CC BY
45
Вопросы общей патологии
ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ВАРИАНТЫ СУР 2D6 И CYP 2C19 И РИСК ОСТРОГО ОТРАВЛЕНИЯ НАРКОТИЧЕСКИМИ АНАЛЬГЕТИКАМИ
Сорокина В. В.*, кандидат медицинских наук
ГБОУ ВПО «Омская государственная медицинская академия» Минздравсоцразвития России,
644043, г. Омск, ул. Партизанская, д. 20
РЕЗЮМЕ Рассмотрены случаи отравления опийными наркотиками при различных концентрациях морфина в крови от малых и сверхмалых (до 0,5 мг/л) до обычных токсических (1-4 мг/л). Установлено, что в случаях малых посмертных концентраций (до 0,5 мг/л) при молекулярно-генетическом исследовании выявляются, как правило, мутантные аллели СУР 2D6*3*4; CYP 2C19*2*3. В случаях обнаружения в крови трупа токсических концентраций обычного значения (1-4 мг/л) обнаруживаются немутантные аллели СУР 2D6*; CYP 2C19*. Это позволяет указывать наличие мутантных аллелей в качестве объективной причины летальных исходов при малых концентрациях наркотика.
Ключевые слова: СУР 2D6; CYP 2C19, генетический полиморфизм, острое отравление, морфин.
* Ответственный за переписку (corresponding author): е-mail: [email protected]
Зарегистрированная в Российской Федерации распространенность острых отравлений опийными наркотиками (героин, морфин и т. д.) при первом применении, а также значительная доля лиц, систематически их употребляющих, обусловливают необходимость поиска специальных подходов к оценке токсического действия опиатов.
Широкое распространение метода количественного определения опиатов в крови показало, что концентрация морфина варьирует у разных лиц от незначительной и малой до 2-3 мг/л [2,4]. При этом в экспертной практике встречаются случаи смерти как при концентрации 2-4 мг/л морфина, так и при его содержании менее 0,5 мг/л [1, 4, 5, 6]. Это позволяет предположить, что индивидуальная переносимость морфина и риск ущерба для здоровья в значительной мере зависят от степени активности ферментов метаболизма ксенобиотиков и полиморфизма генов, кодирующих эти ферменты. В свою очередь, требуются оп-
ределенные оценки этих факторов, без которых смерть от острой дыхательной недостаточности при отравлении героином с его концентрацией в крови 0,5 мг/л без специальных исследований выглядит неубедительно.
В зависимости от скорости метаболизма ксенобиотиков и лекарственных средств выделяют «быстрых», «распространенных» и «медленных» мета-болизаторов [1]. Гены, кодирующие ферменты, которые метаболизируют ксенобиотики, характеризуются значительным полиморфизмом, и наличие делеций или «медленных» аллелей может приводить к дисбалансу процессов детоксикации [8, 9].
СУР 2Р6; СУР 2С19 - изоферменты первой фазы метаболизма ксенобиотиков, морфологическим субстратом для которых, наряду с другими ксенобиотиками, являются алкалоиды опия - морфин, кодеин [1]. Наличие «медленных» аллелей в генах, кодирующих эти изоферменты, приводит к
CYP 2D6 AND CYP 2C19 GENETIC VARIANTS AND RISK OF ACUTE POISONING BY NARCOTIC ANALGETICS Sorokina V. V.
ABSTRACT The article considers the cases of poisoning by thebaic narcotics with blood morphine different concentrations from small and super small ( to 0,5 mg/l) to ordinary toxic concentrations (1-4 mg/l). It was stated that in the cases of small postmortem morphine concentration in blood (to 0,5 mg/l) CYP 2D6*3*4*; CYP 2C19*2*3* mutant alleles were revealed as a rule. In the cases of ordinary postmortem toxic concentrations in blood (1-4 mg/l) CYP 2D6*, CYP 2C19* unmutant alleles were revealed. It allowed to point out the mutant alleles as the objective reason for lethal outcomes in narcotic small concentration.
Key words: CYP 2D6, CYP 2C19, genetic polymorphism, acute poisoning, morphine.
отсутствию синтеза этих ферментов или к синтезу ферментов с низкой активностью.
Целью работы стало выявление генетических маркеров, которые отображают программную регуляцию ферментных систем, участвующих в метаболизме ксенобиотиков, а именно опиатов.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
На базе ГУЗ ООБСМЭ проведено аутопсийное исследование 189 трупов лиц, погибших в связи с употреблением наркотиков в 2005-2007 гг.
Сведения об имевшейся наркотической зависимости в 35 наблюдениях были получены из амбулаторных карт, в 48 случаях - в беседе с родственниками и близкими друзьями умерших, а также из материалов уголовных дел и протоколов осмотра трупа на месте происшествия. На длительное использование наркотиков указывали: следы от внутривенных инъекций различной давности - в 93% случаев, фиброзное очаговое утолщение стенок подкожных вен - в 43,8%, положительный результат количественного определения концентрации морфина в крови - в 83,1%
Выделена группа лиц (130 человек), давность наступления смерти которых на момент осмотра трупа в морге не превышала 12 часов. Сформирована группа контроля - лица до 35 лет, погибшие в результате насильственной смерти и не имеющие признаков употребления наркотических веществ внутривенно (100 человек), давность наступления смерти которых на момент осмотра трупа в морге также не превышала 12 часов.
Проводился забор венозной крови (4-5 мл) с антикоагулянтом и последующим получением взвеси лейкоцитов, из которой выделяли ДНК методом перхлоратной экстракции с этанольным осаждением [7]. Исследование полиморфизма генов изоферментов цитохрома Р450, «медленных» мутантных аллелей CYP 2D6*3*4; CYP2C19*2*3 [8] проводили с помощью полимеразной цепной реакции.
Использованы олигонуклеотидные праймеры, синтезированные в Институте химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН (Новосибирск).
Амплификацию осуществляли в буфере, содержащем 10 мМ Трис-HCl (pH 8,9), 50 мМ KCI, 1,7 мМ MgCI, 0,05% Tween 20 с добавлением 0,2 мМ-го раствора dNTP, 0,5 мкМ-го раствора праймеров, 20 нг ДНК и 1,0 ед. акт. Taq- ДНК-полимеразы. Реакционную смесь в объеме 20 мкл покрывали 40 мкл минерального масла. Полимеразную цепную реакцию проводили на амплификаторе «Тер-цик» («ДНК-Технология», Москва).
Анализ рестрикционных смесей выполняли с помощью электрофореза в 3%-ном агарозном геле с бромистым этидием.
Результаты исследований были статистически обработаны при помощи углового преобразования Фишера и х2. Статистически достоверными считали различия при р < 0,05.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
При исследовании полиморфных вариантов генов CYP 2D6*3*4*6 для удобства анализа, а также поскольку 6-я аллель встречалась редко, полиморфизм гена CYP 2D6 описывали с учетом только 3-й и 4-й аллели. Получены 6 групп с генотипами 1/3, 1/1 и 3/3 соответственно по 3-й аллели и 1/1, 1/4 и 4/4 - по 4-й аллели. После этого вычисляли частоту встречаемости данных генотипов среди исследуемых лиц и в группе контроля , а также частоту встречаемости аллелей соответственно. Достоверный уровень статистической значимости различий был получен при исследовании CYP 2D6*3, аллель 3/3 (табл. 1). Для 4-й аллели достоверный уровень статистической значимости различий выявлен не был, хотя в группе лиц, погибших в связи с употреблением наркотиков, доля наблюдений с генотипом 4/4 была больше.
Распределение генотипов и аллелей CYP 2C19*2*3 в исследуемой группе и группе контроля достоверно не различалось, но количество гомозиготных («медленных») аллелей 2/2 и 3/3 у лиц, погибших в связи с употреблением морфина, возрастало.
В группе гомозиготных носителей «медленных» мутантных аллелей CYP 2D6 и CYP 2C19 были идентифицированы лица в возрасте от 16 до 20 лет со стажем употребления наркотиков от 1 инъекции до 1 года. При этом установлено, что концентрация морфина в крови колебалась от «следовых» количеств до 0,5 мг/л (табл. 2).
«Распространенные» метаболизаторы погибают при средних и высоких концентрациях морфина в крови (1,0-4,0 мг/л).
Затем были проанализированы причины смерти носителей гомозиготных «медленных» мутантных аллелей CYP 2D6 и CYP 2C19. Непосредственной причиной смерти стала острая дыхательная недостаточность. При этом на секции наблюдались признаки острой эмфиземы и дистелектазов в легких, субплевральные кровоизлияния, пери-васкулярные кровоизлияния в стволе головного мозга, острое венозное полнокровие внутренних органов. Следовательно, можно говорить о так называемой «смерти на игле» - при введении сравнительно небольшой дозы наркотического вещества.
Таблица 1. Частота встречаемости генотипов гена СУР 206*3
Генотип Лица, погибшие при употреблении наркотиков Группа контроля Статистическая значимость различий
Количество Частота встречаемости Количество Частота встречаемости
1/1 9 0,08 46 0,46 р < 0,05
1/3 86 0,81 48 0,48 р > 0,05
3/3 23 0,21 6 0,06 р < 0,05
Таблица 2. Распределение лиц исследуемой группы с гомозиготными аллелями СУР 206*3*4 и СУР 2С19*2*3 по концентрации наркотика в крови
Концентрация наркотика в крови трупа Гомозиготные аллели СУР 2Р6*3*4 Гомозиготные аллели СУР 2С19*2*3
3/3 4/4 3/3 2/2
Менее 0,5 мг/л 22 8 1 6
Более 0,5 мг/л 1 1 - 1
Определяющим в морфогенезе острого отравления опиатами является полиморфизм генов, контролирующих скорость первой фазы метаболизма ксенобиотиков. «Медленные» метаболизаторы (гомозиготы по мутантным аллелям СУР 206*3*4; СУР 2С19*2*3) погибают при сверхмалых концентрациях морфина в крови (до 0,5 мг/л). Сравнительный анализ распределения аллелей и генотипов СУР 206*3А и СУР 206*4А показал достоверные различия между лицами, употреблявшими наркотические вещества, и группой контроля.
ВЫВОДЫ
По результатам исследования изоферментов цитохрома Р450 можно сделать предположение, что острые отравления характерны в основном в случаях, когда манифестируют «медленные» метаболизаторы ксенобиотиков - гомозиготные носители «медленных» мутантных аллелей генов СУР 206 и СУР 2С19.
Для оценки спорных и сложных случаев отравления сверхмалыми дозами опиатов (менее 0,5 мг/л) следует помимо морфологической картины и непосредственной причины смерти исследовать генетический полиморфизм СУР 206*3*4. Так, однозначно выявляются «медленные» метаболи-заторы, которые погибают сразу после инъекции обычной и даже небольшой дозы наркотика, в отличие от «распространенных» и «быстрых» ме-таболизаторов, смерть которых происходит, как правило, через несколько лет от начала употребления наркотиков.
Исходя изполученных результатов, можно сделать вывод, что имеется необходимость исследова-
ния полиморфных вариантов генов (СУР 206*3А и СУР 206*4А, СУР 2С19*2А и СУР 2С19*3А) на предмет выявления «медленных» метаболизато-ров, которым нельзя применять с медицинскими и иными целями анальгетики с морфинным циклом.
Учитывая тот факт, что генетическая характеристика метаболизма сохраняется в течение всей жизни, необходимо доводить информацию об имеющихся конкретных вариантах (СУР 206*3А и СУР 206*4А, СУР 2С19*2А и СУР 2С19*3А) до сведения пациента и делать отметку в медици-ской документации. Совершенно очевидно, что эта группа лиц подвержена риску внезапной смерти при любых вариантах употребления веществ с морфинным циклом.
Геномный подход к изучению вариаций индивидуальных реакций организма на введение ксенобиотиков, в том числе и наркотических анальгетиков с морфинным циклом, позволит разработать подходы к индивидуальному дозированию препаратов в зависимости от активности изоферментов (СУР 206*3А и СУР 206*4А, СУР 2С19*2А и СУР 2С19*3А), а также существенно снизить риск развития отравлений. При назначении наркотических анальгетиков с морфинным циклом необходимо учитывать, что изофермент 206 ответствен за метаболизм не только наркотических анальгетиков, но и многих других лекарственных средств, которые, в свою очередь, могут индуцировать или ингибировать его действие, тем самым ускоряя или подавляя метаболизм. Данное обстоятельство может привести к кумуляции лекарственного препарата и развитию нежелательных эффектов и передозировки. Большим преимуществом генотипирования как метода ин-
дивидуализации терапии фармакопрепаратами вообще и наркотическими анальгетиками в частности является постоянство полученных результатов (распространяются на всю жизнь пациента) и малая инвазивность метода. Практически каж-
дый субъект должен знать свою индивидуальную переносимость опиатных наркотиков, что позволит в конечном итоге предотвращать смерть при возможном первом применении наркотических анальгетиков с морфинным циклом.
ЛИТЕРАТУРА
1. Пальцев М. А. Введение в молекулярную медицину. -М., 2004. - С. 196-199.
2. Пиголкин Ю. И., Богомолов Д. В. Морфологические изменения внутренних органов при опийной наркомании // Арх. патологии. - 2002. - Т. 64, № 1. -С. 3-5.
3. Тимофеев И. В. Патология лечения : рук-во для врачей. - СПб., 1999. - С. 76-78.
4. Шабанов П. Д. Наркология : практ. рук-во для врачей. -М., 2003.
5. Шигеев С. В., Жаров В. В. Судебно-медицинское диагностическое значение содержания морфина в
крови и моче // Судебно-медицинская экспертиза. -2005. - № 5. - С. 39-42.
6. Шигеев С. В. Судебно-медицинская оценка острых отравлений опиатами // Пробл. экспертизы в медицине. - 2005. - № 1. - С. 25-26.
7. Johns M., Paulus-Thomas J. Purification of human genomic DNA from whole blood using sodium perchlorate in place of phenol // Annal. Biochem. - 1989. - Vol. 80, № 2. - P. 276-278.
8. Differential expression and function of CYP2C19 isoforms in human intestine and liver / F. Lapple [et al.] // Pharmacogenetics. - 2003. - Vol. 13. - Р. 565-575.
