CC BY
97
Gene polymorphism of CYP19A1 and CYP1A2 in belarusian patients with serous ovarian cancer
Mikhalenka Alena Petrovna, Institute of Genetics and Cytology NASB, Ph. D., senior researcher, the Laboratory of cryopreservation
of genetic resources, E-mail: michalenko75@mail.ru Chebotareva Natalia Vjacheslavovna, Institute of Genetics and Cytology NASB, researcher, the Laboratory of cryopreservation of genetic resources,
E-mail: michalenko75@mail.ru Krupnova Evelina Vjacheslavovna, Institute of Genetics and Cytology NASB, Ph. D., Associate Professor, Head of the Laboratory of cryopreservation of genetic resources, E-mail: ekrupnova@inbox.ru Shelkovich Svetlana Evgenyevna, Belarusian Medical Academy of Post-Graduate Education, Candidate of Medical Sciences, Associate Professor,
Department of Oncology, E-mail: s.shelkovich@mail.ru Maisenia Alena Nikolaevna, Public Health Institution Minsk City Clinical Oncologic Dispensary, Candidate of Medical Sciences, Associate Professor, Department of gynecological cancer, E-mail: an-el@mail.ru
Gene polymorphism of CYP19A1 and CYP1A2 in belarusian patients with serous ovarian cancer
Abstract: The aim of the research was to study the frequency distribution of polymorphic variants of the genes CYP19A1 and CYP1A2 in belarusian patients with serous ovarian cancer. The highest risk of serous ovarian cancer of Belarusian patients is associated with carrier of genotype 734 СС of rs762551 polymorphism of the gene CYP1A2 (OR=7,41; 95%CI: 2,13-25,73). In this population established the influence of genetic polymorphism rs10046 of the genes CYP19A1 in the risk of serous ovarian cancer in women older than 50 years: CT genotype in a group of patients with serous ovarian cancer had met significantly less than the control group (OR=0,54; 95%CI: 0,32-0,91). Keywords: genetic polymorphism, estrogens, serous ovarian cancer.
Михаленко Елена Петровна, Институт генетики и цитологии НАН Беларуси, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник лаборатории криоконсервации генетических ресурсов
Email: michalenko75@mail.ru
67
Section 2. Biomedical science
Чеботарева Наталья Вячеславовна, Институт генетики и цитологии НАН Беларуси, научный сотрудник лаборатории криоконсервации
генетических ресурсов Email: michalenko75@mail.ru Крупнова Эвелина Вячеславовна, Институт генетики и цитологии НАН Беларуси, кандидат биологических наук, доцент, заведующий лабораторией
криоконсервации генетических ресурсов Email: ekrupnova@inbox.ru Шелкович Светлана Евгеньевна, Белорусская медицинская академия последипломного образования, кандидат медицинских наук, доцент кафедры онкологии,
Email: s.shelkovich@mail.ru Майсеня Елена Николаевна, Минский городской клинический онкологический диспансер, кандидат медицинских наук, доцент, онкогинекологическое отделение
Email: an-el@mail.ru
Генетический полиморфизм CYP19A1 и CYP1A2 у белорусских пациенток с серозным раком яичников
Аннотация: Целью работы было изучение частоты распределения полиморфных вариантов генов CYP19А1 и CYP1A2 у белорусских пациенток с серозным РЯ. Наибольший риск возникновения серозного рака яичников у белорусских пациенток ассоциирован с носитель-ством генотипа 734 СС полиморфизм rs762551 гена CYP1A2 (OR=7,41; 95%CI: 2,13-25,73). В данной популяции пациентов установлено влияние генетического полиморфизма rs10046 гена CYP19A1 на риск развития серозного рака яичников у женщин старше 50 лет: генотип СТ в группе пациенток встречался достоверно реже (OR=0,54; 95%CI: 0,32-0,91).
Ключевые слова: генетический полиморфизм, эстрогены, серозный рак яичников.
Введение. Многочисленные исследования показали, что большая часть злокачественных опухолей женской репродуктивной сферы, включая рак яичников (РЯ), являются гормонозависимыми. Особое место в патогенезе этих заболеваний занимают эстрогены (эстрон и эстродиол), играющие ключевую роль в стимуляции клеточной пролиферации в органах-мишенях. Доказано, что необходимым условием запуска процессов трансформации в клетках-мишенях служит увеличение содержания эстрогенов, в большей степени эстрадиола [1,18-26].
Эстрон и эстрадиол при помощи реакции ароматизации синтезируются из андростенди-
она и тестостерона, соответственно. Ключевым ферментом этой реакции является ароматаза [2,343-375]. В геноме человека имеется одна копия гена ароматазы (CYP19A1), располагающаяся на длинном плече 15 хромосомы. Ген CYP19A1 включает 10 экзонов, девять из которых кодирующие [3,4600-4602]. Ген ароматазы CYP19A1 — высокополиморфный. При этом существуют выраженные межпопуляционные различия в частоте встречаемости полиморфных вариантов гена. Установлено, что некоторые полиморфизмы оказывают влияние на уровень гормонов. Полиморфизмы rs700519 (замена C>T
68
Gene polymorphism of CYP19A1 and CYP1A2 in belarusian patients with serous ovarian cancer
в 264 кодоне), rs60271534 (ТТТА-повторы в ин-троне 4), полиморфизмы в 3’UTR rs10046 (замена c.1531C>T), rs4646 (замена c.1673 G>T) и оказывают влияние на изменение экспрессии ароматазы [4,264-269; 5,1893-1897; 6,250-254].
Важную роль в поддержании гормонального баланса играет ферментативная система деградации эстрогенов, осуществляемая цитохромом Р450. В последние годы в этом процессе доказана роль таких его изоформ, как CYP1A1, CYP1A2, которые окисляют эстрогены с образованием субстратов для 2-й фазы метаболизма. Ген CYP1A2 локализован в хромосоме 15g22-gter и содержит 7 экзонов. В настоящее время согласно базе данных NCBI dbSNP database (http://www. ncbi.nlm.nih.gov) идентифицировано около 200 нуклеотидных замен гена CYP1A2. Однако только для полиморфизма rs762551 (замена 734C>A в первом интроне) гена CYP1A2 показана ассоциация с активностью фермента [7, 537-546].
Так как злокачественные опухоли яичников в большинстве случаев являются гормонозависимыми, то изучение генетических ферментов метаболизма эстрогенов у пациенток с РЯ позволит установить их вклад в процесс опухолеобразования. Исходя из вышеизложенного, целью работы было изучение частоты распределения полиморфных вариантов CYP19A1 и CYP1A2 у белорусских пациенток с серозным РЯ.
Материалы и методы исследования. Целевая группа представлена 200 пациентками с серозным РЯ, которые были обследованы и прошли лечение в Минском городском клиническом онкологическом диспансере с июля 2008 г. по март 2011 г. Возраст больных варьировал от 18,7 до 83,5 лет, составлял в среднем 58,1 год. Контрольная группа состояла из 192 женщин без онкопатологии и соответствовала возрасту, наличию сопутствующих заболеваний исследуемой группы. Выделение тотальной ДНК из цельной крови выполняли фенол-хлороформным методом. Были исследованы полиморфизмы rs700519, rs60271534, rs10046, rs4646 гена CYP19A1 и полиморфизм rs762551 гена CYP1A2. Праймеры, использованные в работе, синтезировались ОДО
«Праймтех», Беларусь. Условия ПЦР для каждого из фрагментов были подобраны экспериментально.
Методом анализа полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПЦР-ПДРФ) исследованы полиморфизмы rs762551 и rs700519. Определение полиморфизмов rs10046 и rs4646 осуществлялось методом капиллярного фореза. Терминальную реакцию проводили с использованием коммерческого набора BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit («Applied Biosystems», США). Определение нуклеотидной последовательности проводилось на автоматическом секвенаторе Applied Biosystems 3500 DNA Analyzer. Определение (ТТТА)п повторов гена CYP19A1 осуществляли методом фрагментного анализа с помощью набора реактивов (размерный стандарт S 450, HI-DI-formamide) с последующим анализом продуктов реакции на автоматическом секвенаторе Applied Biosystems 3500 DNA Analyzer. Анализ результатов проводился в программе GeneMapper. Согласно принятым подходам тандемные повторы (ТТТА)7, (ТТТА)8, (ТТТА)9 объединяются в группу «короткие фрагменты» — S (short); тандемные повторы (ТТТА)10, (ТТТА)11, (ТТТА)12 объединяются в группу «длинные фрагменты» — L (long). Для валидации результатов фрагментного анализа у 16 (8%) пациентов было проведено прямое секвенирование исследуемого фрагмента ДНК. Статистическая обработка материала проводилась с использованием программы SNPStats (http://bioinfo.iconcologia.net/SNPstats_web). Результаты в таблице представлены в виде кодоминантной модели. Об ассоциации генотипов с предрасположенностью к РЯ судили по величине отношения шансов (odds ratio, OR). OR указан с 95%-ным доверительным интервалом (95%CI).
Результаты. В таблице представлены результаты анализа данных полиморфизмов у пациенток РЯ и контрольной группе.
В нашем исследовании не выявлено различий по частоте встречаемости генотипов полиморфизмов rs700519, rs60271534, rs 10046, rs4646 гена CYP19A1 у пациенток с РЯ и жен-
69
Section 2. Biomedical science
щин без онкопатологии. Молекулярный анализ полиморфизма rs762551 гена CYP1A2 в группе пациенток с серозным РЯ показал, что частота встречаемости генотипа 734 СС составила 10,5% и была достоверно выше в 6 раз, чем в контрольной группе (OR=7,41; 95%CI: 2,13-25,73).
Существуют выраженные возрастные различия синтеза эстрогенов у женщин. У женщин с сохраненной менструальной функцией эстрогены в основном продуцируются в яичниках, а у женщин в постменопаузе производство эстрогена яичниками резко снижается и основным источником циркулирующих эстрогенов является преобразование андрогенов в эстрогены в периферических тканях (например, жировая ткань) [8, 81-96]. Мы провели анализ частоты распределения полиморфных вариантов CYP19A1 и CYP1A2 у белорусских пациенток с серозным РЯ в разных возрастных группах (таблица).
Была выявлена ассоциация полиморфизма rs 10046 гена CYP19A1 с риском развития РЯ у женщин старше 50 лет. Генотип СТ в группе пациенток старше 50 лет встречался достоверно реже по сравнению с соответствующей контрольной группой (OR=0,54; 95%CI: 0,32-0,91), что указывает на защитную роль этого генотипа у женщин старше 50 лет.
Анализ генетического полиморфизма гена CYP1A2 в разных возрастных группах показал рисковую значимость генотипа 734 СС независимо от возраста пациенток: в группе пациенток старше 50 лет данный генотип встречался у 9,1% (OR=4,60; 95%CI: 1,27- 16.70) и у пациенток младше 50 лет — 15,2%, при этом в контрольной группе младше 50 лет данный генотип не встречался.
Обсуждение. Причины и механизмы возникновения большинства опухолей яичников остаются малоизученными. В последних исследованиях, которые рассматривают влияние на риск развития рака яичников высококалорийной пищи, употребление алкоголя, кофеина, никотина, талька, большинство авторов склоняется к выводу об отсутствии такой связи. В настоящее время наибольшая роль в развитии рака яичников отводится гормональным и генетическим
факторам [9,149-160]. Нарушение метаболизма эстрогенов является одним из факторов развития рака яичников. Поэтому значительный интерес представляет изучение генетического полиморфизма ферментов, ответственных за метаболизм эстрогенов. В нашем исследовании выявлена повышенная рисковая значимость генотипа 734 СС полиморфизма rs762551 гена CYP1A2. Наши результаты согласуются с немногочисленными литературными данными. Так, в работе российских ученых была выявлена высокая частота аллеля C и генотипа 734 СС CYP1A2 у пациенток с раком эндометрия и РЯ [10,189-193]. В 2013 г. Tian Z. и соавт. провели мета-анализ 46 исследований, в котором выявили связь полиморфизма rs762551 гена CYP1A2 с риском возникновения этой онкопатологии и показали, что носительство алелля A снижает риск развития РЯ у европеоидов [11, 168-174].
Известно, что фермент CYP1A2 участвует в метаболизме 40-50% циркулирующих эстрогенов, которые в результате реакций гидроксилиро-вания превращаются в 2-гидроксиэстрогены [12, 1001-1003]. Для полиморфизма rs762551 показана ассоциация с активностью фермента: аллель A детерминирует более высокую активность фермента CYP1A2, а аллель С — низкую активность [7, 537-546]. У носителей генотипа 734 СС, возможно, происходит увеличение фонового уровня эстрогенов вследствие медленной скорости их окисления до неактивных продуктов метаболизма и как результат наблюдается состояние гиперэстрогении. Увеличение концентрации эстрогенов может приводить к неконтролируемой активации эстрогеновых рецепторов (ER), которая в свою очередь приводит к усилению клеточной пролиферации. Можно предположить, что в данном случае канцерогенез развивается по ER-опосредованному механизму [13, 440-461]. В пользу этой гипотезы свидетельствует более высокая частота встречаемости генотипа 734 СС для пациенток младше 50 лет (с сохраненной репродуктивной функцией), у которых происходит синтез, как эстрона, так и эстрадиола. У пациенток с менопаузой отсутствует синтез эстрадиола, а основными гормонами наряду
70
Таблица - Частота распределения полиморфных вариантов генов CYP19A1 и CYP1А2 у исследуемых групп
Генотип Всего Моложе 50 лет Старше 50 лет
Пациенты с РЯ, n=200, n (%) Контроль, n=192, n (%) OR (95%Cl) P-value Пациенты сРЯ, n=46, n (%) Контроль, n=38, n (%) OR (9596CI) P-value Пациенты сРЯ, n=154, n (%) Контроль, n=154, n (%) OR (95%CI) P-value
CYP19A1
rs 10046 TT CT cc 68 (34,0) 92 (46,0) 40 (20,0) 54 (28,1) 107 (55,7) 31 (16,2) 1, 00 0,68 (0,43-1,07) 1,02 (0,57-1,85) 0,16 14 (30,4) 23 (50,0) 9(19,6) 16(42,1) 17 (44,7) 5(13,2) 1,00 1,55 (0,60-4,01) 2,06 (0,56-7,61) 0,49 54(35,1%) 69 (44,8%) 31 (20,1%) 38 (24,7%) 90 (58,4%) 26 (16,9%) 1,00 0,54 (0,32-0,91) 0,84 (0,43-1,63) 0,049
rs4646 GG GT TT 127 (63,5) 65 (32,5) 8 (4,0) 110(57,3) 78 (40,6) 4(2,1) 1,00 0,72 (0,48-1,09) 1,73 (0,51-5,91) 0,17 31 (67,4) 14 (30,4) 1 (2,2) 25 (65,8) 12(31,6) 1 (2,6) 1,00 0,94 (0,37-2,39) 0,81 (0,05-13,5) 0,98 96 (62,.3) 51 (33,1) 7 (4,5) 85 (55,1) 66 (42,9) 3 (2,0) 1,00 0,68 (0,43-1,09) 2,07 (0,52-8,24) 0,12
rs700519 CC CT TT 187 (93,5) 12 (6,0) 1 (0,5) 176 (91,7) 16 (8,3) 0(0) 1,00 0,71 (0,32-1,53) NA (0.00-NA) 0,34 43 (93,5) 3 (6,5) 0(0) 36 (94,7) 2 (5,3) 0(0) 1,00 1,26 (0,20-7,93) 0,81 144 (93,5) 9 (5,8) 1 (0,6) 140 (90,9) 14(9,1) 0(0) 1,00 0,62 (0,26-1,49) NA (0,00-NA) 0,28
rs60271534 ss SL LL 71 (35,5) 98 (49,0) 31 (15,5) 71 (37,0) 96 (50,0) 25 (13,0) 1,00 1,02 (0,66-1,57) 1,24 (0,67-2,31) 0,78 15 (32,6) 24 (52,2) 7(15,2) 15 (39,5) 18 (47,4) 5(13,2) 1,00 1,33 (0,52-3,42) 1,40 (0,36-5,41) 0,81 56 (36,4) 74 (48,0) 24(15,6) 56 (36,4) 78 (50,6) 20(13,0) 1,00 0,95 (0,58-1,55) 1,20 (0,60-2,42) 0,79
CYP1 A2
rs762551 734AA 734CA 734CC 86 (43,0) 93 (46,5) 21 (10,5) 91 (47,4) 98 (51,0) 3 (1,6) 1,00 1,00 (0,67-1,51) 7,41 (2,13-25,7) 0,0005 14 (30,4) 25 (54,4) 7(15,2) 20 (52,6) 18 (47,4) 0(0) 1,00 1,98 (0,80-4,94) NA(0,00-NA) 0,0038 72 (46,8) 68 (44,2) 14 (9,0) 71 (46,1) 80 (51,9) 3 (2,0) 1,00 0,84 (0,53-1,33) 4,60(1,.27-16,7) 0,013
Gene polymorphism of CYP19A1 and CYP1A2 in belarusian patients with serous ovarian cancer
Section 2. Biomedical science
с эстроном являются синтезируемые надпочечниками неклассические фенолстероиды, в метаболизме которых фермент CYP1А2 не участвует. При этом синтез эстрона у женщин с менопаузой осуществляется преобразованием андрогенов в периферических тканях. Локальное повышение концентрации эстрогенов может быть следствием повышения активности фермента ароматазы (CYP 19 А1), которая является ключевым ферментом синтеза эстрогенов из андрогенных предшественников. Можно предположить, что роль ароматазы в риске возникновения рака яичников возрастает с увеличением возраста женщины. В проведенных исследованиях рака эндометрия и рака молочной железы Lundin E. и др. была выявлена рисковая значимость генотипа ТТ полиморфизма rs10046 для пациенток с менопаузой [14, 445-452]. В этом исследовании на выборке 596 здоровых женщин с менопаузой было также показана связь генотипа ТТ с повышенным уровнем циркулирующих эстрогенов. В иссле-
дованиях Даннинг и др. показана ассоциация аллеля C полиморфизма rs10046 с низким уровнем эстрона и эстрадиола [15, 936-945]. В нашем исследовании выявлена защитная роль генотипа СТ у пациенток старше 50 лет. Возможно, носители генотипа СТ имеют промежуточную активность ароматазы и невысокий уровень эстрогенов.
Заключение. Впервые проведено изучение частоты распределения полиморфных вариантов генов CYP19A1 и CYP1A2 у пациенток с серозным раком яичников и женщин без онкопатологии проживающих на территории Республики Беларусь. В нашем исследовании наибольший риск возникновения серозного РЯ ассоциирован с носительством генотипа 734 СС полиморфизма rs762551 CYP1A2. В данной популяции пациенток установлено влияние генетического полиморфизма rs10046 в 3’ нетранслируемой области гена CYP19A1 на риск развития серозного рака яичников у женщин старше 50 лет: генотип СТ в группе пациенток встречался достоверно реже.
Список литературы:
1. Красильников М. А., Щербаков А. М. Успехи молекулярной онкологии, № 1, 2014.
2. Santen R. J. et al. Endocr Rev., Volume 30, № 4, 2009.
3. Sebastian S., Bulun S. E. J Clin Endocrinol Metab, Volume 86, № 10, 2001.
4. Hefler L. A. et al.Cancer, Volume 2, 2004.
5. Haiman C. A. et al. Cancer Res, Volume 67, 2007.
6. Xita N. et al. Fertil. Steril, Volume 94, № 1, 2010.
7. Ghotbi R, Christensen M, Roh HK, Ingelman-Sundberg M. Eur J Clin Pharmacol, Volume 63, № 6, 2007.
8. Bulun S. E. et al. J Steroid Biochem Mol Biol, Volume 106, 2007. Р. 81-96.
9. Charles N. et al.J of Clinical Oncology, Volume 26, № 6, 2008.
10. Mikhailova O. N. et al. The Pharmacogenomics Journal, Volume 6, № 3, 2006.
11. Tian Z. et al. Gene, Volume 524, № 2, 2013.
12. Badawi AF, Cavalieri EL, Rogan EG. Metab Clin Exp, Volume 50, 2001.
13. Choi J. H. et al. Endocr Rev, Volume 28, № 4, 2007.
14. Lundin E. et al. Cancer Epidemiol, Volume 36, № 5, 2012.
15. Dunning A. M. et al. J Natl Cancer Inst, Volume 96, 2004.
72
