CC BY
787
УДК 575.174/636
ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ЗКСПЕРТИЗА СЕЛьСКОхОЗЯйСТВЕННЫх ЖИВОТНЫх: ПРИМЕНЕНИЕ ТЕСТ-СИСТЕМ НА ОСНОВЕ МИКРОСАТЕЛЛИТОВ*
Н.А. ЗИНОВЬЕВА, член-корреспондент РАСХН, зам. директора
Е.А. ГЛАДЫРЬ, кандидат биологических наyк, зав. лабораторией
ВИЖ Россельхозакадемии E-mail: n_zinovieva@mail.ru
Резюме. Дана характеристика тест-систем на основе микро -сателлитов для проведения ДНК-экспертизы сельскохозяйственных животных - крупного рогатого скота (13 локусов), свиней (12 локусов), овец (11 локусов), кур (8 локусов) и медоносной пчелы ( Т локусов). Исследование образцов ДНК трех пород животных каждого из пяти видов Bos taurus (n=90), Sus scrofa (n=90), Ovis aries (n=90), Gallus gallus (n=90) и Apis mellifera (n=150) показало возможность проведения анализа 5...8 локусов в одной реакции. Среднее число аллелей на локус в зависимости от вида варьирует от 5,4Т±0,26 у свиней до 9,Т9±0,5Ту овец. Вероятность совпадения генотипов животных в зависимости от вида составляет от 4,0 10-12 до 9,7-10-11. Показана возможность использования разработанных тест-систем для проведения генетической экспертизы происхождения (P>0,95) и определения чистопородности животных (Q>87,9).
Ключевые слова: генетическая экспертиза, тест-системы, отцовство, микросателлиты, породы крупного рогатого скота
Контроль происхождения (генетическая экспертиза) племенного материала - обязательное условие ведения селекционно-племенной работы, как в зарубежных странах, так и в России (Федеральный закон № 123-Ф3 «О племенном животноводстве). Методическое обеспечение решения этой задачи достигается использованием технологий иммуногенетики и ДНК-анализа [1, 2, 3]. Развитие методов инструментального обеспечения молекулярно-генетических исследований и, как следствие, снижение их трудоемкости и стоимости обусловили принятие большинством зарубежных породных ассоциаций (голштинского скота США, Канады, Германии, ангусского скота США, Национальный племенной регистр свиней США и др.) решений о полном переходе на использование для генетической экспертизы ДНК-анализа. Преимущество такой диагностики, наряду с оптимальными техническими и функциональными характеристиками, - большая информативность. Кроме того, созданные ДНК-банки - основа генетического мониторинга пород и популяций [4], исследований по идентификации и внедрению технологий маркерной селекции [5].
Мониторинг, проведеннный на основании патентной и иной документации показал, что для ДНК-экспертизы животных - объектов сельскохозяйственного назначения - организацией FAO и международным обществом генетики животных (^АО) рекомендуется использование микросателлитов - высоко полиморфных последовательностях ДНК, равномерно распределенных по всему геному [6]. Согласно рекомендациям FAO и ^АО [7, 8], к микросателлитным локусам должны применяться следующие требования: доступ к последовательности посредством общественно-доступного домена (сеть Интернет);
*Исследования выполнены при финансовой поддержке Минобрнауки РФ, проект № 16.512.11.2212.
картирование и не сцепленное наследование; мен-делевский тип наследования (высоко мутагенные микросателлиты могут отклоняться от распределения по Менделю, что не удобно для определения генетических расстояний); наличие в среднем не менее 4-х аллелей и значение PIC (содержание полиморфной информации) более 0,6; возможность использования на всем виде в целом; возможность простого и достоверного типирования. Кроме того,перечисленные требования дополняют технические аспекты [9, 10]: подходящий размер аллелей; «работоспособность» праймеров в ПЦР; отсутствие нулевых аллелей; возможность мультиплексного исследования нескольких локусов (близкие значения температур плавления праймеров); локализация на различных хромосомах.
Цель нашей работы - изучение функциональных и потребительских свойств разработанных мультило-кусных тест-систем для проведения ДНК-экспертизы пяти видов сельскохозяйственных животных - крупного рогатого скота, свиней, овец, кур и медоносной пчелы.
Условия, материалы и методы. Исследования проводили на базе Центра коллективного пользования научным оборудованием «Биоресурсы и биоинженерия сельскохозяйственных животных» ВИЖ Россельхозакадемии. Материалом для исследований служили образцы ДНК крупного рогатого скота черно-пестрой (n=30), симментальской (n=30) и бурой швицкой пород (n=30), свиней крупной белой породы (n=30), ландрас (n=30) и дюрок (n=30), овец пород советский меринос (n=30), романовская (n=30) и каракульская (n=30), кур пород орловская ситцевая (n=30), австралорп черно-пестрый (n=30) и ушанка (n=30), медоносной пчелы среднерусской (n=50), карпатской (n=50) и серой горной кавказской пород (n=50). Были изучены следующие функциональные характеристики тест-систем: мультиплексность (способность одновременного анализа нескольких локусов в одной реакции), специфичность (доля генотипированных локусов, %), среднее число аллелей на локус (Na), среднее число информативных аллелей (встречающихся с частотой 5 % и более) на локус (Na>5 %), среднее число эффективных аллелей на локус (Ne). Оценку потребительских свойств тест-систем проводили по следующим показателям [11, 12, 13]: вероятность совпадения генотипов животных (PI), точность подтверждения происхождения по обоим (PX1) и по одному (PX2) родителю, точность исключения родителей (PX3), средний уровень исключения при определении породной принадлежности (Q, %). В проведении расчетов использовали программное обеспечение GenAlEx (версия 6.4) и Structure (версия 3.2.1).
Результаты и обсуждение. Разработанные тест-системы обладают следующими характеристиками:
высокая информативность, обусловленная высоким уровнем полиморфизма, - среднее число аллелей на локус от 5,47±0,26 до 9,79±0,57 (см. табл.);
относительно невысокая трудоемкость, обусловленная автоматизацией и возможностью исследований 5...8 локусов в одной реакции;
Таблица. Функциональные характеристики и потребительские свойства тест-систем для ДНК-экспертизы животных - объектов сельскохозяйственного назначения________________________________
Показатель Вид животных
Bos taurus Sus scrofa Ovis aries Gallus gallus Apis mellifera
Исследовано голов go go go go 15o
Исследовано пород З З З З З
Число локусов ІЗ І2 ІІ 8 7
Число реакций 2 2 2 І 1
Мультиплексность 6 / 7 6 / 6 6 / 5 8 7
Специфичность, % 99,7 99,5 99,5 100,0 99,8
№ 6,57±0,32 5,47±0,26 9,79±0,57 6,50±0,50 7,33±0,83
Na>5% 4,82±0,38 3,94±0,21 6,03±0,35 4,38±0,69 3,88±0,49
Ые 3,74±0,20 2,96±0,15 5,57±0,37 3,41±0,41 3,47±0,44
Р1 7,3*10-12 3,4*10-11 4,0*10-12 8,9*10-11 9,7*10-11
РХ1 99,99 99,78 99,99 99,53 99,51
РХ2 99,39 95,23 99,71 93,14 92,95
РХ3 99,999 99,992 99,999 99,970 99,906
Q, % 87,9±0,9 97,3±0,3 95,5±0,8 93,9±2,1 92,1±1,8
широкий спектр прикладного применения; высокая специфичность (доля генотипированных
более низкая (в 2,5-3 раза) стоимость, по сравне- локусов 99,5...100 %), точность подтверждения (более
нию с зарубежными тест-системами; 99,5 %) и исключения родителей (более 99,5 %), провозможность использования для анализа любого изводительность.
исходного материала (ткань, кровь, молоко, сперма) Результаты проведенных исследований могут
и диагностики в раннем возрасте не зависимо от пола найти применение в проведении генетической экс-
животных (в отличие от системы анализа групп крови), пертизы животных, а также в выполнении фундамен-
а также исследования образцов после длительного тальных и прикладных НИР, направленных на изучение
хранения при низких температурах; состояния и динамики аллелофонда популяций живот-
высокая специфичность (99,5 % и более геноти- ных - объектов сельскохозяйственного назначения,
пированных локусов) и способность документации разработку приемов эффективного использования и
результатов в электронном виде; управления генофондом пород.
Литература.
1. Оценка быков-производителей по генетическим маркерам групп крови/ Букаров Н.Г., Хрунова А.И., Новиков А.А., Мишина Н.С., Политкин Д.Ю. // Зоотехния. - 2010. - № 11. - с. 2-3.
2. Некоторые аспекты использования микросателлитов в свиноводстве / Зиновьева Н.А., Сизарева Е.И., Гладырь Е.А., Проскурина Н.В., Шавырина К.М. //Достижения науки и техники АПК. - 2009. - № 8. - с. 38-41.
3. Оценка результативности тест-системы на основе микросателлитов в проведении ДНК-экспертизы крупного рогатого скота/Гладырь Е.А., Горелов П.В., Маурчева В.Н., Шахин А.В., Чинаров Ю.И., Зиновьева Н.А. //Достижения науки и техники АПК. - 2011. - № 8. - с. 51-54.
4. Сохранение и рациональное использование генофонда животных/Багиров В.А., Насибов Ш.Н., Кленовицкий П.М., Лесин С.А., Воеводин В.А., Зиновьева Н.А., ЭрнстЛ.К., В.В. Калашников, В.А. Солошенко//Доклады РАСХН. - 2009. - № 2. - с 37-40.
5. Роль ДНК-маркеров признаков продуктивности сельскохозяйственных животных/Зиновьева Н.А., Костюнина О.В., Гладырь Е.А., Банникова А.Д., Харзинова В.Р., Ларионова П.В., Шавырина К.М., ЭрнстЛ.К. //Зоотехния. - 2010. - № 1. - с. 8-10.
6. Tautz D. Hypervariability of simple sequences as a general source for polymorphic DNA markers // Nucleic Acids Research. -1989. - 17. - 6463-6471
7. Measurement of Domestic Animal Diversity (MoDAD): Recommended Microsatellite Markers // Secondary Guidelines for Development of National Farm Animal Genetics Resources Management Plants, Rome: FAO Swines, 1998. p. 19-24.
8. Measurement of Domestic Animal Diversity (MoDAD): New Recommended Microsatellite Markers // FAO/ISAG, 2004, режим доступа: http://dad.fao.org/.
9. Solinas T.S., Fries R., Steffen P. Physically mapped cosmid derived microsatellite markers as anchor loci on bovine chromosomes //Mamm. Genome. - 1993. - Vol. 4. - p. 720-727.
10. Bailey Е., Reid R.C., Skow L.C. Linkage of the gene for equine combined immunodeficiency disease to microsatellite markers HTG8 and hTg4; Synteny and FISH mapping to ECA9//Animal Genetics. - 1997. - Vol. 28. - p. 268-273.
11. Peakall R., Ebert D., Cunningham R., Lindenmayer D.B. Mark-recapture by genetic tagging reveals restricted movements by bush rats, Rattus fuscipes, in a fragmented landscape // Journal of Zoology. - 2006. - 268. - 207-216.2006.
12. Jamieson A., Taylor S.C.S. Comparisons of three probability formulae for parentage exclusion //Animal Genetics. - 1997. -28. - 397-400.
13. Pritchard J. K., Stephens M., Donnelly P. Inference of population structure using multilocus genotype data // Genetics. - 2000.
- 155. - 945-959.
GENETIC EXPERTISE OF AGRICULTURAL ANIMALS: APPLICATION OF THE TEST SYSTEMS
BASED ON MICROSATELLITES
N.A. Zinov’eva, E.A. Gladyr
Summary. The characteristic of the test-systems based on microsatellites for application in genetic expertise of agricultural animals
- cattle (13 loci), swine (12 loci), sheep (11 loci), chicken (8 loci) and honey bee (7 loci) was done. The study of DNA samples of three breeds of each of five animal species Bos taurus (n=90), Sus scrofa (n=90), Ovis aries (n=90), Gallus gallus (n=90) u Apis mellifera (n=150) showed the possibility to analyze 5 to 8 loci per reaction. The average number of allele per loci is varied of 5,47±0,26 in swine to 9,79±0,57 in sheep. The probabilities of genotype identity in dependence of animal species were 4,0 • 10-12 to 9,7-10-11. The possibility of the application of developed systems for parentage verification (P>0.95) and breed purity detection (Q>87,9) was shown.
Key words: genetic examination, test-systems, paternity, microsatellite, cattle breeds
