CC BY
98
УДК 617.721-007.21-053.1
Т.А. ВАСИЛЬЕВА1, Н.А. ПОЗДЕЕВА2, А.А. ВОСКРЕСЕНСКАЯ2, О.В. ХЛЕБНИКОВА1, З.А. ЗИНЧЕНКО134, Е.К. ГИНТЕР15
Медико-генетический научный центр РАМН, 115478, г. Москва, ул. Москворечье, д. 1 2Чебоксарский филиал ФГБУ «МНТК «Микрохирургия глаза» им. С.Н. Федорова» МЗ РФ, 428028, г. Чебоксары, пр. Тракторостроителей, д. 10
3Научно-практический центр медицинской помощи детям Департамента здравоохранения Москвы, 119620, г. Москва, ул. Авиаторов, д. 38
Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И. Пирогова МЗ РФ, 117997, г. Москва, ул. Островитянова, д. 1
Российская медицинская академия последипломного образования МЗ РФ, 125993, г. Москва, ул. Баррикадная, д. 2/1
Генетические аспекты врожденной аниридии
Васильева Татьяна Алексеевна — научный сотрудник лаборатории генетической эпидемиологии, тел. +7-915-287-30-96, e-mail: vasilyeva_debrie@mail.ru
Поздеева Надежда Александровна — доктор медицинских наук, заместитель директора по научной работе, тел. (8352) 36-91-81, e-mail: npozdeeva@mail.ru
Воскресенская Анна Александровна — врач-офтальмолог отделения амбулаторной хирургии и консервативных методов лечения, тел. (8352) 36-90-00, e-mail: vsolaris@mail.ru
Хлебникова Ольга Вадимовна — доктор медицинских наук, ведущий научный сотрудник лаборатории генетической эпидемиологии, тел. +7-903-565-43-16, e-mail: khlebnikova@med-gen.ru
Зинченко Рена Абульфазовна — доктор медицинских наук, профессор, заведующая лабораторией генетической эпидемиологии, тел. (499) 324-12-24, e-mail: renazinchenko@mail.ru
Гинтер Евгений Константинович — доктор биологических наук, профессор, академик РАМН, директор, тел. (499) 612-86-07, e-mail: ekginter@mail.ru
Аниридия — это прогрессирующий сложный врожденный порок развития, затрагивающий все структуры глаза. Характеризуется отсутствием или гипоплазией радужки, гипоплазией фовеа, зрительного нерва, нистагмом, непрозрачностью роговицы, может сопровождаться катарактой, глаукомой и дополнительными дефектами развития мозга, обонятельной системы и поджелудочной железы. Наследуется аутосомно-доминантно, с полной пенетрантностью и различной экспрессивностью. Вызывается гетерозиготными мутациями в гене PAX6, одном из ключевых регуляторов эмбриогенеза. PAX6 консервативен у всех видов двусторонне-симметричных животных. PAX6 выступает как координатор и синхронизатор сопряженных процессов морфогенеза в клетках разного происхождения. Экспрессия PAX6 формирует способность тканей будущего глаза отвечать на индукционные сигналы. В результате мутаций в PAX6 возникают комплексные повреждения всех структур глаза. На сегодня известно более 600 разных мутаций в PAX6, мутации распределены по всему гену, около 72% всех ассоциированных с аниридией мутаций приводят к возникновению преждевременного стоп кодона. Микроделеции участка 11p13 составляют около трети обнаруживаемых генетических дефектов при аниридии. Хотя мутации, ассоциированные с аниридией, обнаруживаются в PAX6 более чем в 95% случаев, сложные фенотипы аниридии могут перекрываться с клиническими фенотипами, вызванными изменениями в других генах (например, FOXC1, PITX2, PITX3). Дифференциальная диагностика проводится в первую очередь с синдромом WAGR, а также с синдромом Аксенфельда — Ригера, аномалией Петерса, с более редкими синдромами (согласно базе OMIM 17 синдромов). В 85% аниридия встречается как изолированный порок развития, примерно в 13% — в составе WAGR синдрома, на долю остальных синдромов приходится примерно 2-5%.
Ключевые слова: врожденная аниридия, комплексные повреждения структур глаза, мутации в гене PAX6, дифференциальная диагностика с синдромом WAGR.
T.A. VASILYEVA1, N.A. POZDEYEVA2, A.A. VOSKRESENSKAYA2, O.V. KHLEBNIKOVA1, R.A. ZINCHENKO1 3 4, E.K. GINTER1 5
1Center for Medical Genetics of the RAMS, 1 Moskvorechye St., Moscow, Russian Federation, 115478 2Cheboksary branch of S. Fyodorov Eye Microsurgery Federal State Institution, 10 pr. Traktorostroiteley, Cheboksary, Russian Federation, 428028
3Scientific and Practical Center of Medical Care for Children, 38 Aviatorov St., Moscow, Russian Federation, 119620
4Pirogov Russian National Research Medical University, 1 Ostrovityanova St., Moscow, Russian Federation, 117997
5Russian Medical Academy of Postgraduate Education, 2/1 Barrikadnaya St., Moscow, Russian Federation, 125993
Genetic aspects of congenital aniridia
Vasilyeva TA — researcher of the Laboratory of Genetic Epidemiology, tel. +7-915-287-30-96, e-mail: vasilyeva_debrie@mail.ru Pozdeyeva NA — MD, PhD, Deputy Director for Science, tel. (8352) 36-91-81, e-mail: npozdeeva@mail.ru
Voskresenskaya AA — MD, ophthalmologist of the Department of Ambulant Surgery and Conservative Treatment, tel. (8352) 36-90-00, e-mail: vsolaris@mail.ru
Khlebnikova O.V. — MD, PhD, leading researcher of the Laboratory of Genetic Epidemiology, ophthalmogenetician, tel. +7-903-565-43-16, e-mail: khlebnikova@med-gen.ru
Zinchenko R.A. — PhD, Professor, Head of the Laboratory of Genetic Epidemiology, tel. (499) 324-12-24, e-mail: renazinchenko@mail.ru
Ginter E.K. — Doctor of Biology, Professor, Academician of the Russian Academy of Sciences, Director, tel. (499) 612-86-07, e-mail: ekginter@mail.ru
Aniridia is a complex progressive congenital disorder affecting all structures of the eye. It is characterized by a total absence or partial hypoplasia of iris, fovea and optic nerve hypoplasia, nistagmus, and cornea opacity. It may be accompanied by cataracts, glaucoma and additional developmental defects of the brain, olfactory system and pancreas. Aniridia has an autosomal dominant inheritance with complete penetrance and variable expressiveness. Heterozygous mutations in the PAX6 gene are the cause of congenital aniridia. PAX6 is one of the key embryogenesis regulators, it is conserved in all bilateral-symmetrical animals. PAX6 coordinates and synchronies the coherent morphogenesis processes in cells of different origin, as well as forms the ability of future eye tissues to respond to inductive signals. Mutations in the gene lead to complex damage of all structures of the eye. There are more than 600 different known mutations in the PAX6 gene. About 72% of all mutations associated with aniridia result in premature stop codon. Microdeletions of chromosome region 11p13 are found in about a third of the detected genetic defects in aniridia. Although aniridia associated mutations are found in PAX6 in more than 95% of cases, complex aniridia phenotypes might overlap with clinical phenotypes caused by changes in other genes (e.g. FOXC1, PITX2, PITX3). Differential exclusion of WAGR syndrome, Axenfeld-Rieger syndrome, Peters anomality and other rarer syndromes (according to the OMIM database, 17 syndromes) is to be carried out. 85% of aniridia cases occur as an isolated malformation, in about 13% of cases aniridia is a part of the WAGR syndrome, and in 2-5% of cases — a part of rarer syndromes.
Key words: congenital aniridia, complex defects of all eye structures, the PAX6 gene mutations, differential exclusion of WAGR syndrome.
Объем публикуемых научных работ на тему ани-ридии обширен из-за огромного интереса, который вызван несколькими фактами. Во-первых, это частота аниридии, ее спорадических случаев и повышенный риск развития карциномы почки в случаях de novo. Во-вторых, сложность оперативного лечения из-за драматично нарастающего фиброзного синдрома делает решение проблемы помощи таким больным вызовом медицинскому и научному миру. В-третьих, немаловажной причиной интереса к изолированной аниридии служит сам ген PAX6 с его универсальностью и консервативностью практически во всем животном мире. На животных моделях аниридии изучаются самые глубинные и глобальные проблемы биологии развития глаза. Современные сведения в области изучения генетических причин аниридии позволяют прояснить картину патогенеза данного врожденного порока развития, помогают практикующим врачам в решении сложных вопросов диагностики и дают надежду пациентам на получение помощи и лечения в недалеком будущем.
Аниридия (OMIM #106210) — редкий врожденный порок развития глаза. Частота врожденной аниридии составляет 1:40 000 — 1:96 000 человек. Аниридия наследуется аутосомно-доминантно, с почти полной пенетрантностью и варьирующей экспрессивностью, в 30-70% случаев возникает de
novo, в остальных имеет семейную историю [1-3]. В основном аниридия встречается как изолированный порок развития и в составе синдрома опухоли Вильмса с аниридией, аномалиями мочеполовой системы и умственной отсталостью (синдром WAGR; OMIM #194072). Аниридия обусловлена внутриген-ными мутациями гена PAX6 (OMIM *607108; 11p13) или хромосомными перестройками (делециями), затрагивающими локус 11p13 [4].
Аниридия характеризуется полным двусторонним отсутствием или частичной гипоплазией радужки разной степени, сочетается с гипоплазией фовеа и диска зрительного нерва, сопровождается светобоязнью, нистагмом и значительным снижением остроты зрения. Часто аниридия ассоциирована с другими глазными аномалиями, включая катаракту, глаукому, васкуляризацию и помутнение роговицы, которые существуют с рождения или могут развиваться уже в первую декаду жизни пациентов [4]. Даже изолированная аниридия обычно осложнена морфологическими и функциональными нарушениями нервной системы. Оптическая когерентная томография и ультразвуковое биомикроскопическое исследование выявляет при аниридии гипоплазию зрительного нерва и фовеа, радужки и ресничного тела, очень тонкий корень радужки, уменьшение угла и глубины передней камеры, хрупкость хру-сталиковой капсулы. При осмотре обнаруживаются
кератопатия, иногда отслойка сетчатки. Магнитно-резонансная томография выявляет множественные структурные аномалии мозга, включая гипоплазию передней комиссуры, передней поясной коры, мозжечка, височной и затылочной долей, обонятельной луковицы, мозолистого тела, эпифиза, одностороннюю полимикрогирию [5]. Могут встречаться дополнительные нарушения восприятия и неврологические дефекты: нарушение обоняния, дефекты центральной обработки сигналов от органа слуха и дефицит слухоречевой кратковременной памяти [6]. При этом в целом у пациентов с врожденной изолированной аниридией сохраняются нормальные когнитивные функции [7]. Аниридия часто ассоциирована с пороками эндокринной функции поджелудочной железы [4].
Со временем стало ясно, что термин «изолированная аниридия» относится к комплексному пороку развития, при котором затронуты не только все ткани глаза, но и возможно, центральная нервная система и поджелудочная железа. Аниридия характеризуется значительной вариабельностью фенотипа. Самый яркий характерный признак — отсутствие радужки может проявляться лишь частично, отдельные варианты фенотипов не являются такими же яркими и узнаваемыми, как классический фенотип полной аниридии, они сложны и трудно узнаваемы.
Классификация врожденной аниридии
Врожденная аниридия в 85% случаев встречается как изолированный порок развития без очевидного визуализируемого вовлечения других органов и систем, обусловлена гетерозиготными мутациями в гене РАХ6. В 13% аниридия встречается как часть синдрома WAGR [8]. Синдром WAGR обусловлен делецией региона 1^13, захватывающей локусы аниридийного гена РАХ6 и гена предрасположенности к развитию опухоли Вильмса ШТ1. WAGR встречается в основном в виде спорадических случаев. Во всех спорадических случаях до установления генетической причины больной аниридией имеет 50%-ный риск развития нефробластомы [3] до 8 лет. Частота и злокачественность составляющей синдрома WAGR — карциномы почки определяет важность раннего установления генетической причины врожденной аниридии: внутригенная мутация в гене РАХ6 или хромосомная делеция региона 1^13, захватывающая гены РАХ6 и ШТ1. Карцинома почки — опухоль Вильмса может встречаться и как изолированное состояние (OMIM: #194070), являющееся результатом мутационных изменений в гене Ш1 *607102). Частота изолирован-
ной опухоли Вильмса составляет 1:10 000 — 1:50 000 новорожденных и 20% всех злокачественных новообразований у детей. Опухоль развивается в первые 2-3 года жизни. При WAGR синдроме карцинома почки обычно развивается раньше и является двусторонней (в 36%) [4, 9].
В 2-5% случаев аниридия ассоциирована с другими моногенными и хромосомными синдромами, более редкими по частоте [8, 9]. Среди них в международной базе данных OMIM выделены: синдром Гиллеспи (OMIM: #206700; сочетание аниридии с мозжечковой атаксией, птозом и задержкой умственного развития), синдром WAGRO (OMIM: #612469; аниридия, опухоль Вильмса, аномалия мочеполовой системы, умственная отсталость и ожирение), синдром аниридии с частичной односторонней агенезией почки и психомоторной за-
держкой (OMIM: 206750), синдром аниридии с гипоплазией/аплазией надколенника (OMIM: 106220), синдром аниридии с микрокорнеа и спонтанной резорбцией катаракты (OMIM: 106230), синдром Аксенфельда — Ригера, тип 1, 3 (OMIM: #180500, #602482), скелетная дисплазия с грацильными костями (OMIM: #602361; тонкие, плотные кости включая кости черепа, изменения диафизов и ме-тафизов, микромелическая карликовость, брахи-дактилия, гипоплазия селезенки, аномалии лица и глаз — микрофтальмия, аниридия), синдром локальной гипоплазии кожи (OMIM: #602361; множественные пороки развития, включают аниридию), синдром задержки роста и психо-моторного развития с различными аномалиями глаз (OMIM: 156190), врожденный кератит (OMIM: #148190), синдром множественных экзостозов, тип 2 (OMIM: #133701), синдром Потоцкого — Шаффера (OMIM: #601224), микрофтальмия изолированная с колобомой, тип 7 (OMIM: #614697), синдром кошачьего глаза (OMIM: #115470), мезодермальная дисплазия радужки (OMIM: #107250), синдром Дениса — Драша (OMIM: #194080) [OMIM]. Для большинства вышеперечисленных синдромов, как моногенной этиологии, так и являющихся результатом хромосомных перестроек, регионом генетических нарушений оказывается хромосома 11 (локус 11p).
Врачам-генетикам, постоянно имеющим дело с редкими синдромами, даже изолированную ани-ридию вначале приходится рассматривать как возможный синдром, дифференцируя с другими нозологическими формами. Врачам-офтальмологам во всех случаях аниридии необходимо направлять пациентов к врачу-генетику для исключения синдро-мальной патологии. Кроме того, частота и злокачественность опухоли Вильмса определяет важность ранней диагностики аниридии в составе синдрома WAGR.
Функции гена PAX6. Молекулярные механизмы патогенеза аниридии
Причиной врожденной изолированной аниридии более чем в 95% случаев являются мутации в гене PAX6, описанном в 1991 году. В 1992 г. с помощью методов генетического сцепления, физического картирования и цитогенетического анализа в небольшом регионе, соответствующем хромосомному участку 11p13, аниридийный ген был локализован. Он находится в 700 тыс. п. н. дистальнее WT1. Из-за выявленной гомологии с мышиным геном парного бокса, аниридийный ген получил название PAX6 [10].
PAX6 принадлежит к классу генов, кодирующих белки-регуляторы эмбрионального развития, содержащие парный бокс. Гомологи PAX6 обнаружены у всех друсторонне-симметричных животных.
Ген PAX6 занимает 26 тыс. п.н., подразделяется на 14 экзонов. Ген кодирует транскрипционный фактор, состоящий из 422 аминокислотных остатков. PAX6 содержит два в высокой степени консервативных домена: парного бокса (128 аминокислотных остатков) и гомеодомен (61 остаток). Домены связаны 72-аминокислотным линкерным сегментом, в С-конце расположена трансакти-ваторная последовательность PST домена (про-лин, серин, треонин — богатая область), содержащая 152 аминокислоты. Домен парного бокса кодируется экзонами с 5 по 7 и содержит два отдельных мотива, соответствующих N-концевому и C-концевому субдоменам. Оба субдомена парного
бокса обладают ДНК-связывающей активностью по отношению к разным таргетным последовательностям и негативно регулируют друг друга. Альтернативно сплайсированные варианты транскриптов кодируют 17 изоформ PAX6. В результате альтернативного сплайсинга экзона 5а образуются две основные изоформы белка со вставкой дополнительных 14 аминокислот в домен парного бокса и без нее. Инсерция 14 аминокислот разрушает ДНК-связывающую активность N-концевого субдомена и включает активность C-концевого субдомена. Оверэкспрессия изоформы PAX6 (+5a) со вставкой 14 аминокислот во время эмбрионального развития соответствует запуску каскада преобразования нейрональной архитектуры сетчатки. PAX6 имеет разнообразные возможности связывать различные сайты в большом числе разных регулируемых им генов. Постоянно растет число вновь выявляемых генов, функционирующих в мозге, глазу и поджелудочной железе, экспрессию которых регулирует PAX6. На сегодня обнаружено более 5000 промоторов и около 10 разных мотивов, взаимодействующих с PAX6. Кодирующий регион гомологичен у мыши и человека на 100%, у курицы и человека — на 96%, у рыбки данио и человека — на 93%. Домен парного бокса и гомеодомен на 80-90% идентичны у млекопитающих, дрозофилы и C. Elegans. Возможно, что мишени для ДНК связывания тоже очень консервативны на протяжении всего времени эволюции [9]. Транскрипционный фактор PAX6 — мастер-регулятор развития глаза, экспрессия которого может индуцировать эктопическое развитие глаза со всеми необходимыми типами клеток у эмбрионов мух и лягушек. При отсутствии экспрессии PAX6 функциональные структуры глаза не формируются [11].
Установление гомологии гена eyeless у дрозофилы с Pax6 (мышиный гомолог PAX6) позвоночных животных пробудило огромный интерес к процессам спецификации глаза и привело к переосмыслению эволюции глаз. Транскрипционный фактор eyeless/ Pax6 является необходимой и при определенных обстоятельствах достаточной причиной индукции развития глаза, и это делает простую эволюционную историю развития глаза «более поэтичной и эпичной». Совершенно разные типы глаз — фасеточный и камерный — имеют независимое происхождение в разных филетических линиях. При этом существует общий глубинный механизм развития глаза. Обнаружение мастера регуляции морфогенеза глаза — гена Pax6, высокий консерватизм его кодирующей и регуляторных последовательностей в животном царстве на протяжении сотен миллионов лет указывают на то, что прототип глаза у примитивного вида животных возник в эволюции только однажды. Разные типы глаз имеют общее, единое происхождение. Появившийся в древние времена в светочувствительных клетках примитивного животного Pax6 играет важную роль в морфогенезе самой развитой формы зрительных рецепторов — фовеа млекопитающих [11].
PAX6 обладает важнейшими регуляторными функциями в процессах эмбрионального развития глаза, носа, центральной нервной системы и поджелудочной железы. Ранняя экспрессия гена PAX6 сопряжена со зрительным стебельком и зрительным пузырьком, позже — с поверхностной эктодермой, из которой в последующем развивается хрусталик, и сетчаткой, где PAX6 определяет полноценную дифференцировку клеток этой структуры.
Гипоплазия фовеа — один из самых характерных признаков врожденной аниридии.
После завершения формирования основных структур глаза на высоком уровне экспрессия РАХ6 остается в нейронах сетчатки, эпителии хрусталика, роговице. РАХ6 регулирует дифференцировку островковых а-клеток поджелудочной железы, экспрессию глюкагона, инсулина и соматостатина. У взрослых экспрессия РАХ6 обнаружена в глазу, мозге, поджелудочной железе [12, 13]. Наряду с другими транскрипционными факторами белок РАХб вовлечен в процессы опухолеобразования. В отношении продукта гена РАХ6 многими авторами описан эффект дозы, т.е. корреляция глазных нарушений с уровнем активности РАХ6.
Контролирующие эмбриональное развитие гены, одним из которых является РАХ6, образуют особый класс. Их экспрессия включается, поддерживается и выключается в развивающемся организме в точное время и в точном месте. Требуется тесно сопряженная регуляция экспрессии таких генов. Изменение определенного уровня экспрессии РАХ6 в таком контексте, очевидно, оказывается крайне важным. На это указывают несколько фактов: нарушение функции белка РАХ6, вызванное оверэкспрессией или гаплонедостаточностью гена, а также критическая важность создания градиента Рахб, например, в новой коре у эмбрионов мыши для правильной спецификации ее основных областей. Эффект потери одного нормального аллеля Рахб усиливается на уровнях регуляции транскрипции других транскрипционных факторов, критичных для развития определенных структур глаза, а также на уровне авторегуляции [12].
Патогенез при дефиците ключевого транскрипционного фактора РАХ6
Роль гена РАХ6 в морфогенезе глаза и механизмы гаплонедостаточности (повреждения функции белка из-за отсутствия одного нормального аллеля при наличии гетерозиготной мутации) изучены на мышиной модели аниридии человека. Аниридийный фенотип человека отличается от фенотипа малых глаз, однако, гаплонедостаточность РАХ6 схожим образом сказывается на развитии всех важнейших структур глаза человека. Мыши с гетерозиготной мутацией в гене Рахб имеют характерный фенотип малых глаз ^еу), представленный сочетанием разных тканевых аномалий, в том числе глазных: микрофтальмом, гипопластичными зрительным нервом и фовеа, хрупкой хрусталиковой капсулой и катарактой, вакуолизированным смещенным хрусталиком, гипопластичной радужкой и васкуляри-зированной роговицей с нерегулярной слоистостью коллагеновых фибрилл и клеточными инфильтратами. Механизмы действия нефункционального или частично функционального Рах6, приводящие к нарушениям развития глаза, комплексны [12].
Хрусталик, сетчатка и пигментный эпителий должным образом не дифференцируются. В тканях роговицы меняется уровень экспрессии цитокера-тинов, молекул адгезии и гликоконъюгатов клеточной поверхности. Кроме того, мутации в РАХ6 приводят к дефициту стволовых клеток и, следовательно, к нарушению развития и регенерации нормальной роговицы, ее хрупкости, а также к ассоциированным с аниридией развитием кератопатии. Нарушается дифференцировка клеток угла передней камеры, их дренажной функции, может развиться глаукома. Глаукома может стать результа-
том прогрессирующего при аниридии закрытия угла передней камеры из-за синехий. Отдельно стоит рассмотреть возможные объяснения возникающей вследствие мутаций в гене РАХ6 гипопластичности радужки [9]. Несмотря на раннюю предопределенность судьбы ненейрональной области в пределах дистальной части оптического бокала, последующие стадии дифференцировки зависят от экспрессии Pax6 и нарушаются при ее отсутствии.
Благодаря экспериментам на животных моделях стало ясно, что присутствие экспрессии Pax6 формирует способность тканей будущего глаза отвечать на индукционные сигналы. На самых ранних этапах Pax6 в паре с другим транскрипционным фактором Sox2 инициирует развитие хрусталика в участке головной эктодермы, позже Pax6 регулирует экспрессию в нервном слое сетчатки 1^-8, влияющего на дифференцировку волокон хрусталика. В свою очередь Bmp сигналы хрусталика индуцируют дифференцировку периферического края глазного бокала в ресничное тело и радужку. Пигментные и мышечные клетки радужки имеют ней-роэктодермальное происхождение и претерпевают процесс передифференцировки. Высокий уровень экспрессии Pax6 обеспечивает мультипотентное состояние прогениторных клеток на периферии глазного бокала. Границу нейрогенеза и судьбу клеток края глазного бокала определяет активизация канонического Wnt сигнального пути, опосредованно регулируемого Pax6 [14].
Значительная по силе и продолжительная по времени экспрессия Pax6 в хрусталике, эпителиях роговицы, радужки и ресничного тела необходима для экспрессии этими клетками генов специфических транскрипционных факторов, структурных белков и сигнальных молекул. Позже эти ткани индуцируют миграцию клеток нервного гребня в формирующийся глаз (из данных мезенхимных клеток формируется строма ресничного тела и радужки). Неправильно сформированный хрусталик не способен экспрессировать достаточное количество сигнальных молекул, индуцирующих миграцию клеток из нервного гребня в формирующийся передний сегмент глаза. На протяжении эмбрионального развития глаза Pax6 активен и в эпителиальных, и в мезенхимных клетках в качестве ключевого элемента в процессах синхронизации сложных взаимодействий клеток разного происхождения [12, 15, 16].
Отсутствие или гипоплазия радужки могут объясняться комбинацией дефектов в продолжение дифференцировки эпителиальных слоев радужки и неспособности мигрирующих из нервного гребня клеток обнаружить место своего назначения и сформировать строму радужки [12].
Молекулярные механизмы аниридии не до конца изучены, но многое в отношении генетических причин патогенеза уже прояснилось: регуляции, осуществляемых Pax6 на нескольких уровнях и во взаимодействии со многими молекулами, определяют многообразие пораженных тканей и фенотипов при нарушении функции данного транскрипционного фактора. Pax6 влияет на способность тканей будущего глаза отвечать на индукционные сигналы. Pax6 действует как координатор и синхронизатор сопряженных процессов морфогенеза в клетках разного происхождения.
Спектр мутаций в гене РАХ6 при аниридии
На сегодня известны более 600 разных мутаций в гене РАХ6 [17]. Они распределены по всему гену.
Большое число разных мутаций в гене PAX6 отражает много возможных путей повреждения.
Самые полные базы зарегистрированных мутаций — это HGMD, которая содержит сведения о 391 разной мутации: https://portal.biobase-international. com/hgmd/pro/all.php — 391, и локус специфическая база данных о мутациях в гене PAX6: http:// lsdb.hgu.mrc.ac.uk/home.php?select_db=PAX6 (359 разных мутаций).
Среди всех обнаруживаемых при аниридии мутаций значительно преобладают нонсенс и мутации, приводящие к сдвигу рамки считывания [4, 8]. Около 72% всех (и 94% внутригенных) мутаций в гене PAX6 приводят к возникновению преждевременного стоп кодона. На долю нонсенс мутаций приходится 50% всех изменений внутри открытой рамки считывания. К укорочению белка также приводят большинство мутаций, меняющих сплайсинг, инсер-ции и/или делеции. Только несколько процентов от идентифицированных изменений составляют мис-сенс-мутации [13]. Интересно, что на долю четырех распространенных нонсенс мутаций: p.Arg203Ter, p.Arg240Ter, p.Arg261Ter и p.Arg317Ter — приходится пятая часть всех зафиксированных случаев анири-дии с установленной мутацией. Большинство других мутационных изменений выявлены однократно или дважды [4, 18]. Довольно частой (около трети всех случаев) генетической причиной врожденной ани-ридии являются хромосомные делеции различной протяженности. Хромосомные перестройки могут захватывать ген PAX6 и/или его высоко консервативную регуляторную последовательность (интрон-ные области соседнего гена ELP4) и расположенный неподалеку от PAX6 ген WT1. В отдельных выборках спорадические случаи аниридии, вызванные мутацией de novо, составляют более 2/3. Среди мутаций de novо примерно половина принадлежит хромосомным делециям 11p13 [1, 19-21]. Сведения об обширных дупликациях региона 11p12 и/или 11p14 совместно с 11p13 получены несколькими авторами [22].
Таким образом, существует сильное смещение спектра мутаций, ассоциированных с аниридией, в сторону укорачивающих белок. Возможное объяснение лежит в недоучтенности сложных, нетипичных фенотипов, ассоциированных с миссенс-мутациями. Важно также отметить, что более половины спорадических случаев аниридии вызваны хромосомными делециями.
Механизмы действия мутаций. Гено-феноти-пические корреляции
В отношении разных типов мутаций действуют разные механизмы повреждения функции белка PAX6. Вначале рассмотрим последствия укорачивающих белок мутаций и микроделеций всего гена, а затем, отдельно, миссенс-мутаций — самого редкого класса мутаций, обнаруживаемых при аниридии.
Нонсенс мутации, сдвига рамки, изменения сплайсинга и обширные делеции
Как уже упоминалось, PAX6 относится к чувствительным к дозе генам. И в случае делеций всего гена PAX6, и в случае самых частых при аниридии мутаций, приводящих к укорочению белка, действует механизм гаплонедостаточности, когда экспрессии только с одного нормального аллеля недостаточно для полноценного выполнения белком своих функций. Если есть или появляется de novо внутриген-ная «укорачивающая белок» мутация в PAX6, то измененная матричная РНК с преждевременным стоп
кодоном подвергается полной деградации, синтеза укороченного белка не происходит, т.е. эффективно продуцируется нулевой аллель, как и если на одной из хромосом делетирован весь ген PAX6. Для некоторых нонсенс мутаций есть исключения, когда укороченный белок все-таки образуется и является более стабильным, чем нормальный, конкурирует с ним за места связывания, нарушая его функцию [12].
Следствием делеции всего гена, его части и/или его регуляторных областей, а также нонсенс и других небольших внутригенных изменений, приводящих к изменению или сдвигу открытой рамки считывания, является классический «аниридийный» фенотип. Классический «аниридийный» фенотип характеризуется полным отсутствием радужки, гипоплазией фовеа, нистагмом, ранней или врожденной катарактой, быстро развивающейся керато-патией. Пациенты с отсутствием одной копии гена PAX6, не представляют какую-то особенную или более тяжелую манифестацию, чем та, что ассоциирована с нонсенс мутациями в гене. Например, у большинства больных делеция cis-регуляторной downstream области гена PAX6, и гена DCDC1, ассоциирована с изолированной аниридией в сочетании с врожденной катарактой и другими глазными аномалиями. Однако, больные с обширной делецией PAX6 и прилежащих к гену областей, включая гены DKFZ, RCN1, имеют более тяжелый фенотип. Таким образом, в отношении более протяженных хромосомных перестроек, размер делеции коррелирует с тяжестью клинического фенотипа [17, 20]. Глазные нарушения у небольшого количества пациентов с обнаруженными дупликациями региона 11p12 и/ или 11p14 совместно с 11p13 крайне разнообразны и включают косоглазие, нистагм, а также микро-фтальм, гипоплазию радужки, эктопию зрачков, разнообразные нарушения сетчатки [22].
Оба типа рассмотренных выше мутаций (укорачивающих белок и делеций всего гена) эффективно производят нулевой аллель. Поврежденная копия лишена всякой транскрипционной активности. Оставшейся единственной нормальной копии просто недостаточно для того, чтобы вырабатывать достаточное количество биологически активного протеина. Данные типы мутаций ассоциированы с классическим фенотипом аниридии, тяжесть которого тоже может варьировать.
Миссенс-мутации
Если замена нуклеотида приводит к замене аминокислоты, то синтезируется белок нормальной длины с измененной трехмерной структурой и в разной степени нарушенной функцией. Миссенс-мутации приводят к разным вариантам «аниридийного» фенотипа: от очень мягких до крайне тяжелых форм. Мягкие фенотипы характеризуются небольшими дефектами радужки и почти сохраненным зрением. В число тяжелых фенотипов входят аниридия в сочетании с дефектом зрительных нервов, с аномалией Петерса, с микрофтальмом. Четыре пятых всех мис-сенс-мутаций в гене PAX6 локализуются в высоко консервативной последовательности, соответствующей домену парного бокса, повреждая способность протеина PAX6 связываться с таргетными генами. Тяжесть фенотипа при миссенс-мутации зависит от степени изменения структуры и функции белка [4]. При наличии миссенс-мутации в гене PAX6 может наблюдаться не полное отсутствие радужки. Возникают сложные дефекты как то: радиальные
дефекты радужки, эктропион сосудистой оболочки глаза, колобома радужки, отсутствие крипт и области бахромки радужки. Однако даже при минимальных поражениях радужки у пациентов с неклассическим фенотипом аниридии существует серьезный дефицит стволовых клеток лимба, при этом быстро прогрессирует кератопатия [23]. В разряд «мягких» мутационных изменений наряду с частью миссенс попадают и некоторые мутации, приводящие к изменению сплайсинга. Необходимо также упомянуть, что гетерозиготные миссенс-мутации в гене PAX6 найдены при различных врожденных пороках развития глаза, отличных от аниридии: аномалии Пе-терса, эктопии зрачка, гипоплазии фовеа, катаракте и при различных пороках развития зрительного нерва [24].
Таким образом, клинический фенотип при мис-сенс-мутации зависит от степени изменения структуры и функции белка и значительно варьирует. Мягкие проявления аниридии при миссенс- и некоторых мутациях сайтов сплайсинга могут быть различны у членов одной семьи и характеризуются как сложные пороки, отличные от классического фенотипа аниридии.
Дифференциальная диагностика
Говоря о генетической и фенотипической гетерогенности аниридии, вызванной мутациями в гене PAX6, необходимо упомянуть о том, что сходные с аниридией фенотипы ассоциированы с мутациями в генах FOXC1, PITX2, PITX3.
Мутации в генах FOXC1 и PITX2 обычно ассоциированы с синдром Аксенфельда — Ригера (OMIM 602482 и 180500) и аномалией Петерса (MIM 604229). Синдром Аксенфельда — Ригера — это различные варианты фенотипов, общей чертой которых является риск развития глаукомы в 50%. Аномалия Петерса вызвана мутациями в одном из генов: PAX6, PITX2, FOXC1 или CYP1B1. Аномалия характеризуется центральным бельмом и отсутствием задней части стромы роговицы и десцеметовой мембраны, сращением радужки и зрачка с задней частью роговицы. Мутации в гене PITX3 вызывают дисплазию передней камеры глаза и катаракту. Учитывая схожесть фенотипов, приходится проводить дифференциальную диагностику аниридии с другими пороками развития передней камеры глаз [4, 25].
Дифференциальная диагностика имеет большое значение в спорадических случаях пороков развития передней камеры для решения вопроса ранней диагностики ассоциированной с аниридией опухоли Вильмса.
Современная стратегия и алгоритм молеку-лярно-генетической диагностики аниридии
Учитывая гетерогенность и значительный клинический полиморфизм различных нозологических форм, ассоциированных с аниридией, и возможность развития опухоли Вильмса (в 50% спорадических случаев) налажен необходимый диагностический алгоритм.
Прежде всего, внимательно изучается семейная история и кажущиеся здоровыми родители, во-вторых, по возможности исключается синдро-мальная патология, в-третьих, если установлено, что семейной истории действительно нет, ДНК-диагностику начинают с определения хромосомных делеций.
В случае наличия пораженных родителей, деле-ция генов WT1 и PAX6 редко является генетической
причиной аниридии (хотя несколько семейных случаев синдрома WAGR зарегистрированы). Если у пациента с аниридией определена WAGR делеция, для него резко возрастает риск развития опухоли Вильмса. Если область делеции не захватывает ген WT1, дальнейшее определение внутригенных мутаций в гене PAX6 в качестве причин «аниридийного» клинического фенотипа становится менее безотлагательным, хотя и проясняет возможности генетического консультирования в отягощенных семьях [4, 25]. В этой части главной сложностью является дифференциальная диагностика аниридии с синдромом Аксенфельда — Ригера, аномалией Петерса и другими пороками развития глаза.
Определение микроделеции, ее размера и локализации, то есть получение ответа на вопрос, включает ли область делеции оба локуса: PAX6 и WT1, является приоритетной задачей диагностики в случаях спорадической аниридии.
Молекулярная диагностика аниридии состоит из нескольких этапов:
A. Вначале проводится анализ количества копий генов с помощью методов сравнительной геномной гибридизации высокого разрешения (CGH arrays) или реакцией лигазозависимой амплификации зондов (MLPA анализ).
Б. Для валидации крупных делеций, определенных с помощью MLPA, выполняется генотипирова-ние отягощенных семей по нескольким микроса-теллитным маркерам хромосомы 11. Это позволяет определить потерю маркеров одного из родителей, другими словами определить потерю гетерозигот-ности по локусам микросателлитных повторов, сцепленных с обнаруженной делецией хромосомы 11.
B. Далее секвенированием определяются внутри-генные изменения гена PAX6. В результате использования методов CGH или MlPa с последующим секвенированием кодирующей последовательности гена PAX6 мутации в гене определяются более чем в 95% случаев. Однако остается небольшая доля пациентов с неопределенными мутациями. Вне изучения остаются глубокие интронные области и другие некодирующие участки гена, а также регу-ляторные последовательности. Кроме того, сбалансированные хромосомные перестройки не сопровождаются изменением количества копий генов, и не могут быть распознаны количественными методами CGH и MLPA, поэтому на последнем этапе используется цитогенетический метод флуоресцентной in situ гибридизации (FISH анализ).
Г. FISH анализ позволяет обнаружить хромосомные перестройки, разрушающие функцию гена PAX6, а также подтвердить обширные хромосомные делеции, захватывающие ген WT1.
Д. Подтверждение патогенности впервые найденных внутригенных мутаций в гене PAX6 с помощью анализирующих предсказательных программ, доказательства отсутствия данного изменения в выборке здоровых людей и/или у здоровых членов семьи.
Е. Определение мутации пробанда у больных членов семьи, если имеется семейная история. Если очевидной истории нет, необходимо подтвердить статус мутации de novo доказательством отсутствия мутации пробанда у родителей.
Ж. Определение точных границ найденных делеций.
Идентификация патогенных изменений кодирующей последовательности или делеции гена PAX6 подтверждает диагноз изолированной аниридии,
определение делеции области, захватывающей PAX6 и WT1 подтверждает диагноз WAGR. Для такого ребенка резко возрастает риск развития опухоли Вильмса.
Генетическое консультирование при изолированной аниридии
Из-за разной экспрессивности болезни у разных членов семьи при обнаружении мутации de novo необходимо полное обследование родителей, включая офтальмологическое. Вполне возможно, что у одного из родителей есть отдельные проявления аниридийного фенотипа.
Риск рождения еще одного больного ребенка в семье зависит от генетического статуса родителей. Если у одного из родителей есть изолированная аниридия (даже с минимальными клиническими проявлениями, в виде дисплазии радужки), риск составляет 50%. Если родители здоровы — с учетом возможного гонадного мозаицизма, риск рассчитывается индивидуально, с учетом родословной и процента мозаичных клеток, он немного выше среднего в популяции. Пренатальная диагностика возможна в семьях с обнаруженной семейной мутацией [4].
Возможности лечения
При несомненном стремительном прогрессе в накоплении знаний о генетических и молекулярных механизмах возникновения аниридии все еще остаются спорными возможности консервативного и оперативного лечения больных. Одна из многообещающих возможностей помощи пациентам в будущем — нонсенс супрессорная терапия аминогли-козидами в первые дни жизни. Ч. Грегори-Эванс и соавторы показали, что терапия аталуреном приводит к стабильному восстановлению роговицы, хрусталика, дефектов сетчатки у новорожденных мышат c нонсенс мутацией в гене Pax6 [13, 26].
Одна из проблем, связанных с оперативным лечением, — фиброзный синдром. Причиной его отчасти является дефицит стволовых клеток лимба и нарушение процессов нормальной регенерации тканей глаза при недостаточной функции белка PAX6. Потеря PAX6 вызывает дифференцировку прогениторных клеток лимбальной зоны в клетки эпителия по типу кожного. Многочисленные оперативные вмешательства при аниридии часто являются пусковым механизмом для ускорения роста из остатков ткани корня радужки фиброзных мембран позади хрусталика и роговицы, процесса, приводящего к смещению хрусталика и непрозрачности роговицы. Аниридия — это предфибробластиче-ское состояние, поэтому все оперативные вмешательства, включая кератопластику и антиглауко-матозные фильтрирующие операции, провоцируют дальнейшее развитие фиброзного синдрома.
Несмотря на накопившиеся знания о патогенезе и технологический прогресс в медицине, перед врачами все еще стоит проблема эффективной помощи больным аниридией [9]. Надежду дают некоторые новые подходы к лечению. Например, манипуляция с дозой гена PAX6 посредством нонсенс супрессорной терапии сразу после рождения, когда глаз еще сохраняет известную пластичность [13]. Однако генотерапия пока остается в будущем.
Работа выполнена при частичном финансировании грантов РФФИ 14-04-00525 и 15-04-01859 и благотворительного фонда «Созидание».
ЛИТЕРАТУРА
1. Crolla J., van Heyningen V. Frequent chromosome aberrations revealed by molecular cytogenetic studies in patients with aniridia // Am J Hum Genet. - 2002. - Vol. 71. - P. 1138-49.
2. Gramer E., Reiter C., Gramer G. Glaucoma and frequency of ocular and general diseases in 30 patients with aniridia: a clinical study // Eur J Ophthalmol. - 2012. - Vol. 22. - Р. 104-10.
3. Hingorani J., Moore A. Aniridia. Initial Posting: May 20, 2003; last update: November 14, 2013.
4. Hingorani M., Hanson I., van Heyningen V. Aniridia // Eur J Hum Genet. - 2012. - Vol. 20. - P. 1011-1017.
5. Okamoto F., Nakano S., Okamoto C., Hommura S., Oshika T. Ultrasound biomicroscopic findings in aniridia // American Journal of Ophthalmology. - 2004. - Vol. 137. - P. 858-862.
6. Bamiou D. Auditory and verbal working memory deficits in a child with congenital aniridia due to a PAX6 mutation // International journal of audiology. - 2007. - Vol. 46. - P. 196-202.
7. Thompson P., Mitchell T., Free S., Williamson K. et al. Cognitive functioning in humans with mutations of the PAX6 gene // Neurology. -2004. - Vol. 7. - P. 1216-1218.
8. Chen P., Zang X., Sun D., Wang Y. et al. Mutation analysis of paired box 6 gene in inherited aniridia in northern China // Mol Vis. -2013. - Vol. 19. - P. 1169-1177.
9. Lee H., Khan R., O'Keefe M. Aniridia: current pathology and management // Acta Ophthalmol. - 2008. - Vol. 86. - P. 708-715.
10. Lyons L., Martha A, Mintz - Hittner H. et al. Resolution of the two loci for autosomal dominant aniridia, AN1 and AN2, to a single locus on chromosome 11p13 // Genomics. - 1992. - Vol. 13. -P. 925-930.
11. Kumar J., Moses K. Eye specification in Drosophila: perspectives and implications // Semin Cell Dev Biol. - 2001. - Vol. 12. -P. 469-74.
12. Cvekl A., Tamm E. Anterior eye development and ocular mesenchyme: new insights from mouse models and human diseases // Bio Essays. - 2004. - Vol. 26. - P. 374-386.
13. Gregory-Evans C., Wang X., Wasan K., Zhao J. et al. Postnatal manipulation of Pax6 dosage reverses congenital tissue malformation defects // J Clin Invest. - 2014. - Vol. 124. - P. 111-116.
14. Kokotas H., Petersen M. Clinical and molecular aspects of aniridia // Clin Genet. - 2010. - Vol. 77. - P. 409-20.
15. Fuhrmann S. Eye morphogenesis and patterning of the optic vesicle // Curr Top Dev Biol. - 2010. - Vol. 93. - P. 61-84.
16. Liu H., Xu S., Wang Y., Mazerolle C. et al. Ciliary margin transdifferentiation from neural retina is controlled by canonical Wnt signaling // Dev Biol. - 2007. - Vol. 308. - P. 54-67.
17. Zhang X., Wang P., Li S., Xiao X. et al. Mutation spectrum of PAX6 in Chinese patients with aniridia // Mol Vis. - 2011. - Vol. 17. -P. 2139-47.
18. Tzoulaki I., White I., Hanson I. PAX6 mutations: genotype-phenotype correlations // BMC Genet. - 2005. - doi:10.1186/1471-2156-6-27.
19. Gronskov K., Olsen J., Sand A., Pedersen W. et al. Population-based risk estimates of Wilms tumor in sporadic aniridia // Human Genetics, - 2001. - Vol. 109. - P. 11-18.
20. van Heyningen V., Hoovers J., de Kraker J., Crolla J. Raised risk of Wilms tumour in patients with aniridia and submicroscopic WT1 deletion // J Med Genet. - 2007. - Vol. 44. - P. 787-790.
21. Wawrocka A., Sikora A., Kuszel L., Krawczynsk M. 11p13 deletions can be more frequent than the PAX6 gene point mutations in Polish patients with aniridia // J Appl Genet. - 2013. - Vol. 54. -P. 345-51.
22. Schilter K., Reis L., Schneider A., Bardakjian T. et al. Whole-genome copy number variation analysis in anophthalmia and microphthalmia // Clin Genet. - 2013. - Vol. 84. - P. 473-481.
23. Skeens H., Brooks B., Holland E. Congenital Aniridia Variant: Minimally Abnormal Irides with Severe Limbal Stem Cell Deficiency Ophthalmology // 2011. - Vol. 118. - P. 1260-1264.
24. Azuma N., Yamaguchi Y., Handa H., Tadokoro K. et al. Mutations of the PAX6 Gene Detected in Patients with a Variety of Optic-Nerve Malformations // American Journal of Human Genetics. - 2003. -Vol. 72. - P. 1565-1570.
25. Ito Y., Footz T., Berry F., Mirzayans F., et al. Severe molecular defects of a novel FOXC1 W152G mutation result in aniridia // Invest Ophthalmol Vis Sci. - 2009. - Vol. 50. - P. 3573-9.
26. Sahel J.-A., Marazova K. Toward postnatal reversal of ocular congenital malformations // J Clin Invest. - 2014. - Vol. 124. -P. 81-84.
