CC BY
62
Биомедицина • № 3,2012, С. 116-120
е КРАТКИЕ СООБЩЕНИЯ
Генетическая модель пародонтоза и коррекция основных признаков заболевания стволовыми и прогениторными клетками костного мозга
О.И. Степанова, О.В. Баранова, Х.Х. Семенов, Н.В. Касинская, Л.Х. Казакова, В.Н. Каркищенко
ФГБУ «Научный центр биомедицинских технологий» РАМН, Московская область Контактная информация: к.б.н. Ольга Ивановна Степанова [email protected]
Изучен положительный терапевтический эффект культивированных клеток костного мозга на коррекцию патогенетических нарушений пародонтоза у генетических мышей линии ВКЗиЫТ.
Ключевые слова: пародонтоз, мыши ВКЗиЫТ, стволовые и прогениторные клетки костного мозга.
Пародонтоз - одна из наиболее распространенных и сложных патологий челюстно-лицевой области. Рост заболеваемости пародонтоза свидетельствует, что современная медикаментозная терапия не способна надежно препятствовать возникновению и прогрессированию основных симптомов пародонтоза. Поэтому поиск и разработка новых подходов к лечению пародонтоза остается актуальной проблемой современной медицины.
Цель исследования - изучить возможности коррекции патогенетических нарушений пародонтоза на экспериментальной генетической модели с помощью аллогенных клеток костного мозга от здоровых доноров.
Материалы и методы Для коррекции основных признаков пародонтоза использовали генетическую модель мышей линии ВК8! Л” Г. Эта модель характеризуется генетическим заболеванием зубов и околозубного пространства у 100% животных - опытная группа (п=20).
Контрольную группу составили мыши той же линии (п=20) без введения клеток костного мозга (ККМ).
В опытной и контрольной группах использовали мышей в возрасте 2-3 мес. и 7 мес. после рождения. Для коррекции нарушений пародонтоза у опытных мышей использовали культивированные аллогенные клетки (гемопоэтической и стромальной фракций) костного мозга (КМ) от здоровых доноров мыши линии С57ВЫ0.
Трансплантацию аллогенных ККМ проводили шестикратно, сначала вводили 3-х-кратно с интервалом в 5 дней в количестве 600-650 тыс. гемопоэтические клетки костного мозга (ГПККМ), моно-нуклеарную фракцию, культивированные в течение 5 сут; затем 3-х-кратно (с интервалом в 7 дней) в количестве 100-150 тыс. культивированные в течение 14 сут мультипотентные мезенхимальные стромальные (фибробластоподобные) ККМ (ММСК КМ).
Введение ККМ проводили внутри-брюшинно, возраст доноров соответствовал возрасту реципиентов, срок наблюдений составил 6 мес. В динамике проводили клинические и гистологические исследования ротовой полости больных животных.
Гистологические методы были применены для исследования зубов нижней и верхней челюсти на декальцинирован-ных парафиновых срезах, окрашенных гематоксилином и эозином. Зубы и кости нижней и верхней челюсти мышей фиксировали в нейтральном формалине с последующей декальцинацией по Шафферу в 7,5% азотной кислоте в течение 2-3 сут. После декальцинации для подавления набухания соединительной ткани кусочки размещали в 5% р-р сернокислого натрия на 24 ч с последующей промывкой и проводкой с заключением в парафин. Резку блоков проводили на микротоме (Ж!:1С1 II :КТ-Д 'Х'О толщиной в 6 микрон. Для окраски срезов использовали гематоксилин «Караци» и эозин водо-ростворимый, а далее заключали в сибирский бальзам. Результаты оценивали на микроскопе фирмы «\1КО\» (Япония). Для фотографирования использовали цифровой фотоаппарат фирмы «ОЦУМРШ» (Япония).
Результаты и их обсуждение
После введения культивированных аллогенных ККМ у мышей ВК81 Л”Г наблюдали клиническое и функциональное состояние ротовой полости. При оценке гистологических изменений опытной и контрольной групп мы учитывали изменения тканей десны и зубов опытных животных в разные сроки после введения ККМ.
Клинически при осмотре ротовой полости контрольной группы поражения твердых тканей зуба в виде эрозии эмали и клиновидных дефектов не отмечалось, однако было выявлено у мышей, особенно в возрасте 7 мес. после рождения, выраженное пожелтение (налет) эмали зубов, которое сопровождалось также увеличением щели между резцами и расшатыванием зубов.
После внутрибрюшинного введения ККМ у мышей ВК81 Л”Г наблюдали клиническое и функциональное состояние ротовой полости. У мышей опытной группы слизистая оболочка рта розового цвета, не кровоточит, плотно прилегает к зубам. Десневые сосочки, образуя четкую фестончатость, занимают межзубные промежутки в области шеек зубов. Десна плотная, пародонтальные карманы отсутствуют, а зубы плотно прилегают друг к другу.
При гистологическом исследовании у мышей контрольной группы (без введения ККМ) слизистая оболочка десны была покрыта дистрофически измененным многослойным плоским эпителием с признаками атрофии, выраженного гиперкератоза с участками акантотиче-ских тяжей, были выявлены выраженные дистрофические изменения, что проявлялось в уменьшении количества клеток в слоях многослойного плоского эпителия, истончении преимущественно базального
и шиповатого слоев, в расширении рогового слоя. Собственная пластинка слизистой оболочки десны была с признаками выраженного отека соединительнотканных волокон всех слоев (поверхностного сосочкового и более глубокого сетчатого слоя), определялись единичные спавшиеся сосуды капиллярного типа.
У мышей контрольной группы в области костной ткани зубной лунки отмечались дистрофические процессы в виде умеренно выраженной прогрессирующей гладкой резорбции костной ткани. Отмечалось умеренно выраженное истончение костных пластинок межальвеолярных перегородок, расширение костномозговых пространств, так называемое широкопетлистое строение костной ткани, ретракция десны с формированием патологического зубнедесневого кармана с расшатыванием зубов (клинически), без макроскопических и микроскопических признаков воспаления. Выстилающий зубнодесневый карман эпителий был представлен двумя слоями клеток - поверхностным сосочковым и более глубоким сетчатым, состоящим из несколько уплощенных клеток. Дно десневой борозды находилось ниже уровня эмалевоцементного соединения.
Периодонт был представлен тонким слоем отечных разрыхленных коллагеновых волокон.
На продольном шлифе зубов определялся однородный дентин, обычного строения и толщины. Пульпарная полость, находящаяся внутри зуба, была несколько сужена в области пульпар-ной камеры, количество пульпы было уменьшено, пульпа представлена рыхлой волокнистой, местами фрагмен-трированной соединительной тканью с единичными сосудами прекапиллярного и капиллярного типов, большая часть
которых находилась в спавшемся состоянии, окружающие сосуды клетки - макрофаги и фибробласты - практически не определялись. Слой одонтобластов был представлен одним рядом кубических клеток, местами расположенных беспорядочно. Слой эмали был истончен, представлен однородной плотной обызвествленной тканью.
У мышей опытной группы (через 1, 3 и 6 мес. после введения ККМ) состояние слизистой оболочки десны было в пределах нормы. Покрывающий десну многослойный плоский эпителий был представлен всеми слоями клеток, с незначительными признаками гиперкератоза (норма). Собственная пластинка слизистой оболочки десны также соответствовала норме, была представлена двумя слоями - поверхностным сосочковым и более глубоким сетчатым. Сосочковый слой был образован рыхлой соединительной тканью, с многочисленными сосудами и нервами. Сетчатый слой был образован более плотной соединительной тканью. Строение десны в области десневой борозды было в пределах нормы, покрывающий ее эпителий представлен двумя слоями несколько уплощенных клеток. Десневая борозда имела вид щелевидного пространства - желобка, неразличимого макроскопически. Дно десневой борозды находилось на уровне эмалево-цементного соединения.
Изменения альвеолярной кости в опытной группе были представлены расширенными многочисленными прободающими каналами и нишами компактной кости, с формированием «лакун», заполненных кровью, однако данные участки чередовались с участками плотной компактной кости.
Периодонт был представлен плотной соединительной тканью, содержащей
многочисленные сосуды прекапиллярно-го и капиллярного типов, соединительнотканные волокна периодонта полностью заполняли пространство между стенками костных ячеек и веществом цемента зуба, между волокнами периодонта определялись многочисленные мелкие сосуды (артериолы, капилляры), часть из которых образовывала петлевые структуры.
Дентин был обычного строения и толщины. Пульпарная полость была несколько расширена, пульпа полностью заполняла пространство пульпарной камеры, была представлена рыхлой волокнистой соединительной тканью с многочисленными, расположенными среди волокон клетками гематогенного и гистиоцитарного происхождения, отмечались многочисленные расширенные, полнокровные сосуды микроциркулятор-ного русла.
В опытной группе отмечались выраженные признаки ангиогенеза вблизи слоя одонтобластов, которые были представлены несколькими рядами (2-3) высоких призматических клеток. Анализ животных в данной группе показал, что сходные изменения тканей десны и зуба были как у более молодых животных (2-3 мес.), так и у старых (7 мес.).
Гистологические исследования показали, что более выраженные положительные клинические результаты были получены через 3 мес. после введения ККМ, что было подтверждено нами гистологически. Позитивная динамика коррекции пародонтоза также сохранялась у животных и через 6 мес. после введения донорских клеток КМ.
Выводы
1. Мыши линии НК81 Л”Г являются адекватной экспериментальной генетиче-
ской моделью пародонтоза, т.к. воспроизводят функциональные и структурные изменения заболевания в челюстно-лице-вой области.
2. Выявлено, что выраженность терапевтического эффекта клеток костного мозга у мышей с пародонтозом повышается: при использовании культивированных клеток; в зависимости от кратности введения клеток костного мозга гемопоэ-тических и стромальных фракций.
3. Установлено, что наиболее гистологически выраженные достоверные изменения были со стороны зубов и тканей десны в опытной группе животных после введения ККМ, обнаруженные изменения включали:
а) состояние десны у опытных мышей приближалось к норме - как со стороны многослойного плоского эпителия, так и со стороны собственной соединительной ткани - с признаками ангиогенеза в виде появления многочисленных сосудов капиллярного и прекапилярного типов, наблюдается сужение и практическое исчезновение десневого канала;
б) выраженные изменения были выявлены со стороны периодонта у мышей опытной группы, периодонт отличался более плотным компактным строением с наибольшим количеством тонкостенных сосудов и с образованием сосудистых петлевых структур;
в) выраженные изменения мы отмечали со стороны альвеолярной кости. У мышей НК81 Л”Г опытной группы отмечалась резорбция кости, появление участков компактного строения и появление расширенных «лакун», заполненных кровью;
г) изменения пульпы включали появление многочисленных расширенных сосудов капиллярного типа, а также большого количества клеток гематогенного
и гистиогенного происхождения (фибро-бластов и макрофагов), что соответствует нормальному строению пульпы;
д) мы отмечали увеличение слоев одо-нобластов обычного строения в данной группе и появление сосудов капиллярного типа вблизи нижнего слоя одонобластов.
4. Выраженное позитивное действие клеточной терапии у животных с паро-
донтозом на клинические и морфологические проявления заболевания зубов и околозубного пространства связано с длительными сроками сохранения жизнеспособности и функциональной активности донорских клеток костного мозга в организме реципиента после трансплантации.
Genetic model of periodontosis and correction of the main symptoms of a disease by stem and progenitorny cells of a marrow
O.I. Stepanova, O.V. Baranova, H.H. Semenov, N.V. Kasinskaya, L.Kh. Kazakova, V.N. Karkishchenko
The positive therapeutic effect of the cultivated cells of a marrow on correction of pathogenetic violations of periodontosis at genetic mice of the BRSUNT line is studied.
Key words: periodontosis, mice of BRSUNT, stem and progenitorny cells of a marrow.
Биомедицина • № 3,2012, C. 121-124
Идентификация нейролептиков - производных бензамида в крови методом высокоэффективной жидкостной хроматографии
P.A. Калёкин
ФГБУ Российский центр судебно-медицинской экспертизы Минздравсоцразвития РФ, Москва
Контактная информация: к.ф.н. Калёкин Роман Анатольевич [email protected]
В настоящей публикации предложен метод идентификации нейролептиков - производных бензамида (амисульприда, сульпирида и тиаприда) в извлечениях из крови. Предложенная методика позволяет с высокой воспроизводимостью и достоверностью проводить идентификацию исследуемых веществ с со-экстрактивными веществами.
Ключевые слова: нейролептики, амисульприд, сульпирид, тиаприд, кровь, ВЭЖХ.
Введение
В настоящее время в медицинской практике широко используются психотропные лекарственные средства - нейролептики, к которым также относится группа замещенных бензамида. К представителям данной группы относятся: амисульприд, сульпирид, тиаприд, которые применяются для лечения различных форм шизофрении; при психомоторном возбуждении и агрессивных состояниях, особенно при хроническом алкоголизме или в пожилом возрасте; депрессиях различной этиологии; острых маниакальных и маниакально-бредовых состояниях. Достаточно часто встречаются случаи острого и хронического отравления, передозировки этими лекарственными препаратами, а также их немедикаментозное и бесконтрольное применение [1,2].
Целью нашего исследования явилась разработка методики идентификации в извлечениях из крови наиболее современным и достоверным методом - вы-
сокоэффективной жидкостной хроматографии, поскольку в доступной научной литературе отсутствует информация по исследованию крови и идентификации в извлечениях нейролептиков - производных бензамида и их дифференциальное разделение от сопутствующих веществ. Принципиальным преимуществом пробы крови является возможность более надежно обеспечить ее сохранность, поскольку эта процедура проводится, как правило, опытным врачом [3]. Кроме того, концентрации тех или иных лекарственных веществ в крови легче поддаются интерпретации, чем в моче.
Материалы и методы
Использованный вариант модельной смеси для проведения исследования позволяет максимально приблизить условия эксперимента к реальным и получить биологическую жидкость со связанным лекарственным веществом с форменными элементами крови. Изолирование
