CC BY
101
УДК 575.86:636.295
МОДЕЛИРОВАНИЕ ТЕСТ-СИСТЕМЫ АНАЛИЗА МИКРОСАТЕЛЛИТОВ ВЕРБЛЮДОВ*
Е.А. ГЛАДЫРЬ, кандидат биологических наук, зав. лабораторией
ВНИИ животноводства Россельхозакадемии
A.М. ЗАЙЦЕВ, кандидат сельскохозяйственных наук, зам. директора
ВНИИ коневодства Россельхозакадемии Е.П. КУДИНА, младший научный сотрудник ВНИИ животноводства Россельхозакадемии
B.В. КАЛАШНИКОВ, академик Россельхозакаде-мии, директор
ВНИИ коневодства Россельхозакадемии Н.А. ЗИНОВЬЕВА, член-корреспондентРоссельхо-закадемии, зам. директора
ВНИИ животноводства Россельхозакадемии E-mail: elenagladyr@mail.ru
Резюме. Из всех существующих в мире пород двугорбых верблюдов калмыцкие бактрианы наиболее ценны по мясной, шерстной и молочной продуктивности. Небольшая их численность на территории РФ свидетельствует о необходимости молекулярно-генетического контроля состояния популяции этих животных для поддержания биоразнообразия. Во ВНИИ животноводства Россельхозакадемии смоделирована мультиплексная тест-система, позволяющая проводить одновременный анализ восьми микросателлитных локусов верблюдов (YWLL44, YWLL08, YWLL38, LCA66, LCA19, LCA37, CMS16, VOLPIO) с использованием двух красителей FAM и R6G на ДНК-анализаторе ABI 3130 x l. В работе показана информативность созданной тест-системы на примере верблюдов калмыцкой породы вида Camelus bactrianus L. (в эксперименте использовали пробы крови от 32 гол. животных). Число выявленных аллелей в исследуемой популяции варьировало от трех в локусе LCA37 до четырнадцати в локусе YWLL08. Среднее число аллелей на локус составило 6,75 ±
1,24, число эффективных аллелей на локус - 3,52 ± 0,97. В трех микросателлитных маркерах зафиксирован существенный дефицит гетерозиготных генотипов. Так, в локусах YWLL44 и LCA37 он составил 21,2 и 22,1 % соответственно, а в локусе YWLL08 - 50,9 %, что, возможно, указывает на использование ограниченного числа производителей. На основании результатов анализа генеалогического древа следует отметить значительную близость основного массива верблюдов породы калмыцкий бактриан: все исследованные животные образуют три кластера, включающих от трех до пятнадцати особей. Ключевые слова: микросателлиты (МС), молекулярные методы, тест-система, верблюды
Генетическое разнообразия верблюдов с помощью ДНК технологий активно изучают во многих лабораториях США, ЕС, Саудовской Аравии, Индии, Южной Африки. Такая ситуация обусловленатем,что разведение этих животных и переработка их продукции - важная экономическая составляющая многих стран мира, а молекулярно-генетический контроль состояния популяций необходим для поддержания биоразнообразия.
Из всех существующих пород двугорбых верблюдов наиболее ценны по мясной, шерстной и молочной продуктивности калмыцкие бактрианы. В то же время численность их составляет всего 5,5 тыс. гол., а ее прирост за последнее десятилетие - 0,5 тыс. гол. Такое положение обостряет необходимость использования генетических методов контроля уровня биоразнообразия в этой малочисленной популяции.
Сегодня для молекулярно-генетического мониторинга верблюдов используют ряд методов, среди
*Исследования выполнены при финансовой поддержке Минобрнауки РФ, проект № 14.740.12.0821.
которых можно назвать анализ SNP [1], STR [2, 3], митохондриальной ДНК [4], RAPD [5].
Спектр микросателлитов (МС), рекомендованных FAO/ISAG [6, 7] для проведения сравнительного тестирования верблюдов, включает 25 маркеров, охарактеризованных в работах ряда исследователей [8...16]. Многими авторами разработаны оригинальные методики с использованием от 7 до 17 МС [8, 15, 17.23]. Приведенные тест-системы применяют для характеристики верблюдов (дромедаров и бактрианов), альпаки и ламы из Африки, Австралии, Латинской Америки и Евразии.
Коллективом Центра биотехнологии ВНИИ животноводства Россельхозакадемии совместно с институтами Отделения зоотехнии накоплен богатый теоретический и практический опыт по разработке тест-систем анализа МС различных видов сельскохозяйственных животных [24.28].
Цель нашего исследования - экспериментальное моделирование тест-системы анализа МС верблюдов.
Условия, методы и материалы. Исследования проводили на базе Центра коллективного пользования научным оборудованием «Биоресурсы и биоинженерия сельскохозяйственных животных» ВНИИ животноводства. Материалом для исследований служили пробы крови от 32 гол. верблюдов вида бактриан Camelus bactrianus L. калмыцкой породы племенного завода «Родина» Астраханской области. ДНК выделяли с помощью набора реагентов DIAtomTM DNA Ргер100. Анализ ДНК и постановку ПЦР проводили согласно «Методическим рекомендациям ...» [29]. Выбор микросателлитных локусов выполняли в соответствии с рекомендациями Европейского общества генетиков (FAO/ISAG). Исследование 8 МС осуществляли на ДНК-анализаторе АВ1 3130 х I по методикам Центра биотехнологии и молекулярной диагностики ВНИИ животноводства Россельхозакадемии. Статистическую обработку данных проводили с использованием программного пакета GenAIEx, версия 6.4 (2010 г.), генетические дистанции рассчитывали по Ые1 М. [30].
результаты и обсуждение. Изучение общедоступных информационных баз данных, а также рекомендаций FAO/ISAG позволило определить спектр микросателлитных локусов для моделирования мультиплексной панели МС анализа верблюдов. Исходя из того, что в Российской Федерации в Реестр селекционных достижений внесен только один вид верблюдов бактриан Camelus bactrianus L., а на территории СНГ (Туркмения, Узбекистан, Казахстан, Азербайджан) разводят и одногорбых верблюдов вида Camelus dromedarius L. - породы арвана, мы разрабатывали систему, пригодную для анализадвухэтихвидов. При-
„„ 86 120 132 177 1 F AM I II || — . ^ 1 1 1 30 200 220 262 I I I
Г YWLL44 | Г YWLL08 | YWLL38 1 Г LCA66
■ I LCA19 - LCA37 CMS16 1 VOLWO—Г
— '80 1181 128 180 183 207 236 290
рис. 1. Модель системы генетического анализа верблюдов (бактрианов и дромедаров) на основе мультиплексного анализа 8 МС: (локусы, амплифицируемые с использованием праймеров, меченных FAM, и соответствующие минимальные и максимальные длины фрагментов в парах оснований (п.о.) показаны вверху, локусы, меченные R6G - внизу.
ляции варьировало от трех в локусе LCA37 до четырнадцати в локусе YWLL08. Среднее их число на локус составило 6,75 ± 1,24, при этом число эффективных аллелей в изучаемой популяции, оцененное с использованием разработанной системы, составило 3,52 ± 0,97 аллеля на локус (рис. За).
Наблюдаемый уровень гетерозиготности (Ho) находился на отметке 49,0 % (рис. Зб), при этом ожидаемое его значение (He) составило 57,7%, что со-
Рис. 2. Результаты анализа продуктов мультиплексной ПЦР восьми локусов МС верблюдов поставимо с данными, п°-(название микросателлитов указано в прямоугольниках). нимая во внимание локализацию микросателлитных маркеров на различных хромосомах, длины образующихся амплифицированных фрагментов микросателлитных локусов, теоретически общую температуру амплификации, а также возможность использования различных флуоресцентных красителей для мечения фрагментов мы выбрали 8 локусов - YWLL44, YWLL08,
YWLL38, LCA66, LCA19, LCA37, CMS16, VOLPIO, идентификацию которых в одной реакции можно осуществиь с использованием всего двух красителей (FAM и R6G), что значительно снижает затраты на выполнение исследований (рис. 1).
Фрагменты мультиплексной амплификации всех восьми микросателлитных локусов можно четко идентифицировать. Так, наличие единичных фрагментов (пиков) в маркерах LCA66 (аллель 213) и VOLPIO (аллель 239) свидетельствует о гомозиготности индивидуума по этому локусу (рис.2).
Присутствие двух пиков демонстрирует гетерози-готность индивидуума по локусам YWLL44 (аллели 99 и 110), YWLL08 (аллели 149 и 151), YWLL38 (аллели 182 и 184), LCA19 (аллели 81 и 110), LCA37 (аллели 133 и 157) и CMS16 (аллели 187 и 195).
Предварительная оценка полученных результатов показала, что исследуемые локусы МС полиморфны у всех 32 изученных особей калмыцкой породы бактрианов. Число выявленных аллелей в исследуемой попу-
локусе YWLL08 - 50,9 %, что, возможно, указывает на использование ограниченного числа производителей.
Анализируя формирующуюся кластерную структуру генеалогического древа, следует отметить значительную генетическую близость основного массива верблюдов породы калмыцкий бактриан (рис. 4).
Все исследованные животные образуют три кластера, включающие в себя от трех до пятнадцати особей.
выводы. Таким образом, созданная тест-Рис. 3. Характеристика информативности тест-системы: а) количество аллелей - система анализа МС вер-всего (Ыа); -а- - эффективных (Ые); ■= -информационный индекс Шеннона (I); блюдов достаточно ин-б) уровень гетерозиготности- наблюдаемый (Но), ♦-ожидаемый (Не). формативна и позволяет
лученными при исследовании пород и популяций крупного рогатого скота (63,1.84,6 % [31]), свиней (55,1.69,7% [32]) и кур (42.75 % [27]). Некоторый избыток гетерозигот (от
і і ‘ і і І і і * і 4 8 С Є 20 24 28 32
рис. 4. Дендрограмма генетических расстояний 32 гол. бактрианов калмыцкой породы
3 до 9 %) зафиксирован в трех из восьми МС локусов - CMS16, LCA19 и \WLL38. В трех микросателлитных маркерах установлен существенный дефицит гетерозиготных генотипов. Так, в локусах \WLL44 и LCA37 он оказался равен 21,2 и 22,1 %, соответственно, а в
выполнять молекулярно-генетические исследова- весьма ценную в научном плане информацию для
ния вида Camelus bactrianus L. на популяционно-ге- дальнейшей работы по характеристике биоразно-
нетическом уровне. С ее помощью можно получать образия верблюдов
Литература.
1. Ketchum M.S. Compositions, methods and systems for the simultaneous determination of parentage, identity, sex, genotype and/or phenotype and breed determination in animals // Патент США на изобретение № US 2011/0129825 от 03.08.2008.
2. Nolte M. The genetic characterization of Camelus Dromedarius in Southern Africa/ Diss. Master of Science in Zoology, Rand Afrikaans university, 2003, 153 p.
3. Nolte M., Kotze A., van der Bank F.H., Grobler J.P. Microsatellite markers reveal low genetic differentiation among southern African Camelus dromedarius populations //South African Journal of Animal Science. - 2005. - V. 35 (3). - P. 152-161.
4. Kadwell M., Fernandez M., Stanley H.E., Baldi R., Wheller J.C., Rosadio R., Bruford M.W. Genetic analysis reveals the wild ancestors of the llama and the alpaca//Proc. R. Soc. Lond. B. - 2001. - V. 268. - P. 2575-2584.
5. Mahrous K. F., Ramadan H.A. I., Abdel-Aziem S.H., Mordy M. Abd-El, Hemda D.M. Genetic variations between camel breeds using microsatellite markers and RAPD techniques// Journal of Applied Biosciences. - 2011. - 39. - 2626 - 2634.
6. FAO. Measurement of domestic animal diversity - a review of recent diversity studies// CGRFA/WG-AnGR-3/04/Inf. 3, 2004, 38 p.
7. FAO. Intergovernmental technical working group on animal genetic resources for food and agriculture // CGRFA/WG-AnGR-6/10/ Inf.7, 2010, 66 p.
8. Evdotchenko D., Han Y., Bartenschlager H., Preuss S., Geldermann H. New polymorphic microsatellite loci for different camel species//Molecular Ecology Notes. - 2003. - 3. - P. 431-434.
9. Jianlin, H., Mburu, D.N., Ochieng, J.W., Kaufmann, B., Rege, J.E.O. and Hanotte, O. Application of New World Camelidae microsateliite primers for amplification of polymorphic loci in Old World camelids.// Animal Genetics. - 2000. - 31. - 404-406.
10. Jianlin, H., Ochieng, J.W., Lkhagva, B. and Hanotte, O. Genetic diversity and relationship of domestic Bactrian camels (Camelus bactrianus) in China and Mongolia // Journal of Camel Practice and Research. - 2004.
11. Lang, K.D., Wang, Y. and Plante, Y. Fifteen polymorphic dinucleotide microsatellites in llamas and alpacas.//Animal Genetics. -1996. - 27. - 293.
12. Mariasegaram, M., Pullenayegum, S., Jahabar Ali, M., Shah, R.S., Penedo, M.C.T., Wernery, U. and Sasse, J. Isolation and characterisation of eight microsatellite markers in Camelus dromedaries and cross-species amplification in C. bactrianus and Lama pacos.// Animal Genetics. - 2002. - 33. - 385-387.
13. Mburu, D.N., Ochieng, J.W., Kuria, S.G., Jianlin, H., Kaufmann, B., Rege, J.E.O. and Hanotte, O. Genetic diversity andrelationships of indigenous Kenyan dromedary (Camelus dromedarius) populations: Implications for their classification.//Animal Genetics. - 2003. - 34. - 26-32.
14. Obreque, V., Coogle, L., Henney, P.J., Bailey, E., Mancilla, R., Garcia-Huidobro, J., Hinrichsen, P. and Cothran, E.G. Characterisation of 10 polymorphic alpaca dinucleotide microsatellites.//Animal Genetics. - 1998. - 29. - 461-462
15. Penedo M.C.T., Caetano A.R., Cordova K. Eight microsatellite markers for South American camelids. //Animal Genetics. -1999. - 31. - 166-167.
16. Sasse, J., Mariasegaram, M., Balu, R., Kinne, J. and Wernery, U. South American camelid microsatellite amplification in Camelus dromedaries.//Animal Genetics. - 2000. - 31. - 75-76.
17. Penedo M.C.T., Caetano A.R. Cordova K. Eight microsatellite markers for South American camelids//Anim. Genet. - 1998a. -29. -166-167.
18. PenedoM.C.T., CaetanoA.R., Cordova K. Microsatellite markers for South Americancamelids.//Anim. Genet, 1998b. -29. -411-412.
19. Han Y., Evdoschenko D., Hue G., Reiner G., Geldermann H.. Screening and analysis of new microsatellite loci in camels. -University of Hohenheim, Stuttgart, Germany, 2000.
20. Mehta S.C., Goyal A., Sahani M.S. Microsatellite markers for genetic characterisation of Kachchhi camel. //Indian Journal of Biotech. - 2007a. - N.6. - P.336-339.
21. Mehta S.C., Sahan M.S. Microsatillite markers for genetic. Characterisation of Hikaneri camel. //Indian Journal of Animal Sci.
. - 2007b. - V.77. - 510-512.
22. Agapito J., Rodriguez J., Herrera-Velit P. et al. Parentage testing in alpacas (Vicugna pacos) using semi-automated fluorescent multiplex PCRs with 10 microsatellite markers//Animal Genetics. - 2008. - V.39. - P. 201-203.
23. Spencer P. B. S., Wilson K. J., Tinson A. Parentage testing of racing camels (Camelus dromedarius) using microsatellite DNA typing//Animal Genetics. - 2010. - V. 41. - P. 662-665, doi: 10.1111/j.1365-2052.2010.02044.x.
24. Гладырь Е.А., Зиновьева Н.А., Брем Г. Характеристика генофонда и выявление генеалогических связей между породами овец России с использованием ДНК-микросателлитов//Доклады российской академии сельскохозяйственных наук. - 2004. - № 2. - С. 26.
25. ЭрнстЛ.К., Зиновьева Н.А., Коновалова Е.Н., Гладырь Е.А., Бабаян О.В. Изучение влияния прилития крови голштинского скота на изменение генофонда крупного рогатого скота отечественных пород с использованием ДНК-микросателлитов //Зоотехния. - 2007. - № 12. - С. 2-4.
26. Зиновьева Н.А., Сизарева Е.И., Гладырь Е.А., Проскурина Н.В., Шавырина К.М. Некоторые аспекты использования микросателлитов в свиноводстве//Достижения науки и техники АПК. - 2010. - № 8. - С. 38-41.
27. Фисинин В.И., Гладырь Е.А., Волкова В.В., Севастьянова А.А., Зиновьева Н.А. Анализ генетической структуры породдомаш-них кур с использованием микросателлитных маркеров//Проблемы биологии продуктивных животных. - 2011. - Т. 1. - С. 68-72.
28. Кривцов Н.И., Гладырь Е.А., Волкова В.В., Форнара М.С., Лебедев В.И., Зиновьева Н.А. Характеристика аллелофонда трех пород медоносной пчелы России с использованием микросателлитов // Проблемы биологии продуктивных животных. - 2011. - Т. 1. - С. 41-45.
29. Зиновьева Н.А., Попов А.Н., Эрнст Л.К., Морзанов Н.С., Бочкарев В.В., Стрекозов Н.И., Брем Г. Методические рекомендации по использованию метода полимеразной цепной реакции в животноводстве. - Дубровицы: ВИЖ, 1998. - 47 с.
30. Nei M., Tajima F., Tateno, Y. Accuracy of estimated phylogenetic trees from molecular data//J.Mol. Evol.. - 1983. - 19. - 153-170
31. Горелов П.В. Генетическая характеристика новых типов скота бурой швицкой и сычевской пород смоленской области по микросателлитам: Автореф. дис. канд. биол. наук. - Дубровицы, 2010. - 18 с.
32. Тихомирова Т.И. Разработка системы генетического анализа свиней на основе мультиплексного исследования ДНК-микросателлитов: Автореф. дис. канд. биол. наук. - Дубровицы, 2007. - 14 с.
development of the test system for the microsatellite analysis of camels
E.A. Gladyr, A.M. Zajtzev, E.P. Kudina, V.V. Kalashnikov, N.A. Zinovieva
summary. The multiplex test-system for the simultaneous analysis of eight microsatellite loci of camels (YWLL44, YWLL08, YWLL38, LCA66, LCA19, LCA37, CMS16, and VOLPIO) was developed. The informativity of created systems on example of camels of Kalmyk breed (n=32) of Camelus bactrianus L. specie was shown. The average number of alleles per loci was 6.75±1.24, the number of effective alleles per loci - 3.52±0.97. The analysis of heterozygote levels in analyzed population shows 8.7 per cent of heterozygous genotypes. The construction and analysis of genealogical tree was performed.
Key words: microsatellites, molecular methods, test kits, camels.
