополучия V. cholerae О1 El Tor (группа сравнения), 2 контрольных штаммов классического и Эль Тор биоваров.

Экстракцию ДНК штаммов V. cholerae осуществляли c использованием коммерческого набора для выделения нуклеиновых кислот Рибо-Преп («Ампли-сенс», Москва). Качество выделения ДНК оценивали электрофоретически в 0,9% агарозном геле, концентрацию — спектрофотометрически на NanoVue Plus («GE Health Care», США).

MLVA-типирование. Амплификацию локусов вариабельных тандемных повторов V. cholerae (VcA, VcB, VcC, VcD, VcG) осуществляли с использованием стандартных наборов для амплификации ДНК («Синтол», Москва) и предложенных А.С. Водопьяновым и соавт. [7] последовательностей праймеров, меченных флуоресцентными красителями (в структуру праймеров к локусу VcA включена флуоресцентная метка FAM, к VcB — R6G, к VcC и VcG — TAMRA, к VcD — ROX).

Размер ампликонов устанавливали методом капиллярного электрофореза на ДНК-анализаторе ABI Prism 3130 Genetic Analyzer с использованием программного пакета GeneMapper 4.0 в сравнении с маркером молекулярной массы GeneScan™ 500 LIZ™ Size Standard. Расчет числа повторов в геноме исследуемых штаммов V. cholerae осуществляли в сравнении с таковым маркерного штамма, для которого структура локусов определена секвенированием. В качестве маркерного использовали штамм V. cholerae О1 El Tor И-1300. Аллельный профиль его определен как VcA7_ VcB21_VcC9_VcD7_VcG8.

MLVA-генотип исследуемых штаммов V. cholerae определяли как совокупность аллельных вариантов каждого локуса и представляли в виде числового паттерна с последовательностью локусов — VcA_VcB_ VcC_VcD_VcG.

Кластерный анализ результатов MLVA проводили по алгоритмам UPGMA (Unweighted Pair-Group Method using Arithmetic averages — попарное невзвешенное кластирование с арифметическим усреднением) и

MST (minimum spanning tree — минимальное остов-ное дерево) для категориальных данных с использованием инструментов программного комплекса BioNu-merics версии 6.0-7.5 («Applied Maths», Бельгия).

Дискриминирующую способность MLVA-типи-рования определяли на основании расчета индекса Хантера—Гастона [9].

Аллельный полиморфизм локусов оценивали посредством расчета индекса аллельного полиморфизма h по формуле:

A=1-Sx2i["/„-1],

где x — частота встречаемости аллели i в локусе и n — число штаммов, имеющих аллельный вариант i.

Результаты

Исследование структуры пяти локусов вариабельных тандемных повторов показало, что в данной выборке штаммов V. cholerae О1 максимальным полиморфизмом характеризуется локус VcB, минимальным — VcC (табл. 1).

На дендрограмме, построенной по алгоритму UPGMA, определено 34 генотипа, в том числе 23 — уникальных. Индекс Хантера—Гастона составляет 0,750.

При анализе по алгоритму MST все исследованные штаммы V. cholerae О1 El Tor распределены по семи кластерам (рис. 1). В I кластер вошли практически все изоляты, выделенные на вспышках и в завозных очагах в Сибири в 70-е годы прошлого столетия. По структуре детерминант патогенности эти штаммы относятся к типичным представителям биовара Эль Тор с ctxB3 аллелью гена субъединицы В холерного токсина. В данном кластере дифференцируются два близкородственных комплексных генотипа. При этом один из них, наряду с доминирующим ML-VA-профилем (20_24_8_6_7), включает группу одно-локусных вариантов (SLV — single locus variant), дифференцирующихся от основного профиля по структуре одного из локусов. Полиморфизм структуры в однолокусных вариантах идентифицирован на участках VcA (в двух случаях увеличение или уменьшение на один повтор) и VcB (сдвиг в сторону увеличения на два—три повтора — VcB26, VcB27) при стабильной структуре остальных локусов. Следует отметить, что к числу SLV относится спонтанный мутант (утративший гены холерного токсина) токсигенного штамма V. cholerae О1 El Tor, изолированного от хронического вибрионосителя в Омске в 1973 г. — изменение

Таблица 1. Аллельный полиморфизм локусов вариабельных тандемных повторов в исследованных штаммах V. cholerae О1

Характеристика исследованных локусов Наименование вариабельных тандемных повторов

VcA VcB VcC VcD VcG

Число аллелей 10 15 8 5 6

Индекс аллельного разнообразия 0,631 0,845 0,505 0,547 0,599

Рис. 1. Дендрограмма, построенная по алгоритму MST на основании анализа пяти локусов вариабельных тандемных повторов в геноме исследуемых штаммов V. cholerae О1 El Tor.

его профиля заключалось в увеличении кратности повторяющихся единиц VcB. Другой спонтанный мутант V. cholerae О1 El Tor оказался дистанцированным от I кластера штаммов в связи с отличием его аллель-ной формулы по двум локусам — VcA и VcC.

Существенно дистанцированные от кластера I кластеры II—VI образованы генетически измененными

вариантами холерного вибриона биовара Эль-Тор с классической аллелью гена с1хБ. Кластеры II—IV включают изоляты из завозных очагов в Сибири в 1994 г. При этом кластер II объединяет штаммы V. ско1егае О1 Е1 Тог, выделенные в завозных очагах в Омске и Барнауле, эпидрасследование установило их связь с завозом инфекции из Индии. Спонтанный мутант од-

Таблица 2. MLVA-генотипы штаммов V. cholerae О1 El Tor, выделенных в Приморском крае и Южно-Сахалинске в 1999 г.

Территория Вариант генотипов MLVA-профиль Количество штаммов

Южно-Сахалинск Доминирующий VcA7 VcB22_VcC9_ VcD7 _VcG8 20

SLV* VcA7 VcB24_VcC9_ VcD7 _VcG8 1

VcA7 VcB21_VcC9_ VcD7 _VcG8 2

VcA7 VcB19_VcC9_ VcD7 _VcG8 1

VcA7 _VcB22_VcC9_ _VcD6_ VcG8 1

Несвязанный VcA17_ VcB0_VcC13_ VcD3_ VcG6** 1

Приморский край Доминирующие VcA7 VcB23_VcC9_ VcD7 _VcG8 13

VcA7 VcB24_VcC9_ VcD7 _VcG8 10

SLV, DLV* VcA7 _VcB23_VcC9_ _VcD7 _VcG9 1

VcA7 VcB25_VcC9_ VcD7 _VcG8 1

VcA7 VcB15_VcC9_ VcD7 _VcG8 1

VcA7 VcB14 VcC9 VcD6 VcG8 1

Примечание. * SLV — single locus variant (однолокусный вариант); DLV — double locus variant (двухлокусный вариант); ** — нетоксиген-ный штамм V. cholerae О1 El Tor, выделенный от вибриононосителя в завозном очаге; полужирным выделены вариабельные локусы.

ного из этих штаммов с делецией протяженного участка первой хромосомы (в области мобильных генетических элементов, несущих детерминанты па-тогенности) демонстрирует изменение MLVA-профиля в сравнении с исходным вариантом по типу дупликации в локусе VcA (исходный профиль 16_9_9_7_6, измененный — 17_9_9_7_6). Пять других штаммов V. cholerae О1 El Tor, выделенных в 1994 г. в Омске, Новосибирске, Барнауле и ассоциированных с завозом из Турции, сгруппировались в два близкородственных кластера — III и IV.

Пятый кластер сформирован штаммами V. cholerae О1 El Tor, выделенными в 1997 г. от двух больных и одного вибриононосителя в Иркутске и Ачинске. При эпидемиологическом расследовании этих случаев холеры было установлено, что заболевшие прибыли на территорию России железнодорожным транспортом (поезд Ташкент—Иркутск) из Казахстана.

Наиболее крупный VI кластер включает в себя все исследуемые штаммы V. cholerae О1 El Tor, выделенные в период эпидемических осложнений на Дальнем Востоке в 1999 г. Этот кластер представлен тремя близкородственными комплексными генотипами, объединяющими 20, 14 и 10 штаммов, и группой их одно-локусных вариантов (см. рис. 1). Доминирующий генотип кластера, аллельный профиль которого охарактеризован как 7_22_9_7_8, представлен штаммами, изолированными от больного в завозном очаге, от больных, вибриононосителей и из объектов окружающей среды в разных очагах в период вспышки холеры в Южно-Сахалинске (табл. 2). Два других крупных генотипа включают преимущественно штаммы из Приморского края (завозные очаги в Уссурийске и Владивостоке и вспышка во Владивостоке) за исключением одного изолята от больного в Южно-Сахалинске. Однолокусные варианты этих генотипов несут в большинстве случаев вариабельную аллель ло-куса VcB (пять штаммов), в двух случаях идентифицированы варианты по локусам VcD (один штамм), VcG (один штамм). В кластере VI присутствует лишь один двухлокусный вариант (DLV — double locus variant) с измененными аллелями VcB и VcD (см. табл. 2).

Седьмой, существенно дистанцированный от всех указанных выше, кластер на дендрограмме объединяет нетоксигенные штаммы, выделенные от больных острыми кишечными инфекциями или транзиторных вибриононосителей в период эпидемиологического благополучия и от хронического вибриононосителя в Омске в 1973 г. Их MLVA-профили характеризуются значительным отличием от токсигенных V. cholerae О1 El Tor как по составу локусов (отсутствие в геноме ло-куса VcB), так и по структурной организации (значительно большее число повторов в локусе VcC и меньшее в VcD и VcG в сравнении с токсигенными штаммами). Изолированный в завозном очаге в Южно-Сахалинске в 1999 г. нетоксигенный штамм локализуется на той же ветви дендрограммы, что и кластер

нетоксигенных V. cholerae. Вибрионы классического биовара формируют на дендрограмме отдельные узлы, наиболее приближенные к генетически измененным вариантам биовара Эль Тор (см. рис. 1).

Обсуждение

Изучение генетического разнообразия популяций токсигенных штаммов V. cholerae в период эпидемических осложнений в Сибирском и Дальневосточном регионах выявило кластеризацию их на генотипы в зависимости от структуры детерминант патогенности (типичные и атипичные генетически измененные вибрионы Эль Тор). Дифференциация атипичных V. cholerae О1 El Tor ассоциируется, в свою очередь, с установленным временем и направлением завоза. Так, в отдельные кластеры распределились изолированные в завозных очагах в Сибири в 1994 и 1997 г. штаммы: II кластер образован завозными из Индии штаммами, два близкородственных кластера III и IV — штаммами из Турции, кластер V — штаммами из Казахстана. Изоляты периода эпидемических осложнений на Дальнем Востоке 1999 г. объединены в отдельный кластер с тремя комплексными генотипами (с их одно- и двухлокусными вариантами). Подобное распределение на различные MLVA-генотипы в зависимости от структуры и локализации СТХ профага показано S. Choi и соавт. [10] при исследовании выделенных в разные периоды пандемии штаммов V. cholerae. При этом максимальная неоднородность также оказалась характерна для атипичных вариантов вибриона Эль Тор. Гетерогенность популяции генетически измененных V. cholerae El Tor установлена Т.А. Кульшань и соавт. [11] при мульти-локусном анализе вариабельных тандемных повторов предпандемичных и пандемичных штаммов V. cholerae El Tor, изолированных в разных регионах России, а также в странах ближнего и дальнего зарубежья. Более того, Н.И. Смирновой и соавт. [12] показано, что распределение на кластеры геновариан-тов вибриона Эль Тор ассоциировано с особенностями организации острова пандемичности VSP-II.

Анализ MLVA-профилей V. cholerae О1 El Tor в пределах отдельных вспышек на Дальнем Востоке также показал гетерогенность популяций этиологического агента, однако строгого соответствия генотипа очагу инфекции не установлено. В частности, на вспышке в Южно-Сахалинске доминирующий генотип (7_22_9_7_8) был идентифицирован во всех анализируемых очагах холеры, а его однолокусные варианты (с изменением структуры локуса VcB) — преимущественно в первом наиболее крупном очаге. Во Владивостоке в период вспышки широко распространились штаммы V. cholerae О1 El Tor двух MLVA-профилей, различающиеся на один повтор в локусе VcB. При этом клинические штаммы в первом очаге и при связанном с ним случаях отнесены к одному генотипу (ал-

лель VcB23), во втором очаге — к двум генотипам (аллели VcB23 и VcB24). Учитывая временной интервал между случаями заболевания в очагах, составляющий практически 1 мес, можно предположить распространение V. cholerae О1 El Tor из первого очага и последующее инфицирование людей во втором очаге. Однако идентифицировать среди исследованных штаммов варианты с аллелью VcB23 из объектов окружающей среды второго очага не удалось. Распространенный в объектах окружающей среды второго очага V. cholerae О1 El Tor с аллелью VcB24 мог оказаться производным варианта возбудителя из первого очага.

С учетом изложенного, эпидемические осложнения по холере на Дальнем Востоке в 1999 г. были обусловлены V. cholerae О1 El Tor с идентичной структурой четырех локусов — VcA, VcC, VcD, VcG и специфичным для конкретной территории числом повторов в локусе ^В: в Южно-Сахалинске — 22 повтора, во Владивостоке — 23—24 повтора. Исключение составляет лишь выделенный в наиболее крупном очаге в Южно-Сахалинске изолят V. cholerae О1 El Tor с генотипом, распространенным во Владивостоке. В соответствии со сложившимся подходом к анализу генетического родства штаммов, по результатам MLVA-типирования к клональным генетически связанным относят изоляты с идентичным аллельным профилем или однолокусные варианты c изменением структуры одного из локусов [13—15]. На основании этого можно заключить, что обусловившие эпидемические осложнения на Дальнем Востоке в 1999 г. варианты возбудителя холеры относятся к генетически родственным клональным. Вместе с тем доминирование на отдельных территориях (Южно-Сахалинск, Приморский край) штаммов специфических генотипов дает основание судить о том, что имел место завоз различных клональных вариантов возбудителя. Идентификация же однолокусных вариантов на территории может быть результатом дивергенции возбудителя в период вспышки. Подтверждением потенциальной возможности трансформации MLVA-генотипа штаммов V. cholerae служит обнаружение однолокусных вариантов среди спонтанных лабораторных мутантов, утративших гены холерного токсина при пассаже на питательных средах, а также установленная ранее [16] способность к изменению генотипа холерного вибриона в экспериментальных условиях.

Полученные нами результаты по полиморфизму структуры локусов вариабельных тандемных повторов V. cholerae О1 El Tor в период вспышек холеры согласуются с представленными в отечественной и зарубежной литературе данными молекулярно-эпидемиологического анализа. В частности, неоднородность MLVA-профиля V. cholerae О1, связанная с вариабельностью структуры локуса VcB, установлена на вспышке холеры в Казани [17]. Диверсификация исходного клона определена в период эпидемической вспышки холеры в Демократической Республи-

ке Конго, продолжавшейся в течение 2011—2012 гг. Изоляты одного MLVA-профиля и их однолокусные варианты были идентифицированы в первую неделю вспышки, затем произошла клональная дивергенция возбудителя параллельно с пространственно-временным распространением вспышки на территории [18]. В период вспышки холеры в Гане в 2014 г. идентифицированы одно- и двухлокусные варианты V. cholerae О1, входящие в один клональный комплекс [19]. Полиморфизм аллельных профилей как в течение одной вспышки, так и в динамике в одном очаге и в образцах клинического материала от одного больного установлен при изучении генетического родства штаммов холерного вибриона в Бангладеш [14, 20, 21]. Следует заметить, что в клиническом материале от контактировавших с больным в очаге обнаруживались не только однолокусные варианты V. cholerae, но и генетически не связанные со штаммом от больного изоляты с различием по трем, четырем и пяти локусам [20]. Такие данные позволяют судить о клональном полиморфизме возбудителя, циркулирующего в очагах инфекции на эндемичных территориях. Однако выделение от больных в очаге в Бангладеш и в более поздние сроки исследования от контактировавших с больными V. cholerae О1 с идентичным или сходным аллельным профилем свидетельствует о селективном преимуществе отдельных клональных вариантов возбудителя. Клональная гетерогенность установлена также на вспышках холеры в двух сельских районах Бангладеш [22]. В то же время Н. Zhou и соавт. [23] при анализе зарегистрированных в Китае эпидемических осложнений показали высокую клональность штаммов V. cholerae на каждой из 7 анализируемых вспышек с идентификацией субклона лишь в одном случае (редукция одного повтора в локусе Vc0437, соответствующему VcD).

Установленное отсутствие строгой территориальной приуроченности MLVA-генотипов вспышечных штаммов V cholerae, возможность трансформации ал-лельного профиля свидетельствуют о недостаточной эффективности основанного на анализе 5 локусов вариабельных тандемных повторов подхода к типирова-нию возбудителя холеры при углубленном анализе отдельных эпидемических осложнений. Однако согласованность MLVA-профиля с периодом и направлением импортации возбудителя определяет метод в качестве информативного при анализе завозов уникальных клонов на территорию в рамках долгосрочного эпидемиологического анализа. В данном контексте оказалась информативно сокращенная схема MLVA-типирования по трем локусам (^С, VcD, VcG): дифференциация сибирских и дальневосточных токсиген-ных штаммов V cholerae на группы при таком подходе согласуется с установленным по результатам полногеномного секвенирования распределением их на волны 7-й пандемии [24] (рис. 2), впервые описанные A. Mutreja и соавт. [25]. Корреляция результатов MLVA-типирования с распределением на генотипы на

? ? * ?

МП

II

III

1-441 Vibrio cholerae eltor Ot Inaba 1-441 Omsk 1972

1-475 Vibrio cholerae eltor Ot Inaba I-475 Omsk 1972

1-559 Vibrio cholerae eltor 01 Inaba 1-559 Barnaul 1973

1-561 Vibrio cholerae eltor Ol Inaba 1-561 Barnaul 1973

I-564 Vibrio cholerae eltor Ol Inaba I-564 Barnaul 1973

I-565 Vibrio cholerae eltor Ol Inaba I-565 Barnaul 1973

I-570 Vibrio cholerae eltor Ol Inaba t-570 Krasnoyarsk 1973

1-190 Vibrio cholerae eltor Ol Ogawa 1-190 Yakutsk 1970

1-1183 Vibrio cholerae eltor Ol Ogawa 1-1183 Omsk 1994

1-1184 Vibrio cholerae eltor 01 Ogawa 1-1184 Omsk 1994

И186 Vibrio cholerae eltor Ol Ogawa 1-1186 Omsk 1994

1-1181 Vibrio cholerae eltor Ol Ogawa 1-1181 Novosibirsk 1994 *

1-1188 Vibrio cholerae eltor Ol Hikoshima 1-1188 Barnaul 1994

1-1298 Vibrio cholerae eltor Ol Ogawa 1-1298 Yuzhrvo-Sakhal insk 1999

М300 Vibrio cholerae eltor Ol Ogawa 1-1300 Yuzhrvo-Sakhal insk 1999 *

1-1301 Vibrio cholerae eltor Ol Ogawa 1-1301 Yuzhrw-Sakhal insk 1999

1-1302 Vibrio cholerae eltor Ol Ogawa 1-1302 Yuzhr»o-Sakhal insk 1999

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

1-1307 Vibrio cholerae eltor Ol Ogawa 1-1307 Yuzhno-Sakhalinsk 1999

1-1310 Vibrio cholerae eltor Ol Ogawa 1-1310 Yuzhrto-Sakhaiinsk 1999

1-1324 Vibrio cholerae eltor Ol Ogawa 1-1324 Vladivostok 1999

1-1335 Vibrio cholerae eltor Ol Ogawa 1-1335 Usuriisk 1999

1-1336 Vibrio cholerae eltor Ol Ogawa 1-1336 Usunisk 1999

1-1338 Vibrio cholerae eltor Ol Ogawa 1-1338 Vladivostok 1999

И 345 Vibrio cholerae eltor Ol Ogawa 1-1345 Vladivostok 1999

19-99-V Vibrio cholerae eltor Ol Ogawa 19-99-V Vladivostok 1999

1-1319 Vibrio cholerae eltor Ol Ogawa 1-1319 Yuzhno-Sakhal insk 1999

1-1263 Vibrio cholerae eltor Ol Ogawa 1-1263 Irkutsk 1997 *

1-1264 Vibrio cholerae eltor Ol Ogawa 1-1264 Achinsk 1997

1-1265 Vibrio cholerae eltor Ol Ogawa 1-1265 Achinsk 1997

1-1185 Vibrio cholerae eltor Ol Ogawa 1-1185 Omsk 1994

1-1187 Vibrio cholerae eltor Ol Ogawa 1-1187 Barnaul 1994 #

Рис. 2. UPGMA-денодрограмма, построенная на основании выборочного анализа исследуемых штаммов по трем ло-кусам (VcC, VcD, VcG).

I, II, III — волны распространения холеры; * — штаммы V. cholerae 01 Ei Tor, для которых определена нуклеотидная последовательность генома [24].

основании анализа полных геномов возбудителя холеры показана при изучении закономерностей распространения возбудителя во время крупных осложнений на эндемичных территориях Бангладеш [26], Мозамбика [27], что определяет актуальность дальнейшего изучения особенностей геномной структуры возбудителя холеры с применением технологий высокопроизводительного секвенирования.

Заключение

Изолированные при осложнениях по холере в Сибирском и Дальневосточном регионах России

ЛИТЕРАТУРА/REFERENCES

1. Актуальные проблемы эпидемиологии инфекционных болезней в Сибири. Под ред. член-корр. РАМН, проф. Онищенко Г.Г. М.: ВУНЦ МЗ РФ; 1999. Actual problems of epidemiology of infectious diseases in .Siberia [Aktual'nye problemy epidemiologii infektsionnykh bolezney v Sibiri]. Pod red. chlen-korr. RAMN, prof. Onishchenko G.G. M.: VUNTs MZ RF; 1999. (In Russ.).

2. Онищенко Г.Г., Марамович А.С., Голубинский Е.П., Маслов Д.В., Вершкова Т.И., Урбанович Л.Я. и др. Холера на Дальнем Востоке Рос-

штаммы V. cholerae 01 Ei Tor характеризуются установленной на основании MLVA-типирования гетерогенностью генетической организации, согласующейся с периодом и направлением их завоза на территорию. При отдельных вспышках холеры выявлена клональность этиологического агента с идентификацией близкородственных субклонов, формирование которых могло быть результатом пребывания возбудителя в объектах окружающей среды или пассажа через восприимчивый организм.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

The authors declare no conflicts of interest.

сии. Сообщение 1. Эпидемиологическая характеристика вспышки холеры Эльтор в г. Владивостоке. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2000;5:26-31.

Onishchenko GG, Maramovich AS, Golubinskiy EP, Maslov DV, Vershkova TI, Urbanovich LYa, et al. Cholera in the Far East of Russia. Communication 1. Epidemiological characteristics of the Eltor cholera outbreak in Vladivostok. Zhurnal mikrobiologii, epidemiologii i immunobiologii. 2000;5:26-31. (In Russ.).

3. Онищенко Г.Г., Марамович А.С., Голубинский Е.П., Папиренко Е.В., Ганин В.С., Бурый В.Л. и др. Холера на Дальнем Востоке России. Сообщение 2. Эпидемиологическая характеристика вспышки холеры Эль Тор в г. Южно-Сахалинск. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2000;5:31-35.

Onishchenko GG, Maramovich AS, Golubinskiy EP, Papirenko EV, Ganin VS, Buryy VL, et al. Cholera in the Far East of Russia. Communication 2. Epidemiological characteristics of the outbreak of cholera El Tor in Yuzhno-Sakhalinsk. Zhurnal mikrobiologii, epidemiologii i immunobiologii. 2000;5:31-35. (In Russ.).

4. Миронова Л.В., Балахонов С.В., Урбанович Л.Я., Кожевникова АС., По-ловинкина В.С., Куликалова Е.С., Афанасьев М.В. Молекулярно-гене-тический анализ эпидемически опасных штаммов Vibrio cholerae eltor, изолированных в Сибирском и Дальневосточном регионах России. Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2012;30(2):13-20. Mironova LV, Balakhonov SV, Urbanovich LYa, Kozhevnikova AS, Polovink-ina VS, Kulikalova ES, Afanas'ev MV. Molecular-genetic analysis of Vibrio cholerae El Tor strains of epidemic risk isolated in Siberian and Far East regions of Russia. Molekulyarnaya genetika, mikrobiologiya i virusologiya. 2012;30(2):13-20. (In Russ.).

5. Ильина Т.С. Миниатюрные многократно повторяющиеся элементы бактерий: структурная организация и свойства. Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2010;28(4):3-10.

Il'ina TS. Miniature repetitive mobile elements bacteria: structural organization and properties. Molekulyarnaya genetika, mikrobiologiya i virusologiya. 2010;28(4):3-10. (In Russ.).

6. Lindstedt BA. Multiple-locus variable number tandem repeats analysis for genetic fingerprinting of pathogenic bacteria. Electrophoresis. 2005;26(13):2567-2582. https://doi.org/10.1002/elps.200500096

7. Водопьянов АС., Водопьянов С.О., Мишанькин М.Б., Сучков И.Ю., Ми-шанькин Б.Н. Вариабельные тандемные повторы, выявленные при компьютерном анализе генома Vibrio chole^. Биотехнология. 2001;6:85-88. Vodop'yanov AS, Vodop'yanov SO, Mishan'kin MB, Suchkov IYu, Mi-shan'kin BN. Variable tandem repeats, revealed in computer analysis of the genome Vibrio cholerae. Biotekhnologiya. 2001;6:85-88. (In Russ.).

8. Danin-Poleg Y, Cohen LA, Gancz H, Broza YY, Goldshmidt H, Malul E, et al. Vibrio cholerae Strain Typing and Phylogeny Study Based on Simple Sequence Repeats. J Clin Microbiol. 2007;45(3):736-746. https://doi.org/10.1128/JCM.01895-06

9. Hunter PR, Gaston MA. Numerical index of the discriminatory ability of typing systems: an application of Simpson's index of diversity. J Clin Microbiol. 1988;26(11):2465-2466.

10. Choi SY, Lee JH, Jeon YS, Lee HR, Kim EJ, Ansaruzzaman M, et al. Mul-tilocus variable-number tandem repeat analysis of Vibrio cholerae O1 El Tor strains harbouring classical toxin B. J Med Microbiol. 2010;59(7):763-769. https://doi.org/10.1099/jmm.0.017939-0

11. Кульшань Т.А., Краснов Я.М., Лозовский Ю.В., Смирнова Н.И. Молекулярное типирование методом MLVA типичных и генетически измененных природных штаммов Vibrio cholerae биовара Эль Тор. Проблемы особо опасных инфекций. 2012;114:39-43.

Kul'shan' TA, Krasnov YaM, Lozovskiy YuV, Smirnova NI. Molecular typing by MLVA method of typical and genetically modified natural strains of Vibrio chol-erae biovar El Tor. Problemy osobo opasnykh infektsiy. 2012;114:39-43. (In Russ.). https://doi.org/10.21055/0370-1069-2012-4-39-43

12. Смирнова Н.И., Кульшань Т.А., Краснов Я.М. MLVA-типирование клинических штаммов Vibrio choleraе, изолированных в разные периоды текущей пандемии. Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2015;33(1):15-22.

Smirnova NI, Kul'shan' TA, Krasnov YaM. MLVA-typing of clinical strains of Vibrio cholerae isolated at different periods of the current pandemic. Molekul-yarnayagenetika, mikrobiologiya i virusologiya. 2015;33(1):15-22. (In Russ.).

13. Ghosh R, Nair GB, Tang L, Morris JG, Sharma NC, Ballal M, et al. Epi-demiological study of Vibrio cholerae using variable number of tandem repeats. FEMS Microbiol. Lett. 2008;288(2):196-201. https://doi.org/10.1111/j.1574-6968.2008.01352.x

14. Rashed SM, Azman AS, Alam M, Li S, Sack DA, Morris JGJr, et al. Genetic variation of Vibrio cholerae during outbreaks, Bangladesh, 2010—2011. Emerg Infect Dis. 2014;20(1):54-60. https://doi.org/10.3201/eid2001.130796

15. van Belkum A, Tassios PT, Dijkshoorn L, Haeggman S, Cookson B, Fry NK, et al. Guidelines for the validation and application of typing methods for use in bacterial epidemiology. J Clin Microbiol Infect. 2007;13(3):1-46. https://doi.org/10.1111/j.1469-0691.2007.01786.x

16. Mирoнoва Л.В., Хунхеева Ж.Ю., Басов E.A., Пономарева АС., Mnr-кеева С.К., Балахонов С.В. Aнализ стабильности генотипа Vibrio chol-erae в условиях низкой температуры и дефицита питательных веществ. Проблемы особо опасных инфекций. 2016;3:52-56.

Mironova LV, Khunkheeva ZhYu, Basov EA, Ponomareva AS, Mitkeeva SK, Balakhonov SV. Analysis of Vibrio cholerae Genotype Stability at Low Temperature and Nutrients Deficiency. Problemy osobo opasnykh infektsiy. 2016;3:52-56. (in Russ.).

https://doi.org/10.21055/0370-1069-2016-3-52-56

17. Oнищенкo Г.Г., Ломов Ю^., Mишанькин Б.^, Mазрухo Б.Л., Подо-синникова Л.С., Кудрякова Т.А и др. Характеристика холерных вибрионов Эль Тор, выделенных в г. Казань в 2001 г. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2002;2:3-6. Onishchenko GG, Lomov YuM, Mishan'kin BN, Mazrukho BL, Podosinnikova LS, Kudryakova TA, et al. Characteristics of cholera Vibrio El Tor, isolated in Kazan in 2001. Zhurnal mikrobiologii, epidemiologii i im-munobiologii. 2002;2:3-6. (in Russ.).

18. Moore S, Miwanda B, Sadji AY, Thefenne H, Jeddi F, Rebaudet S, et al. Relationship between Distinct African Cholera Epidemics Revealed via MLVA Haplotyping of 337 Vibrio cholerae Isolates. PLoS Negl Trop Dis. 2015;9(6):e0003817. eCollection 2015. https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0003817

19. Eibach D, Herrera-León S, Gil H, Hogan B, Ehlkes L, Adjabeng M, et al. Molecular Epidemiology and Antibiotic Susceptibility of Vibrio cholerae Associated with a Large Cholera Outbreak in Ghana in 2014. PLoS Negl Trop Dis. 2016;10(5):e0004751. eCollection 2016 May. https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0004751

20. Kendall EA, Chowdhury F, Begum Y, Khan AI, Li S, Thierer JH, et al. Re-latedness of Vibrio cholerae O1/O139 isolates from patients and their household contacts, determined by multilocus variable-number tandem-repeat analysis. J Bacteriol. 2010;192(17):4367-4376. https://doi.org/10.1128/JB.00698-10

21. Mohamed AA, Oundo J, Kariuki SM, Boga HI, Sharif SK, Akhwale W, et al. Molecular epidemiology of geographically dispersed Vibrio cholerae, Kenya, January 2009 — May 2010. Emerg Infect Dis. 2012;18(6):925-931. https://doi.org/10.3201/eid1806.111774

22. Stine OC, Alam M, Tang L, Nair GB, Siddique AK, Faruque SM, et al. Seasonal cholera from multiple small outbreaks, rural Bangladesh. Emerg Infect Dis. 2008;14(5):831-833. https://doi.org/10.3201/eid1405.071116

23. Zhou H, Cui Z, Diao B, Zhang C, Pang B, Zhang L, Kan B. A three-loci variable number of tandem repeats analysis for molecular subtyping of Vibrio cholerae Ol and O139. Foodborne Pathog Dis. 2013;10(8):723-730. https://doi.org/10.1089/fpd.2012.1441

24. Mironova LV, Gladkikh AS, Ponomareva AS, Feranchuk SI, Bochalgin NO, Basov EA, et al. Comparative genomics of Vibrio cholerae El Tor strains isolated at epidemic complications in Siberia and at the Far East. Infect Genet Evol. 2018;17:60:80-88. https://doi.org/10.1016/j.meegid.2018.02.023

25. Mutreja A, Kim DW, Thomson NR, Connor TR, Lee JH, Kariuki S, et al. Evidence for several waves of global transmission in the seventh cholera pandemic. Nature. 2011;477(7365):462-465. https://doi.org/10.1038/nature10392

26. George CM, Rashid M, Almeida M, Saif-Ur-Rahman KM, Monira S, Bhuyian MSI, et al. Genetic relatedness of Vibrio cholerae isolates within and between households during outbreaks in Dhaka, Bangladesh. BMC Genomics. 2017;18(1):903. https://doi.org/10.1186/s12864-017-4254-9

27. Garrine M, Mandomando I, Vubil D, Nhampossa T, Acacio S, Li S, et al. Minimal genetic change in Vibrio cholerae in Mozambique over time: Multilocus variable number tandem repeat analysis and whole genome sequencing. PLoS Negl Trop Dis. 2017;11(6):e0005671. eCollection 2017 Jun.

https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0005671

Поступила в редакцию 19.04.18 Received 19.04.18 После доработки 14.06.18 Revised 14.06.18 Принята к публикации 14.06.18 Accepted 14.06.18

Аннотация научной статьи по биологическим наукам, автор научной работы — Миронова Л.В., Пономарева А.С., Хунхеева Ж.Ю., Гладких А.С., Балахонов С.В.

Похожие темы научных работ по биологическим наукам , автор научной работы — Миронова Л.В., Пономарева А.С., Хунхеева Ж.Ю., Гладких А.С., Балахонов С.В.

Genetics diversity of Vibrio cholerae O1 El Tor during epide- mic complications in Siberian and the Far Eastern regions

Текст научной работы на тему «ГЕНЕТИЧЕСКОЕ РАЗНООБРАЗИЕ VIBRIO CHOLERAE О1 EL TOR ПРИ ЭПИДЕМИЧЕСКИХ ОСЛОЖНЕНИЯХ В СИБИРСКОМ И ДАЛЬНЕВОСТОЧНОМ РЕГИОНАХ»