CC BY
138
ГЕНЕТИЧЕСКИЙ ПОЛИМОРФИЗМ И ЭФФЕКТИВНОСТЬ ПРОТИВОВИРУСНОЙ ТЕРАПИИ ПРИ ХРОНИЧЕСКОМ ВИРУСНОМ ГЕПАТИТЕ С*
Л.И. Николаева, Е.И. Самохвалов, С.В. Альховский
Лабораторя генно-инженерных препаратов ФГБУ «НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановш^го» ул. Гамалеи, 16, Москва, Россия, 123098
А.В. Колотвин, Л.М. Самоходская
ГУНУ факультет фундаментальной медицины МГУ им. М.В. Ломоносова Ломоносовский пр., 31, стр. 5, Москва, Россия, 119192
В.В. Макашова
Клинический отдел инфекционной патологии
ФГУН «ЦНИИ эпидемиологии» ул. Новогиреевская, 3а, Москва, Россия, 111123
А.К. Токмалаев
Кафедра инфекционных болезней с курсом эпидемиологии Медицинский факакультет
Российский университет дружбы народов ул. Миклухо-Маклая, 8, Москва, Россия, 117198
Цель исследования — выявить роль генетического полиморфизма вируса гепатита С, выражающегося, прежде всего, в существовании генотипов/субтипов вируса, и однонуклеотидного полиморфизма (ОНП) генов пациентов с хроническим гепатитом С в формировании устойчивого вирусологического ответа (УВО) на противовирусную терапию. Изучены образцы крови от 100 пациентов восточно-славянского происхождения с разным ответом на терапию. Установлено, что на вероятность достижения УВО среди изученных ОНП семи генов влияют отдельные аллельные варианты генов IL-1ß, IL-28B, TGF-ß1 и генотипы вируса.
Ключевые слова: хронический вирусный гепатит С, вирусологический ответ, геном, полиморфизм, генотипы.
Вирусный гепатит С — повсеместно распространенное инфекционное заболевание, вызываемое парентерально передающимся вирусом гепатита С (ВГС). Для этого вируса характерно частое формирование хронической инфекции, которая постепенно прогрессирует, приводя к развитию фиброза, к циррозу печени у трети больных и, реже, к гепатоцеллюлярной карциноме. В последние годы возрастает интерес к изучению влияния полиморфизма генома ВГС и отдельных генов больных людей на формирование устойчивого вирусологического ответа (УВО) при противовирусной терапии (ПВТ).
ВГС относится к сем. Flaviviridae, род. Hepacivirus. Геном вируса представлен одноцепочечной РНК, которая имеет полиморфные участки, что привело к необ-
* Данное исследование поддержано грантом РФФИ офи-ц 09-04-13853.
ходимости классифицировать вирус на генотипы и субтипы, каждый из которых имеет разную чувствительности к ПВТ. На генетическое разнообразие вируса накладывается полиморфизм генов людей, что тоже вносит свой вклад в вероятность достижения УВО при ПВТ.
В настоящее время выявляют несколько основных групп человеческих генов, для которых показана зависимость между их полиморфизмом и вариантами течения хронического гепатита С (ХГС). Это гены, определяющие особенности иммунного ответа, контролирующие продукцию и деградацию внеклеточного мат-рикса, кодирующие вазоактивные пептиды, вовлеченные в окислительный стресс, участвующие в метаболизме липидов, контролирующие катаболизм эндогенных и экзогенных молекул [1]. Несмотря на значительное число исследований, посвященных поиску взаимосвязи между аллельными вариантами генов-кандидатов и ответом на ПВТ, убедительные данные установлены для небольшого их числа. При этом в ряде исследований получены противоречивые данные.
Перечисленные причины определяют актуальность проведения исследования. Учитывая влияние иммунных реакций и повышенного содержания железа на эффективность ПВТ, нами был исследованы ОНП генов, продукты которых участвуют в этих процессах, — IL-1p, IL-6, IL-10, 1Ь-28В, TNF-a, TGF-^1 (цитокины) и HFE (белок-регулятор обмена железа)
Методы исследования. Исследованы образцы крови от 51 мужчины и 49 женщин восточно-славянского происхождения (средний возраст 38,8 ± 1,6 г.). У всех больных был выявлен ХГС без других гепатитов и ВИЧ-инфекции, стадии фиброза печени перед началом терапии имели значение от минимальной до F3 (по системе METAVIR). Больным был проведен 24- и 48-недельный курс терапии ПЕГ-интерфероном-a в комбинации с рибавирином. Длительность курса терапии зависела от субтипа вируса. Через 6 месяцев после окончания терапии были сформированы группы больных c УВО и без него (БВО).
РНК ВГС выявляли методом ОТ-ПЦР, используя тест-систему «Ампли-Сенс-100-R» («ИнтерЛабСервис», Россия), или по методике, описанной ранее [2]. Ге-нотипирование и определение межгенотипной рекомбинации проводили секвени-рованием областей генома 5'-NTR-core и NS5b и сопоставлением с референс-последовательностями базы данных GenBank NCBI (США). Вирусную нагрузку определяли с помощью количественных тестов «ОТ-гепатоген-С-количественный» («ДНК-технология», Россия) и «РеалБест РНК ВГС» с чувствительностью 15 МЕ/мл («Вектор-Бест», Россия). Определение количества квазивариантов (КВ) по 1-му гипервариабельному региону (1ГВР) белка Е2 проводили методом одноцепочеч-ного конформационного полиморфизма, разделяя продукты ПЦР в градиентном полиакриламидном геле (7—15%) [3].
Выделение геномной ДНК пациентов, условия ПЦР для локусов генов IL-1b (-511 C/T), IL-6 (-174 G/C), IL-10 (-1082 G/A), TNF-a (-238 G/A), TGF-p1 (+915 G/C), (Н63Б, ffi82Y), а также праймеры и анализ продуктов реакции проводили, как описано ранее [4].
Генотипирование полиморфных локусов (rs8099917, rs12979860) гена IL-28B осуществляли методом ПЦР в реальном времени, используя «Комплект реагентов
для определения генетических полиморфизмов IL-28B» (НПО «ДНК-Технология», Россия).
Статистически значимые различия в группах больных рассчитывали с помощью ¿-критерия Стьюдента, %2-критерия и точного метода Фишера. Различия считались достоверными прир < 0,05.
Результаты и обсуждение. Сравниваемые группы больных имели почти равное соотношение мужчин и женщин (табл. 1). Ранее во многих публикациях отмечалось, что женщины чаще достигают УВО, чем мужчины. В наших группах доля мужчин молодого возраста, недавно инфицированных ВГС, была больше, чем доля молодых женщин. Группа БВО была старше, и временной период, от первого обнаружения антител к ВГС до начала лечения, в ней был достоверно больше.
Таблица 1
Характеристика групп больных перед началом терапии
Показатель Группа УВО Группа БВО Достоверность
(п = 50) (п = 50) различии,р
Возраст, годы 37,4 ± 1,4 42,2 ± 1,8 р < 0,05
Длительность ХГС к началу терапии 6,1 ± 0,7 11,5 ± 1,0 р < 0,001
Мужчины 25 (50%) 26 (52%) р > 0,05
Женщины 25 (50%) 24 48(%) р > 0,05
АЛТ, превышение нормы 3,36 ± 0,68 2,54 ± 0,42 р > 0,05
АСТ, превышение нормы 1,68 ± 0,34 1,96 ± 0,38 р > 0,05
Данные по анализу генетических параметров ВГС у больных двух этих групп представлены в табл. 2. В группе с УВО преобладали субтипы вируса 3а и 1Ь, в группе БВО — 1Ь, что согласуется с результатами других исследований [5, 6]. Доля пациентов, инфицированных вирусом субтипа 1Ь и достигших УВО, составила 38,6% (22 пациента из 57), что не противоречит опубликованным сведениям — 36—48% [5, 6]. Количество пациентов, инфицированных вирусом субтипа 3а, достигших УВО в нашем исследовании, составило 67,6% (23 из 34), что входит в диапазон значений, полученных другими авторами — 65—80% [5, 6].
Таблица 2
Генетические параметры ВГС в группах больных
Показатели Группа c УВО (п = 50) Группа c БВО (п = 50)
Субтипы вируса: 1а 1 (2%) 1 (2%)
1Ь 22 (44%) 35 (70%)
1Ь^ 0 2 (4%)
2a 4 (8%) 1 (2%)
3a 23 (46%) 11 (22%)
Количество РНК до ПВТ: > 106 ^/мл) (7,53 ± 3,68) • 105 (8,76 ± 2,86) • 105
30 28
< 106 ^/мл) 20 22
Кол-во РНК через 6 месяцев не определялась (8,62 ± 2,53) • 105
после ПВТ
Кол-во КВ: диапазон 2—5 2—6
и среднее значение 2,83 ± 0,45 3,27 ± 0,36
В обеих группах больных выявлена вариабельность вирусной нагрузки:
4 7
от 2,2 • 10 до 9,1 • 10 . Однако средние групповые показатели виремии перед на-
чалом ПВТ не имели достоверных различий (см. табл. 2). Подобный факт отмечался и другими авторами [6]. Общепризнанно, что при высокой вирусной нагрузке (более 6 • 105 МЕ/мл) вероятность достижения УВО меньше, чем при более низких значениях. Как представлено в табл. 2, различие в количестве пациентов с низкой и высокой вирусной нагрузкой в двух сравниваемых группах больных перед началом терапии было минимальным.
Еще один вирусный генетический параметр, изученный нами, — это количество КВ вирусов по 1ГВР белка Е2. Известно, что набор вирусных частиц, различающихся по этому региону, и их динамика во времени являются важным показателем взаимоотношений ВГС и макроорганизма. Роль вирусных КВ в формировании УВО до сих пор оценивается неоднозначно. В ряде публикаций показано, что при количестве КВ равном 5 или более пациент имеет низкую вероятность достижения УВО [7—9]. Однако этот факт, в других работах, не подтверждается [10, 11]. Возможно, такое противоречие вызвано тем, что были использованы различные методики выделения вирусной РНК и детекции КВ. В нашем исследовании в группе с УВО перед терапией среднее количество КВ было меньше, чем в группе БВО (см. табл. 2). Однако это различие было статистически недостоверным. Близкие нашим количественные показатели получены А.А. Al-Qahtani и соавт. при анализе больных, инфицированных вирусом генотипа 4 [7].
У 2 участников из группы БВО нами была обнаружена межгенотипная рекомбинация вирусной РНК (табл. 2), что свидетельствует о редкости данного явления среди больных Московского региона и совпадает с данными П.Н. Дмитриева и соавт. [12].
Иммунный ответ пациента на ВГС в значительной степени определяется генетическим полиморфизмом генов больного, особенно полиморфизмом генов цитокинов, которые являются медиаторами антивирусного иммунного ответа. ОНП обеспечивает наследуемую генетическую вариацию, которая часто затрагивает регуляторную зону гена и влияет на связывание транскрипционных факторов, что приводит, в свою очередь, к увеличению или уменьшению продукции м-РНК. Провоспалительный цитокин IL-1 ß инициирует и регулирует воспалительные и иммунные процессы (активирует В- и Т-лимфоциты), повышает хемотаксис, фагоцитоз и является медиатором взаимодействий между иммунной и нервной системами. В нашем исследовании обнаружено более частое выявление мажорного (Т/Т) аллельного варианта гена IL-1 ß в группах больных БВО (табл. 3), что не совпадает с данными других авторов [6, 13]. Возможно, расхождения вызваны этническими различиями больных.
Мультифункциональный провоспалительный цитокин IL-6 принимает участие в индукции белков острой фазы, в регуляции созревания В-клеток и продукции иммуноглобулинов, в гемопоэзе и онкогенезе. Установлено, что полиморфизм -174 G/C в промоторной части гена IL-6 влияет на содержание этого цито-кина в крови. Люди с аллельными вариантами G/G и G/C имеют более высокое содержание этого цитокина, чем при генотипе С/С. В нашем исследовании, также как в работе J. Nattermann и соавт., не обнаружено достоверных различий в выявлении отдельных аллельных вариантов в сравниваемых группах больных [14].
Таблица 3
Полиморфизм генов, вовлеченных в вероятность достижения пациентами УВО
Ген, локус и генотип Группа УВО, доля пациентов с данным генотипом Группа БВО, доля пациентов с данным генотипом Достоверность различий,р
IL-1 в, -511, Т/T 2,0% 12,0% p < 0,05
IL-28B, С/С rs12978860 45,4% 20,0% p < 0,01
IL-28B, Т/Т rs8099917 72,7% 45,7% p < 0,01
TGF-P1, +915, G/G G/С 84,0% 16,0% 96,0% 4,0% p < 0,05 p < 0,05
Цитокин IL-10 обладает противовоспалительным эффектом, снижает экспрессию молекул МНС класса I и II и продукцию цитокинов Thl. Полиморфизм в промоторе -1082 G/А приводит к разному содержанию цитокина. Более низкий уровень IL-10 выявляется при генотипе А/А. По данным L.J. Yee и соавт., генотип А/А ассоциирован с достижением пациентами УВО [15]. В нашем исследовании в обеих группах преобладал генотип G/G, достоверных различий не обнаружено. Аналогичные данные получены другими авторами для коренных жителей Пакистана [6].
Недавно выявлено несколько значимых ОНП для гена IL-28B, которые влияют на вероятность достижения УВО у больных, инфицированных ВГС генотипа 1 [16]. Сведений о роли этих полиморфизмов (rs12978860 C/T и rs8099917 T/G) для пациентов восточно-славянского происхождения нет. В нашем исследовании установлено, что у больных, инфицированных вирусом 1 генотипа и достигших УВО, с одинаковой достоверность преобладал как аллельный вариант С/С (rs12978860), так и вариант Т/Т (rs8099917) (см. табл. 3). У пациентов, инфицированных вирусом субтипа 3а и достигших УВО, часто обнаруживались эти протективные ал-лельные варианты гена, но различия между группами больных не достигли достоверной значимости. Возможно, ввиду немногочисленности больных (n < 50) с 3 генотипом ВГС. Однако эту зависимость не удалось обнаружить и другим авторам [16, 17].
При ХГС у некоторых больных отмечается повышенный уровень TNF-a в сыворотке крови и его м-РНК в гепатоцитах печени [6]. Известно, что TNF-a является полифункциональным цитокином, который принимает участие во многих иммунных реакциях организма, регулирует процессы воспаления, стимулирует клеточный иммунный ответ по ТЫ-типу, фагоцитарную и цитотоксическую активность Т-лимфоцитов и вовлечен в регуляцию апоптоза, особенно при инфицировании вирусом. При анализе влияния полиморфизма локуса -238 G/А на вероятность достижения УВО нами не выявлено различий в содержании отдельных аллельных вариантов TNF-a, что совпадает с данными других авторов [6, 18].
Цитокин TGF-^1 снижает иммунный ответ, ингибируя активность NK-клеток и продукцию интерферона-у и IL-12. Его рассматривают как профибротический цитокин. Полиморфизм гена этого цитокина по локусу +915 G/C влияет на про-
дукцию TGF-ß1: генотип G/G приводит к высокой продукции, G/C — к промежуточной и С/С — к низкой. Нами обнаружено более частое выявление генотипа GG в группе пациентов БВО и достоверно преобладание генотипа G/C в группе с УВО (табл. 3).
Почти у 30% пациентов с ХГС выявляется нарушение гомеостаза железа, причиной которого может быть неблагоприятный аллельный вариант HFE, дисфункция обменных процессов из-за хронической ВГС-инфекции и сочетание этих двух факторов. Ген HFE (ген наследственного гемохроматоза) кодирует белок-регулятор метаболизма железа, имеющий однонуклеотидный полиморфизм по нескольким локусам. Наиболее значимыми являются аминокислотные замены ^3D и С282Y в этом белке. Нами не выявлено различий по частоте обнаружения минорных форм (H/D и D/D) в сравниваемых группах больных. Хотя ранее рядом авторов было показано, что пациенты из стран Европы и Азии, имеющие вариант Н/D по 63 аминокислотному остатку, чаще достигают УВО при терапии [19, 20].
Минорная форма гена HFE, при которой происходит замена остатка цистеи-на 282 на тирозин, вовлечена в развитие гемохроматоза. В нашем исследовании не выявлено ассоциации между обнаружением минорных аллелей и большой вероятностью закончить терапию без УВО. Ранее такую зависимость установили для пациентов из Польши и Норвегии [21, 22].
В заключение отметим, что предикторами неблагоприятного результата ПВТ у больных восточно-славянского происхождения являются: инфицирование ВГС субтипа 1b, отсутствие аллельных вариантов С/С (rs12978860) и Т/Т (rs8099917) гена IL-28B и наличие генотипа Т/Т (-511) гена IL-1 ß и генотипа G/G (+915) гена TGF-ß1.
ЛИТЕРАТУРА
[1] Абдуллаев С.М., Самоходская Л.М., Игнатова Т.М. и др. Молекулярный полиморфизм человека: структурное и функциональное разнообразие биомакромолекул. — М.: РУДН, 2007. — Т. 2. — С. 397—458.
[2] Николаева Л.И., Зверев С.Я., Петрова Е.В. и др. Гуморальный ответ на антигены вируса гепатита С при коинфекцировании вирусом иммунодефицита человека 1-го типа // Лабор. диагност. — М. — 2008. — №7. — С. 42—44.
[3] Ramachandran S., Xia G.L., Ganova-Raeva L.M. et al. End-point limiting-dilution real-time PCR assay for evaluation of hepatitis C virus quasispecies in serum: performance under optimal and suboptimal conditions // JVirol. Meth. — 2008. — V.151. — Р. 217—224.
[4] Николаева Л.И., Самоходская Л.М., Макашова В.В. и др. Поиск генетических факторов вируса гепатита С у пациентов с хроническим гепатитом С, ассоциированных с формированием устойчивого вирусологического ответа на противовирусную терапию // В мире вирусных гепатитов. — 2011. — № 1. — С. 26—35.
[5] Asselah T., Estrabaud E., Bieche I. et al. Hepatitis C: viral and host factors associated with non-response to pegylated interferon plus ribavirin // Liver Int. — 2010. — V. 30. — P. 1259—1269.
[6] Abbas Z., Moatter T., Hussainy A., Jafri W. Effect of cytokine gene polymorphisms on histo-logical activity index, viral load and response to treatment in patients with chronic hepatitis C genotype 3 // World JGastroent. — 2005. — V. 11. — Р. 6656—6661.
[7] Al-Qahtani A.A., Kessle G., Cruz D.D. et al. Quasispecies of genotype 4 of hepatitis C virus genomes in Saudi patients managed with interferon alfa and ribavirin therapy // Ann. Saudi Med. — 2010. — V.30. — Р. 109—114.
[8] Moreau I., Levis J., Crosbie О. et al. Correlation between pre-treatment quasispecies complexity and treatment outcome in chronic HCV genotype 3a // J Virol.—2008. — V. 5. — Р. 78—93.
[9] Salmeron J., De Rueda P.M., Ruiz-Extremera A. et al. Quasispecies as predictive response factors for antiviral treatment in patients with chronic hepatitis C // Dig. Dis. Sci. — 2006. — V. 51. — Р. 960—967.
[10] Fan X., Mao Q., Zhou D. et al. High diversity of hepatitis C viral quasispecies is associated with early virological response in patients undergoing antiviral therapy // Hepatol. — 2009. — V. 50. — Р. 1765—1772.
[11] Le Guen B., Squadrito G., Nalpas B. et al. Hepatitis C virus genome complexity correlates with response to interferon therapy: a study in French patients with chronic hepatitis C // Hepatol. — 1997. — V. 25. — Р. 1250—1254.
[12] Дмитриев П.Н., Цыкина М.Н., Серков И.Л. и др. Рекомбинации вируса гепатита С // Мир вирусн. гепатитов — 2009. — № 1. — С. 3—2.
[13] Constantini P.K., Wawrzynowicz-Syczewska M., Clare M. et al. Interleukin-1, interleukin-10 and tumour necrosis factor-alpha gene polymorphisms in hepatitis C virus infection: an investigation of the relationships with spontaneous viral clearance and response to alpha-interferon therapy // Liver — 2002. — V. 22. — P. 404—412.
[14] Nattermann J., Vogel M., Berg N. et al. Effect of the interleukin-6 C174G gene polymorphism on treatment of acute and chronich hepatitis C in human immunodeficiency virus coinfected patients // Hepatol. — 2007. — V. 46. — Р. 1016—1025.
[15] Yee L.J., Tang J., Gibson A. W. et al. Interleukin 10 polymorphizm as predictors of sustained response in antiviral therapy for chronic hepatitis C // Hepatol. — 2001. — V. 33. — Р. 708—712.
[16] Halfon P., Bourliere M., Ouzan D. et al. A single IL-28B genotype SNP rs12979860 determination predicts treatment response in patients with chronic hepatitis C Genotype 1 // Eur. J Gastroenterol. Hepatol. — 2010. — V. 23. — P. 931—935.
[17] Moghaddam A., Melum E., Reinton N. et al. IL-28B genetic variation and treatment response in patients with hepatitis C virus genotype 3 infection // Hepatol. — 2011. — V. 53. — P. 746—754.
[18] He J., Pei X., Xu W. et al. The relationship between tumor necrosis factor-a polymorphisms and hepatitis C virus infection: a systematic review and meta-analysis // Ren. Fail. — 2011. — V. 33. — P. 915—22.
[19] Carneiro M.V., Souza F.F., Teixeira A.C. et al. The H63D genetic variant of the HFE gene is independently associated with the virological response to interferon and ribavirin therapy in chronic hepatitis C // Eur. J Gastroenterol. Hepatol. — 2010. — V. 22. — P. 1204—1210.
[20] Ishizu Y., Katano Y., Honda T. et al. Clinical impact of HFE mutations in Japanese patients with chronic hepatitis C // J Gastroenterol. Hepatol. — 2011. Nov. 18. epub ahead of print.
[21] Sikorska K., Stalke P., Izycka-Swieszewska E. et al. The role of iron overload and HFE gene mutations in the era of perylated interferon and ribavirin treatment of chronic hepatitis C // Med. Sci. Monit. — 2010. — V. 16. — Р. 137—143.
[22] Distante S., Bjoro K., Hellum K.B. et al. Raised serum ferritin predicts nonresponse to interferon and ribavirin treatment in patients with chronic hepatitis C infection // Liver. — 2002. — V. 22. — Р. 269—275.
GENETIC POLYMORPHISMS AND EFFECACY OF ANTIVITAL THERAPY OF CHRONIC VIRAL HEPATITIS С
L.I. Nikolaeva, Е.I. Sамоkhvalov, S.V. Al'khovskiy
Lab. of genetically engineered products D.I. Ivanovsky institute of virology
Gamaleya Str., 16, Moscow, Russia, 123098
A.V. Kolotvin, L^. Samokhodskaya
Lab. of genetic and cellular technology M.V. Lomonosov Moscow State University
Lomonosovsky Av., 31-5, Moscow, Russia, 119192
V.V. Makashova
Clinical department of infection pathology Central institute of epidemiology
Novogireevskaya Str., 3a, Moscow, Russia, 111123
A.R. ^kmalaev
Department of infection diseases with epidemiologic course Peoples' Friendship University of Russia
Miklukho-Maklaya Str., 8, Moscow, Russia, 117198
Aim: to determine influence of genetic polymorphisms of hepatitis C virus and single nucleotide polymorphisms (SNPs) of patients with chronic hepatitis C on achieving sustained virological response (SVR) to antiviral therapy. One hundred blood samples of eastern-Slavonic patients with different response to the therapy were analyzed. It was determined, that among SNPs of 7 human genes only allelic variants of IL-ip, IL-28B, TGF-pi and viral genotypes can influence on probability to achieve SVR. Key words: chronic hepatitis C, virological response, genome, polymorphisms, genotypes.
