Научная статья на тему 'Генетические особенности доноров гемопоэтических стволовых клеток, проживающих в Новосибирске'

Генетические особенности доноров гемопоэтических стволовых клеток, проживающих в Новосибирске Текст научной статьи по специальности «Медицина и здравоохранение»

CC BY
63
13
Поделиться
Ключевые слова
ЧЕЛОВЕЧЕСКИЕ ЛЕЙКОЦИТАРНЫЕ АНТИГЕНЫ / АЛЛЕЛИ / ГАПЛОТИПЫ / ЧАСТОТА ВСТРЕЧАЕМОСТИ / НОВЫЕ АЛЛЕЛИ / HUMAN LEUKOCYTE ANTIGEN / ALLELE / GAPLOTYPE / RATE OF FREQUENCY / NEW ALLELE

Аннотация научной статьи по медицине и здравоохранению, автор научной работы — Логинова Мария Александровна, Парамонов И.В., Хальзов К.В., Моор Ю.В.

Проведено HLA-типирование 200 потенциальных доноров гемопоэтических стволовых клеток, проживающих в Новосибирске, по локусам (HLA)-A, -B, -C, -DRB1. В ходе проведенных исследований в изучаемой популяции выявлены два новых аллеля, которые ранее не были зарегистрированы международным Комитетом по номенклатуре факторов HLAсистемы ВОЗ. При изучении частот распределения HLA-аллелей и гаплотипов выявлено 16 аллельных вариантов локуса HLA-A, 24 HLA-B, 13 HLA-C, 13 HLA-DRB1. Частотой встречаемости более 10% обладают следующие аллельные варианты: HLA-A*02 (29,25%), 01 (14%), 03 (13,5%), 24 (10,75%), HLA-B*35 (12,25%), 07 (12%), HLA-C*07 (29,75%), 06 (13%), 04 (12,5%), 12 (11,5%), 03 (10,75%), HLA-DRB1*13 (15,25%), 07 (13,75%), 01 (13%), 11 (12,75%), 15 (12,75%), 04 (10,5%). С использованием программного обеспечения Arlequin v.3.1 было выявлено 239 возможных гаплотипов HLA-A-BC-DRB1. Наиболее часто встречающимися оказались гаплотипы A*01-B*08-C*07-DRB1*03, A*02-B*13-C*06-DRB1*07, A*03-B*35-C*04-DRB1*01 с частотами встречаемости 4,5; 2,75 и 2,75°% соответственно. Распределение аллелей и анализ гаплотипов позволили сравнить изученную популяцию с другими российскими популяциями.

Похожие темы научных работ по медицине и здравоохранению , автор научной работы — Логинова Мария Александровна, Парамонов И.В., Хальзов К.В., Моор Ю.В.,

The genetic characteristics of Novosibirsk donors of hematopoietic stem cells

The HLA-typing was carried out concerning of 200 residents of Novosibirsk, potential donors of hematopoietic stem cells on loci (HLA)-A, -B, -C, -ВКИ1. The study detected in mentioned population two new alleles non-registered previously by the WHO International Committee on nomenclature of factors of HLA-system. The analysis of distribution rates of HLA-alleles and haplotype revealed 16 alleles alternatives of locus HLA-A, 24-HLA-B, 13-HLA-C, 13-HLA-DRB1. The rate of frequency more than 10% is intrinsic to following allele alternatives: HLA-A*02 (29.25%), 01 (14%), 03 (13.5%), 24 (10.75%), HLA-B*35 (12.25%), 07 (12%), HLA-C*07 (29.75%), 06 (13%), 04 (12.5%), 12 (11.5%), 03 (10.75%), HLA-DRB*13 (15.25%), 07 (13.75%), 01 (13%), 11 (12.75%), 15 (12.75%), 04 (10.5%). The application of software Arlequin v. 3.1 established 239 possible gaplotypes HLA-AB-C-DRB1. The gaplotypes A*01-B*08-C*07-DRB1*03, A*02-B*13-C*06-DRB1*07, A*03-B*35-C*04-DRB1*01 with rate of frequency 4.5; 2.75 and 2,75% correspondingly. The The distribution of alleles and analysis of galotypes permitted to compare analyzed population with other Russian populations.

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

Текст научной работы на тему «Генетические особенности доноров гемопоэтических стволовых клеток, проживающих в Новосибирске»

гематология

12. Полетаев А.Б. Иммунофизиология и иммунопатология. М.: МИА; 2008.

19. Бейум А. Лимфоциты: выделение, фракционирование и характеристика. Перевод с английского. М.: Медицина; 1980.

20. Маркушева Л.И., Савина М.И., Тогузов Р.Т., Решина В.М. Ядерные белки хроматина в оценке эффективности лечения больных псориазом. Клиническая лабораторная диагностика. 2000; (7): 18—20.

Поступила 12.12.15

REFERENCES

1. Makarov O.V., Kozlov P.V., Nikolaev N.N., Lutsenko N.N., Rudenko A.V. Ways to improve perinatal morbidity and mortality in preterm pregnancy. Rossiyskiy meditsinskiy zhurnal. 2007; (2): 3—6. (in Russian)

2. Nikitina L.A., Demidova E.M., Sadekova O.Yu., Azarova O.Yu., Bochkov V.N., Samokhodskaya L.M. The role of genetic polymorphisms of methylenetetrahydrofolate reductase C677T, PlA1/PlA2 glycoprotein Ilia, 4G/5G plasminogen activator inhibitor type 1 and R353Q VII factor in the formation of miscarriage. Problemy re-produktsii. 2007; (6): 83—9. (in Russian)

3. Radzinskiy V.E., Mironov A.V., Zapertova E.Yu. Forecasts treatment of miscarriage in I trimester progestogens. Ginekologiya. 2006; 8(4): 15—9. (in Russian)

4. Hoesli I.M., Walter-Gobel I., Tercanli S., Holzgreve W. Spontaneous fetal loss rates in a non-selected population. Am. J. Med. Genet. 2001; 100(2): 106—9.

5. Osipenko L. System Dynamics in Early Health Technology Assessment: Prenatal Screening Technology: Diss. Hoboken; 2005.

6. Hoek A., Schoemaker J., Drexhage H.A. Premature ovarian failure and ovarian autoimmunity. Endocr. Rev. 1997; 18(1): 107—35.

7. Gleicher N., Pratt D., Dudkiewicz A. What do we really know about autoantibody abnormalities and reproductive infertility? Contracept. Fertil. Sex. 1995; 23: 239—54.

8. Sukhikh G.T., Van'ko L.V. Immunology of Pregnancy [Immunologi-ya beremennosti]. Moscow: RAMN; 2003. (in Russian)

9. Talwar G.P. Fertility regulating and immunotherapeutic vaccines reaching human trials stage. Hum. Reprod. Update. 1997; 3(4): 301—10.

10. Poletaev A., Osipenko L. General network of natural autoantibodies as Immunological Homunculus (Immunculus). Autoimmun. Rev. 2003; 2(5): 264—71.

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

11. Burmenskaya O.V., Bayramova G.R., Nepsha O.S.,Trofimov D.Yu., Mullabaeva C.M., Donnikov A.E. et al. State of local immunity in chronic recurrent vulvovaginal candidiasis. Akusherstvo i ginekologiya. 2011; (1): 52—6. (in Russian)

12. Poletaev A.B. Immunophysiology andImmunopathology [Immunofiz-iologiya i immunopatologiya]. Moscow: MIA; 2008. (in Russian)

13. Radhupathy R. Th1-type immunity is incompatible with successful pregnancy. Immunol. Today. 1997; 18(10): 478—51.

14. Bu P., Evrard Y.A., Lozano G., Dent S.Y. Loss of Gcn5 acetyltrans-ferase activity leads to neural tube closure defects and exencephaly in mouse embryos. Mol. Cell Biol. 2007; 27(9): 3405—16.

15. Bi Y., Lv Z., Wang Y., Hai T., Huo R., Zhou Z. et al. WDR82, a key epigenetics-related factor, plays a crucial role in normal early embryonic development in mice. Biol. Reprod. 2011; 84(4): 756—64.

16. Zha S., Sekiguchi J., Brush J.W., Bassing C.H., Alt F.W. Complementary functions of ATM and H2AX in development and suppression of genomic instability. Proc.Natl. Acad. Sci. USA. 2008; 105(27): 9302—6.

17. Lemke H., Lange H. Is there a maternally induced immunological imprinting phase a la Konrad Lorenz. Scand. J. Immunol. 1999; 50: 348—54.

18. Ciccone D.N., Su H., Hevi S., Gay F., Lei H., Bajko J. et al. KDM1B is a histone H3K4 demethylase required to establish maternal genomic imprints. Nature. 2009; 461(7262): 415—8.

19. Beyum A. Lymphocytes: Isolation, Fractionation and Characterization. Baltimore; 1976.

20. Markusheva L.I., Savina M.I., Toguzov R.T., Reshina V.M. Nuclear chromatin proteins in evaluating the effectiveness of treatment of patients with psoriasis. Klinicheskaya laboratornaya diagnostika. 2000; (7): 18—20. (in Russian)

Received 12.12.15

© КОЛЛЕКТИв АвТОРОв, 2016 УДК 615.38:615.361.4-013.3]:575.08

Логинова М.А.1, 2, Парамонов И.в.2, Хальзов К.в.3, Моор Ю.в.3

ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ДОНОРОВ ГЕМОПОЭТИЧЕСКИХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК, ПРОЖИВАЮЩИХ В НОВОСИБИРСКЕ

1ФГБУ РМНПЦ «Росплазма» ФМБА России, 610002, г. Киров; 2ФГБУН Кировский НИИ гематологии и переливания крови ФМБА России, 610027, г. Киров; 3ГБУЗ НСО «Новосибирский центр крови», 630054, г. Новосибирск, Российская Федерация

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

Проведено HLA-типирование 200 потенциальных доноров гемопоэтических стволовых клеток, проживающих в Новосибирске, по локусам (HLA)-A, -B, -C, -DRB1. В ходе проведенных исследований в изучаемой популяции выявлены два новых аллеля, которые ранее не были зарегистрированы международным Комитетом по номенклатуре факторов HLA-системы ВОЗ. При изучении частот распределения HLA-аллелей и гаплотипов выявлено 16 аллельных вариантов локуса HLA-A, 24 — HLA-B, 13 — HLA-C, 13 — HLA-DRB1. Частотой встречаемости более 10% обладают следующие аллель-ные варианты: HLA-A*02 (29,25%), 01 (14%), 03 (13,5%), 24 (10,75%), HLA-B*35 (12,25%), 07 (12%), HLA-C*07 (29,75%), 06 (13%), 04 (12,5%), 12 (11,5%), 03 (10,75%), HLA-DRB1*13 (15,25%), 07 (13,75%), 01 (13%), 11 (12,75%), 15 (12,75%), 04 (10,5%). С использованием программного обеспечения Arlequin v.3.1 было выявлено 239 возможных гаплотипов HLA-A-B-C-DRB1. Наиболее часто встречающимися оказались гаплотипыA*01-B*08-C*07-DRB1*03, A*02-B*13-C*06-DRB1*07, A*03-B*35-C*04-DRB1*01 с частотами встречаемости 4,5; 2,75 и 2,75%% соответственно. Распределение аллелей и анализ гаплотипов позволили сравнить изученную популяцию с другими российскими популяциями.

К л ю ч е в ы е с л о в а: человеческие лейкоцитарные антигены; аллели; гаплотипы; частота встречаемости; новые аллели. Для цитирования: ЛогиноваМ.А., Парамонов И.В., Хальзов К.В., Моор Ю.В. Генетические особенности доноров гемопоэтических стволовых клеток, проживающих в Новосибирске. Клиническая лабораторная диагностика. 2016; 61 (7):422-428

Д л я к о р р е с п о н д е н ц и и: Логинова Мария Александровна, канд. биол. наук, нач. отд. донорства гемопоэтических стволовых клеток ФГБУ РМНПЦ «Росплазма» ФМБА России, 610002, Киров, е-таП: loginova-ma@rosplasma.ru

hematology

DOI 10.18821/0869-2084-2016-61- 7-422-428

Loginova M.A.'-2, Paramonov I.V.2, Khalzov K.V.3, Moor Yu.V.3

THE GENETIC CHARACTERISTICS OF NOVOSIBIRSK DONORS OF HEMATOPOIETIC STEM CELLS

1The The Russian medical R&D production center "Rosplasma" of the Federal medical biological agency of Russia, 610027 Kirov, Russia; 2The Kirovskii research institute of hematology and blood transfusion of the Federal medical biological agency of Russia,610027 Kirov, Russia; 3The Novosibirskii center of blood, 630054 Novosibirsk, Russia

The HLA-typing was carried out concerning of 200 residents of Novosibirsk, potential donors of hematopoietic .stem cells on loci (HLA)-A, -B, -C, -BKH1. The study detected in mentioned population two new alleles non-registered previously by the WHO International Committee on nomenclature of factors ofHLA-system. The analysis of distribution rates ofHLA-alleles and haplotype revealed 16 alleles alternatives oflocus HLA-A, 24-HLA-B, 13-HLA-C, 13-HLA-DRB1. The rate offrequency more than 10% is intrinsic to following allele alternatives: HLA-A*02 (29.25%), 01 (14%), 03 (13.5%), 24 (10.75%), HLA-B*35 (12.25%), 07 (12%), HLA-C*07 (29.75%), 06 (13%), 04 (12.5%), 12 (11.5%), 03 (10.75%), HLA-DRB*13 (15.25%), 07 (13.75%), 01 (13%), 11 (12.75%), 15 (12.75%), 04 (10.5%). The application of software Arlequin v. 3.1 established 239 possible gaplotypes HLA-A-B-C-DRB1. The gaplotypes A*01-B*08-C*07-DRB1*03, A*02-B*13-C*06-DRB1*07, A*03-B*35-C*04-DRB1*01 with rate of frequency 4.5; 2.75 and 2,75%% correspondingly. The The distribution of alleles and analysis of galotypes permitted to compare analyzed population with other Russian populations.

Keywords: human leukocyte antigen; allele; gaplotype; rate offrequency; new allele.

For citation: Loginova M.A., Paramonov I.V., Khalzov K.V., Moor Yu.V. The genetic characteristics of Novosibirsk donors of hematopoietic stem cells. Klinicheskaya Laboratornaya Diagnostika (Russian Clinical Laboratory Diagnostics) 2016; 61 (7) : 422-428(in Russ.)

DOI: 10.18821/0869-2084-2016-61-7-422-428

For correspondence: LoginovaM.A., candidate of biological sciences, head of department of donorship of hematopoietic stem cells. e-mail: loginova-ma@rosplasma.ru

Conflict of interests. The authors declare absence of conflict of interests. Financing. The study had no sponsor support.

Received 31.03.2016 Accepted 10.04.2016

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

Введение. Число потенциальных доноров гемопоэтиче-ских стволовых клеток (ГСК), зарегистрированных в Международном регистре доноров костного мозга (BMDW), превышает 25 000 000 человек [1]. В Международный регистр включены данные 72 регистров из 52 стран мира [1]. Крупнейшими из них являются ИМ^Р в США, DKMS в Германии, Фонд Энтони Нолана в Великобритании и др. Такое количество безвозмездных доноров позволяет трансплантационным центрам, в том числе российским, осуществлять эффективный поиск совместимых доноров гемопоэтических стволовых клеток для пациентов, нуждающихся в аллоген-ной трансплантации ГСК.

Вместе с тем зачастую для российского пациента не удается подобрать совместимого донора в международном регистре. С одной стороны, это обусловлено тем, что в этом регистре наиболее широко представлены доноры, относящиеся к европейским и североамериканским популяциям, для которых характерна относительно низкая частота встречаемости НЬА-аллелей и гаплотипов, специфичных для населения Российской Федерации [2]. С другой стороны, многонациональное (более 180 народов) государство Российская Федерация с населением более чем 143 млн человек представлено в международной базе данных только тремя небольшими региональными регистрами потенциальных доноров гемопоэ-тических стволовых клеток, не обеспечивающими репрезентативность НЪА-гаплотипов, достаточную для эффективного подбора доноров [1].

Общее количество потенциальных доноров ГСК, привлеченных региональными российскими регистрами (Кировским, Санкт-Петербургским, Челябинским, Новосибирским, Екатеринбургским, Самарским и др.), составляет около 40 000. Данные об НЪА-генотипах российских доноров экспонированы в специализированной компьютерной базе данных (BMDS), которая доступна трансплантационным центрам России и Казахстана для удаленного поиска совместимого донора через сеть Интернет [3].

С 2013 г. российские доноры предоставили свои ГСК

более чем для 70 неродственных трансплантаций. Однако для части российских пациентов совместимый донор ГСК по-прежнему не может быть найден, что связано с особенностями распределения HLA-аллелей и гаплотипов у представителей различных российских популяций. Это обусловливает необходимость рекрутирования новых потенциальных доноров ГСК в различных регионах РФ с целью увеличения генетического разнообразия донорских ресурсов, доступных для поиска неродственных доноров.

Целью данного исследования является изучение генетических особенностей потенциальных доноров ГСК, проживающих в Новосибирске.

Материал и методы. В исследование были включены 200 образцов цельной крови, полученных от потенциальных доноров гемопоэтических стволовых клеток, проживающих в Новосибирске. Все доноры были привлечены из числа кадровых доноров крови и ее компонентов ГБУЗ НСО «Новосибирский центр крови» в марте-апреле 2015 г

Препараты ДНК для проведения HLA-типирования были получены из замороженных образцов цельной крови (антикоагулянт — ЭДТА) методом колоночной фильтрации с помощью станции QIAcube с использованием наборов реагентов QIAampDNABloodMiniKit (QIAGEN). Концентрация препаратов ДНК, определенная на спектрофотометре UV-1800 (Shimadzu, Япония), составляла в среднем 25—40 нг/мкл при

соотношении A„„/Ao„ = 1,75^1,95.

260 280 ' '

HLA-типирование по локусам HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DRB1 проводили по технологии SBT (Sequencing Based Typing) с использованием базовых наборов реагентов Al-leleSEQR HLA Sequencing (Abbott, США). Для разрешения неоднозначностей типирования на уровне 2-го знака использовали реагенты для уточнения гетерозиготных неоднозначностей с использованием амплификатов, полученных на стадии амплификации при постановке HLA-типирования с базовыми наборами реагентов.

Капиллярный электрофорез осуществляли с использованием двадцати четырех капиллярного генетического ана-

гематология

Рис. 1. Результат анализа образца № 33276 по локусу А в программном обеспечении SBTEngine ^3.6.1.

лизатора 3500x1 (АppliedBiosystems, США), полученные спечении SBTEngine ^3.6.1 с использованием библиотеки сиквенсы просматривали в программном обеспечении Se- НЬА-аллелей — 1МОТ/НЬА 3.20.0.

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

quencingАna1ysis ^5.2, анализировали в программном обе-

Реагенты для уточнения гетерозиготных неоднозначно-

Рис. 2. Результат анализа образца № 33692 по локусу А в программном обеспечении SBTEngine ^3.6.1.

hematology

cDHA SO ЭО Ijpo 110 120 130 140 ISO ISO 170

fc*ai:01:01:01 SCXCCEA CXCCAXGAGG XAIIICXICA CAXCCSXGXC CCGGCCCGGC CGCGGGGASC CCCGCXICAX CGCCGXGGSC XACGXGGACG ACACGCAGXX

A*69:01 ------------------------a---С--------------------------------------------------------------------

cDNA ISO ISO i 210 220 230 240 250 2«0 270

A»01:0i: 01:01 CGXGCGGTTC GACASCGACG CCSCG&GCCA GAAGAXGGAG CCGCGSGCGC CSXGGAXAGA GCAGSAGGGG CCGGHGTAXI GSSACCAGGA GACACGGAAX

A*S9:01 ---------------------------------G------------------------------------------------------G-A- С---------

cDKA 280 290 300 310 320 330 340 3S0 3£0 370

A*01:01:01:01 ATGAAEGCCC ACXCACAGAC IGACCGAGCG AACCrSWGA CCCXGCGCGG CIACXACAAC CAG&GCGAGS ACGIGXXCICA CACCAXCCAG ATAAICTAIG

A*69:01 G----------G-----------------X- S---------------------------------------С—I-----------G------GG-------

cSNA 380 390 400 410 420 430 440 4S0 4S0 470

A*Q1 :01:01:01 SCXSCGACSX GGGGCCGGAC SGGCGCTTCC XCCGCGGGTA CCGGCAGGAC GCCXSCGACG GCAASGATXA CATCGCCCXG SACCAESACC IGOSCICTIG

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

A-»69:01 -------------T-----X--------------------AC---X----------------------------------A-----------------

сЭНА 480 490 300 510 620 S^30 840 SS0 5€0 570

A*01:01;01:01 GACCGCGGCS GACAXGGCAG CICAGAXCAC CAAGCGGAAG XGGGAGGCGG ХССАЖСЖС GGAGC&GCGG ASAGICXACC XGSAGGGCCG GIGCSTSSAC

A*S9:01 -------------------------С--------A----—-------— С----llJ--------—ТГ-----С-------------AG---------G

cDNA .380 .590 S00 «10

A*01:01:01:01 GGSCXCCGCA GAXAOCXGGA GAACGGGAAG GAGACGCIGC AGCGCACGG

A*€9:01 X-----:--------------------------------------------

Рис. 3. Сравнение последовательностей аллелей А*01:01:01:01 и А*69:01 (в нуклеотидах).

стей выбирали с использованием программного обеспечения HARPs Finder, доступного в режиме онлайн в глобальной сети Интернет [4].

Для подтверждения и описания новых аллелей использовали набор реагентов PROTRANS HLA-A S4 (Protrans, Германия), основанный на технологии моноаллельного сек-венирования. Анализ полученных сиквенсов проводили с использованием программного обеспечения Seq Pilot.

Частоты HLA-аллелей и их гаплотипов были определены методом максимального правдоподобия с помощью алгоритма максимизации ожидания для данных с неизвестной гаметической фазой [5, 6], реализованным в программном обеспечении Arlequin v.3.1. Стандартные отклонения рассчитывали при начальном значении итераций, равном 100. В случае определения одного аллеля индивидуум считали гомозиготным по данному аллелю.

Результаты. В ходе проведения исследования для двух образцов — № 33276 и № 33692 — не было найдено полного соответствия с библиотекой HLA аллелей IMGT/HLA 3.20.0 по локусу HLA-A.

В результате HLA-типирования образца № 33276 был определен следующий генотип: B*39:BMFM, 51:01, C*04:CXBM, 12:AFCTD, DRB1*04:HTWY, 13:ADPGE, А*11, 26 с одним несоответствием базе данных HLA-аллелей. В позиции 54 первого экзона локуса HLA-A вместо С был обнаружен Y. Как видно на рис. 1, четкий двойной пик был выявлен в прямом и обратном направлении.

Для выяснения того, какой из пары аллелей является уже известным, а какой — новым, использовали набор реагентов PROTRANS HLA-A S4, реализующий технологию моноаллельного секвенирования. Полученные данные подтвердили, что образец № 33276 имел по локусу А генотип А*11:01, 26: новый. При этом у нового аллеля в позиции 54-го первого экзона вместо С стоит T. Это приводит к замене 7-го кодона аллеля A*26: новый с GCC на GTC и соответствует замене аминокислоты, кодируемой данным колоном, с аланина на валин.

Последовательности нуклеотидов, полученные с использованием технологии моноаллельного секвенирования, позволили подать заявку о регистрации этого аллеля в между-

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

народной номенклатуре (номер последовательности в базе данных EMBL — LN878290). 30.09.2015 г указанному аллелю был присвоен номер A*26:117 и выдано свидетельство о регистрации нового аллеля.

Для образца № 33692 выявлен следующий генотип: B*52:XX, 58:AJ, C*03:02,12:02, DRB1*11:CTPB, 15:02, A*01, 69, с одним несоответствием базе данных HLA-аллелей в позиции 527 третьего экзона, где вместо Y стоит W, что представлено на рис. 2.

Для выяснения того, какой из пары аллелей является уже известным, а какой -новым, было проведено сравнение последовательностей с помощью инструмента Sequence Alignment, доступного в режиме онлайн в глобальной сети Интернет [7]. Результаты сравнения последовательностей представлены на рис. 3.

Из данных, представленных на рис. 3, следует, что использование постановки двух дополнительных сиквенсовых реакций с применением реагентов для уточнения гетерозиготных неоднозначностей — A2F98A и A2F98T — позволит определить, какой из аллельных вариантов является новым. Результаты постановки сиквенсовых реакций с указанными реагентами для уточнения гетерозиготных неоднозначностей представлены на рис. 3. Анализ данных, представленных на рис. 2, показывает, что реагент для уточнения гетерозиготных неоднозначностей A2F98A, отжигающийся только на последовательность аллеля A*69:01, дает в позиции 527 третьего экзона T, в то время как A2F98T, отжигающийся только на последовательность аллеля A*01:01:01:01, в указанной позиции дает A. На основании этого был сделан вывод о том, что образец № 33692 имеет по локусу A генотип A*69:01, 01:новый. Указанная замена в позиции 527 третьего экзона в аллеле A*01:01:01:01, так же как и в первом случае, приводит к замене аминокислоты. Кодон 152 изменяется с аланина (GCG) на глутаминовую кислоту (GAG).

Для подтверждения нового аллеля и его описания для дальнейшей регистрации в базе данных HLA-аллелей так же, как и в первом случае, использовали технологию моноал-лельного секвенирования. Данные, полученные с помощью набора реагентов PROTRANS HLA-A S4, подтвердили наличие нового аллеля и позволили подать заявку на регистрацию

гематология

Таблица 1

Аллельные варианты HLA-локусов I класса и частоты их встречаемости

A HLA HLA-B HLA-С

Аллельный Частота встре- Стандартное Аллельный Частота встре- Стандартное Аллельный Частота встре- Стандартное

вариант чаемости отклонение вариант чаемости отклонение вариант чаемости отклонение

01 0,140000 0,018110 07 0,120000 0,016945 01 0,032500 0,009280

02 0,292500 0,021035 08 0,082500 0,013934 02 0,050000 0,010502

03 0,135000 0,016868 13 0,072500 0,012926 03 0,107500 0,015455

11 0,057500 0,010955 14 0,027500 0,008964 04 0,125000 0,015257

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

23 0,027500 0,008872 25 0,047500 0,011010 05 0,030000 0,008680

24 0,107500 0,018025 18 0,077500 0,013329 06 0,130000 0,017163

25 0,047500 0,010760 27 0,040000 0,009710 07 0,297500 0,023265

26 0,037500 0,008283 35 0,122500 0,014724 08 0,035000 0,008582

29 0,015000 0,006494 37 0,002500 0,002390 12 0,115000 0,015301

30 0,025000 0,007504 38 0,032500 0,008781 14 0,005000 0,003789

31 0,027500 0,008145 39 0,027500 0,008313 15 0,027500 0,007397

32 0,025000 0,008063 40 0,057500 0,011247 16 0,012500 0,006296

33 0,017500 0,006754 41 0,030000 0,007547 17 0,032500 0,010468

66 0,012500 0,005859 44 0,075000 0,013286

68 0,030000 0,009267 48 0,005000 0,003423

69 0,002500 0,002633 49 0,012500 0,005528

50 0,010000 0,005510

61 0,062500 0,011668

52 0,022500 0,007477

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

54 0,002500 0,002928

55 0,005000 0,003258

56 0,015000 0,005939

57 0,042500 0,010289

58 0,007500 0,004059

данного аллеля (номер последовательности в базе данных ЕМВЬ — Ш878289). 30.09.2015 г указанному аллелю был присвоен номер А*01:196 и выдано свидетельство о регистрации нового аллеля.

Аллельные варианты НЬА-локусов I класса, частоты их встречаемости с соответствующими стандартными отклонениями представлены в табл. 1. Были выявлены 16 аллельных вариантов по локусу НЬА-А, 24 — по локусу НЬА-В, 13 — по локусу НЬА-С.

По данным, представленным в табл. 1, видно, что наибольшей частотой встречаемости обладает аллельный вариант НЬА-А*02 — 29,25%, далее следуют аллельные варианты НЬА-А*01, НЬА-А*03 и НЬА-А*24 с частотами встречаемости 14; 13,5 и 10,75% соответственно. Наименьшей частотой встречаемости обладает аллельный вариант НЬА-А*69, выявленный в одном случае.

Среди аллельных вариантов локуса НЬА-В 6 наиболее часто встречаются НЬА-В*35, НЬА-В*07, НЬА-В*08, НЬА-В*18, НЬА-В*44 и НЬА-В*13. В сумме эти аллели составили 55% от общего числа выявленных аллельных вариантов ло-куса НЬА-В.

Среди аллельных вариантов локуса НЬА-С наибольшей частотой встречаемости обладает аллельный вариант НЬА-С*07 (29,75%), далее в порядке убывания частоты встречаемости следуют НЬА-С*06 (13%), НЬА-С*04 (12,5%), НЬА-С*12 (11,5%) и НЬА-С*03 (10,75%).

Аллельные варианты локуса HLA-DRB1 с частотами встречаемости и соответствующими стандартными отклонениями представлены в табл. 2. По данным, представленным в табл. 2, видно, что в изучаемой популяции выявлено 13 ал-лельных вариантов локуса HLA-DRB1, наибольшей частотой встречаемости из которых обладает аллельный вариант HLA-DRB 1*13 (15,25%), далее следуют аллельные варианты HLA-DRB 1*07, HLA-DRB 1*01, HLA-DRB 1*11 и HLA-DRB 1*15, обладающие примерно одинаковой частотой встречаемости— 13,75; 13, 12,75 и 12,75% соответственно.

Гаплотипы HLA-A-B-C-DRB1 были рассчитаны по ЕМ-алгоритму с помощью программного обеспечения Arlequin. В табл. 3 представлены гаплотипы, частота встречаемости которых — более 1%.

Наибольшей частотой встречаемости обладает га-плотип A*01-B*08-C*07-DRB1*03, далее следуют A*02-B*13-C*06-DRB1*07, A*03-B*35-C*04-DRB1*01

A*01-B*57-C*06-DRB1*07, A*25-B*18-C*12-DRB1*15 A*02-B*18-C*07-DRB 1*11, A*02-B*07-C*07-DRB 1*15 A*02-B*15-C*03-DRB 1*13, A*02-B*27-C*02-DRB 1*16 A*24-B*13-C*06-DRB 1*07, A*30-B*13-C*06-DRB1*07 A*02-B*41-C*17-DRB1*13.

Обсуждение. В настоящее время имеется мало данных о распространенности HLA-A, -B, -С, -DRB1-аллелей и HLA-гаплотипов в различных российских популяциях [8—14]. Большинство исследований по распространенности аллелей

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

Таблица 2

Аллельные варианты локуса HLA-DRB1 и частоты их встречаемости

Аллельный вариант Частота встречаемости Стандартное отклонение

01 0,130000 0,018953

03 0,075000 0,012937

04 0,105000 0,012809

07 0,137500 0,017875

08 0,040000 0,010909

09 0,012500 0,005446

10 0,005000 0,003415

11 0,127500 0,016878

12 0,022500 0,005122

13 0,152599 0,017686

14 0,022500 0,006887

15 0,127500 0,014669

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

16 0,042500 0,0009483

I класса в российских популяциях были проведены серологическим методом [10], а имеющиеся данные молекулярно-биологических исследований содержат информацию преимущественно о частотах встречаемости аллелей локусов

II класса [8, 9, 14]. Это не позволяет оценить, насколько существенно доноры, относящиеся к той или иной российской популяции, должны быть представлены в российском регистре потенциальных доноров ГСК для обеспечения его генетической репрезентативности и обеспечения высокой вероятности успешного подбора неродственного донора для российских пациентов.

Данное исследование позволило получить сведения о частотах встречаемости HLA-аллелей и гаплотипов в популяции г. Новосибирска. В указанной популяции было выявлено 16 HLA-A, 24 HLA-B, 13 HLA-C и 13 HLA-DRB1 аллельных групп.

Таблица 3

HLA-A-B-C-DRB1-гаплотипы в порядке уменьшения частоты встречаемости

Аллельный вариант Частота встречаемости Стандартное отклонение

A*01-B*08-C*07-DRB1*03 0,044987 0,009841

A*02-B*13-C*06-DRB 1*07 0,027500 0,009416

A*03-B*35-C*04-DRB1*01 0,027487 0,009698

A*01-B*57-C*06-DRB1*07 0,020000 0,006801

A*25-B*18-C*12-DRB 1*15 0,020000 0,008186

A*02-B*18-C*07-DRB 1*11 0,017500 0,007366

A*02-B*07-C*07-DRB 1*15 0,014268 0,007894

A*02-B*15-C*03-DRB 1*13 0,012500 0,006434

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

A*02-B*27-C*02-DRB 1*16 0,012500 0,005957

A*24-B*13-C*06-DRB 1*07 0,012500 0,006048

A*30-B*13-C*06-DRB1*07 0,012500 0,006700

A*02-B*41-C*17-DRB 1*13 0,011250 0,005903

Примечание. В общей сложности было определено 239 гаплотипов из 1831 потенциально возможного.

hemaгоlogy

Наиболее часто встречающимися аллельными вариантами локуса НЬА-А являются НЬА-А*02, -А*01, -А*03, -А*24, -А*11, с максимальной частотой встречаемости у НЬА-А*02 (29,25%), так же как и во всех российских популяциях [10— 12]. Вторым и третьим по распространенности аллельными вариантами являются НЬА-А*01 и НЬА-А*03; подобный профиль был выявлен в популяциях Северо-Запада, Самарской и Кировской областей, с тем отличием, что аллельный вариант НЬА-А*03 находится на втором месте по частоте встречаемости, а НЬА-А*01 — на третьем [11—13]. Также необходимо отметить, что аллельный вариант НЬА-А*34, выявленный в популяции Кировской области [11], не был найден в исследуемой популяции, что может быть связано с ее небольшим объемом.

Наиболее распространенными аллельными вариантами локуса НЬА-В в популяции Новосибирска в порядке уменьшения частоты встречаемости являются НЬА-В*35, В*07, В*08. При этом среди 24 аллельных вариантов локуса НЬА-В не обнаружено аллельного варианта, явно преобладающего по частоте встречаемости, как в случае с НЬА-А*02 для ло-куса НЬА-А. Также необходимо отметить, что именно по данному локусу выявлены наибольшие различия в профиле распределения аллельных вариантов по частоте встречаемости с популяциями Северо-Запада, Кировской области (где профиль распределения — НЬА-В*07, В*35, В*44) [11, 13] и Самарской области (где профиль распределения - НЬА-В*35, В*07, В*44) [12].

Аллельный профиль наиболее часто встречающихся аллельных вариантов по локусу НЬА-С следующий: НЬА-С*07, -С*06, -С*04, -С*12, -С*03. В настоящее время имеется мало данных о частотах встречаемости локуса НЬА-С в российских популяциях, что, вероятно, связано с тем, что большинство исследований в российских популяциях так или иначе связаны с базами данных потенциальных доноров гемопоэтических стволовых клеток, в которых минимальными требованиями, предъявляемыми к таким донорам, является обязательное типирование только по локусам НЬА-А, -В, -БКВ1 [15].

Среди аллельных вариантов локуса НЬА-ОКВ1 наиболее часто встречающимися являются НЬА-ОКВ1*13 (15,25%), -БКВ1*07 (13,75%) и -0КВ1*01 (13%), аналогичный профиль был выявлен в популяции Самарской области [12]. Различия в профиле наблюдаются с популяцией Кировской области, где на 1-м месте расположен аллельный вариант НЬА-ОКВ1*15 [11], с популяцией Северо-Запада, где на 1-м месте расположен аллельный вариант БКВ1*15, на втором — БКВ1*07, а на третьем — БКВ1*13 [13], с популяцией Костромы, где НЬА-БКВ 1-профиль следующий: НЬА-ОКВ 1*01 (17.5%), НЬА-ОКВ1 *07 (14,3%), НЬА-БКВ1*15 (13,5%) [14], с популяцией Смоленска, где НЬА-ОКВ1-профиль следующий: НЬА-БКВ1*07 (17.3%), НЬА-БКВ1*11 (17,3%), НЬА-БКВ1*15 (15,4%) [14], с популяцией Вологды, где НЬА-БКВ1-профиль следующий: НЬА-БКВ1*07 (14.9%), НЬА-БКВ1*13 (14,9%), НЬА-БКВ1*15 (14,4%) [14].

Анализ гаплотипов является также информативным при популяционных исследованиях. В общей сложности было выявлено 239 гаплотипов НЬА-А-В-С-ОКВ1 из 1831 возможного. Наибольшей частотой встречаемости обладает гаплотип НЬА-А*01-В*08-С*07-0КВ 1*03 (4,5%), несмотря на то, что аллельные варианты НЬА-А*01, НЬА-В*08, НЬА-С*07, НЬА-БКВ1*03 по частоте встречаемости занимают второе, третье, первое и седьмое место в соответствующем локусе (вероятнее всего, это связано с неравновесием по сцеплению). Провести сравнение гаплотипов НЬА-А-В-С-ОКВ1 популяции г Новосибирска с другими популяциями не представляется возможным в связи с отсутствием частот встречаемости гаплотипов НЬА-А-В-С-ОКВ! в российских популяциях.

гематология

С одной стороны, проведенные исследования выявили некоторые сходства в распределении HLA-аллелей в популяции г. Новосибирска и популяциях Северо-Запада, Кировской и Самарской областей, а с другой стороны — выявленные новые аллели (2 на 200 потенциальных доноров ГСК) свидетельствуют об уникальности исследованной популяции. В связи с этим дальнейшие исследования целесообразно направить на расширение пула потенциальных доноров ГСК, привлеченных в указанном регионе. Это позволит увеличить генетическое разнообразие российских донорских ресурсов, доступных для поиска неродственного донора ГСК. С другой стороны, это поможет выяснить, являются ли вновь выявленные аллели редко встречающимися или же они циркулируют в исследованной популяции с существенной частотой и будут влиять на вероятность подбора совместимого неродственного донора ГСК.

Финансирование. Исследование не имело спонсорской поддержки.

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

ЛИТЕРАТУРА (п.п. 1—2, 4—7, 10, 12—15 см. REFERENCES)

3. Регистр против рака. Национальный регистр доноров костного мозга. Счетчик регистра. 2015. Available at: http://www.rusfond. ru/registr/009#counter (обновление 28.10.2015).

8. Болдырева М.Н., Гуськова И.А., Богатова О.В., Янкевич Т.Э., Хромова Н.А., Тегако О.В. и др. HLA-генетическое разнообразие населения России и СНГ. II. Народы европейской части. Иммунология. 2006; 27(4): 198—202.

9. Болдырева М.Н., Гуськова И.А., Богатова О.В., Янкевич Т.Э., Хромова Н.А., Кабдулова Д.Д. и др. HLA-генетическое разнообразие населения России и СНГ. III. Народы Евразии. Иммунология. 2006; 27(6): 324—9.

11. Логинова М.А., Трофимова Н.П., Парамонов И.В. Генетические особенности популяции, проживающей на территории Кировской области. Вестник службы крови России. 2012; (1): 24—8.

Поступила 31.03.16

REFERENCES

1. Bone Marrow Donor Worldwide. 2015. Available at: http://www. bmdw.org/index.php?id = home.

2. Allele frequency in World population. 2015. Available at: http:// www.allelefrequencies.net.

3. Register of cancer. National Register of bone marrow donors. Register counter. 2015. Available at: http://www.rusfond.ru/ registr/009#counter. (update 28 October 2015). (in Russian)

4. HARPs Finder. 2015. Availbale at: http://www.harpsfinder.conexio-genomics.com/index.html.

5. Excoffier L., Laval G., Schneider S. Arlequin (version 3.0): An integrated software package for population genetics data analysis. Evol. Bioinform. Online. 2005; 1: 47—50.

6. Excoffier L., Slatkin M. Maximum-likelihood estimation ofmolecular haplotype frequencies in a diploid population. Mol. Biol. Evol. 1995; 12(5): 921—7.

7. Sequence Alignment Tool. Available at: http://www.ebi.ac.uk/ipd/ imgt/hla/align.html.

8. Boldyreva M.N., Gus'kova I.A., Bogatova O.V., Yankevich T.E., Khromova N.A., Tegako O.V. et al. HLA-genetic diversity of the population of Russia and the CIS. II. The peoples of the European part. Immunologiya. 2006; 27(4): 198—202. (in Russian)

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

9. Boldyreva M.N., Gus'kova I.A., Bogatova O.V., Yankevich T.E., Khromova N.A., Kabdulova D.D. et al. HLA-genetic diversity of the population of Russia and the CIS. III. The peoples of Eurasia. Immunologiya. 2006; 27(6): 324—9. (in Russian)

10. Bubnova L.N., Zaitseva G.A., Erokhina L.V., et al. A comparative study of HLA-A and HLA-B antigens and haplotype distribution among donors of hematopoietic stem cells from Russia and German regions. Cell. Ther. Transplantat. 2008; 1: 28—34.

11. Loginova M.A., Trofimova N.P., Paramonov I.V. The genetic characteristics of the population living on the territory of the Kirov region. Vestnik sluzhby kroviRossii. 2012; (1): 24—8. (in Russian)

12. Gragert L., Toropovskiy A., Volchkov S.E., Trusova L.M., Tyumina O.V. Estimation of HLA alleles and haplotypes frequencies distribution in population of the Samara Region. In: 36fh Annual Meeting Abstracts «Human Immunology». 2010; 71(Suppl.1): S84.

13. Russian Ministry of Health. HLA in Russian Northwest. In: The Allele Frequency Database Net. 2002. Available at: http://www. allelefrequencies.net.

14. Boldyreva M, Alexeev P, Khaitov R., Gouskova I., Bogatova O., Yankevich T. et al. HLA-genetic diversity among populations of Russia and FSU.I. Russians. In: The Allele Frequency Database Net. 2005. Available at: http://www.allelefrequencies.net.

15. EFI standards version 6.2. Available at: http://www.efiweb.eu/efi-committees/standards-committee.html.

Received 31.03.16