CC BY
33
1 КАЗАХСКИЙ МЕДИЦИНСКИЙ IУНИВЕРСИТЕТ НЕПРЕРЫВНОГО ОБРАЗОВАНИЯ
Вестник АГИУВ № 3, 2016
УДК: [616.33-092.9:615.916' 16/. 175]:615
О.Е.Акимов'*, Л.В.Мищенко', В.А.Костенко'
Украинская медицинская стоматологическая академия, г. Полтава, Украина
ГЕНЕРАЦИЯ СВОБОДНЫХ РАДИКАЛОВ И ПРОЦЕССЫ ПЕРОКСИДНОГО ОКИСЛЕНИЯ ЛИПИДОВ В СЛИЗИСТОЙ ОБОЛОЧКЕ ЖЕЛУДКА КРЫС В УСЛОВИЯХ СОЧЕТАННОЙ НИТРАТНОЙ И ФТОРИДНОЙ ИНТОКСИКАЦИИ
АННОТАЦИЯ
Исследование проведено на 52 половозрелых крысах линии Вистар в течение 30 дней с целью изучения влияния сочетанной нитратной и фторидной интоксикации на генерацию супероксидного анион-радикала (*02_), функционирование ферментативных антиоксидантных систем, интегральный показатель антиоксидантной защиты и показатели пероксидного окисления липидов (ПОЛ) в слизистой оболочке желудка крыс. Анализ результатов позволил установить синергическое влияние фторидной и нитратной интоксикации на процессы ПОЛ. Влияние на генерацию *02_ и антиоксидантные системы имеет более сложное взаимодействие.
Ключевые слова: супероксидный анион-радикал, нанодисперсный кремнезем, нитрат натрия, фторид натрия, супероксиддисмутаза, каталаза, ТБК-реактанты.
Введение. В некоторых регионах Полтавской области существует проблема повышенного содержания фторидов в питьевой воде (Карловский, Машевский, Шишацкий районы) [3]. Схожая ситуация наблюдается в южных районах Республики Казахстан (г. Алматы и некоторые города Акмолинской области) [5]. В связи с повышенным использованием органических и неорганических нитратов в сельском хозяйстве их поступление в организм человека в последние годы также повысилось [6]. Это создает условия, при которых возможно одновременное действие на организм человека двух этих патогенов. Нитрат натрия способен ингибировать избыточную генерацию супероксидного анион-радикала путем угнетения экспрессии индуцибельной ЫО-синтазы (¡N08, Е.С. 1.14.13.39) [8, 13]. Фторид натрия способен индуцировать выработку супероксида [9-12]. Фтор среди прочего способен ингибировать активность ферментативных антиоксидантных систем организма, тем самым усиливая оксидаци-онный стресс [9, 11]. Также есть данные о том, что избыточное количество нитратов может вызывать усиление пероксидного окисления ли-
пидов (ПОЛ) и снижение ферментативных антиоксидантных систем [8]. Поскольку эти вещества в основном поступают в организм peros (с водой и продуктами питания), то система пищеварения первой испытывает их негативное влияние. Одновременное воздействие двух этих патогенов на слизистую оболочку желудка является недостаточно изученным.
Цель исследования - изучение влияния сочетанной нитратной и фторидной интоксикации на генерацию супсроксидного анион-ради-кала («О:-), функционирование ферментативных антиоксидантных систем, интегральный показатель антиоксидантной защиты и показатели ПОЛ в слизистой оболочке желудка крыс.
Материалы и методы. Опыты проведены на 52 половозрелых крысах линии Wistar. Хроническое избыточное поступление нитратов и фторидов и их сочетанное поступление моделировали путем введения нитратов через желудочный зонд из расчета 500 мг/кг, фторидов - из расчета 10 мг/кг. Нитраты и фториды вводили в течение 30 дней. Все манипуляции проводили согласно «Европейской конвенции о защите позвоночных животных, используемых для иссле-
42
*riseofrevan@mail. ги
Таблица 1
Генерация супероксидного анион-радикала, состояние процессов ПОЛ и активность антиоксидан-тных систем в слизистой оболочке желудка крыс, М±т
Интактные животные, п=10 Фторидная интоксикация 10 мг/кг, п=13 Нитратная интоксикация, 500 мг/кг, п=14 Сочетанная интоксикация, п=15
Генерация »Or, н моль/г-с
Базовая 0,4+0,01 0,61±0,02* 0,82±0,02*'** 1,18+0,01*'****
НАДФН-зависимыеЭТЦ 7,17±0,16 11,4+0,09* 10,0+0,16*"* 8,04+0,22*'***'*
НАДН-зависимыеЭТЦ 4,9±0,23 5,32±0,08* 9,4+0,12"** 8,15+0,22*'***'*
НАДФН-о кс ид аз а лейкоцитов 1,33±0,03 2,05±0,02* 1,26±0,03*'** 1,76±0,02*'***'*
Содержание ТБК-реактантов,мкмоль
До инкубации 6,1 ±0,25 17,35±0,44* 8,93±0,2*'** 13,65±0,11 *'****
Послеинкубации 18,2±0,32 32,77+0,59* 25,57+0,24*'** 34,18±1,38*'****
Прирост 12,09±0,29 15,42+0,88* 16,64+0,23* 20,53+1,33*'****
Активность SOD, у.е. 0,73±0,14 0,26±0,05* 1,16±0,1*'** 0,33±0,02**
Активность CAT, н кат/г 204±4 356±32* 145±15*'** 136±10*'***
* Данные статистически значимо отличаются от интактной группы с р<0,05.
** Данные статистически значимо отличаются от фторидной интоксикации с р<0,05. *** Данные статистически значимо отличаются от фторидной интоксикации с р<0,05.
# Данные статистически значимо отличаются от фторидной интоксикации с р<0,05.
довательских и других научных целей». Животные были разделены на 4 группы:
♦ первая - интактные животные (п=10);
• вторая - группа фторидной интоксикации (п=13);
♦ третья - группа нитратной интоксикации
(п=14);
• четвертая - группа с сочетанной интоксикацией (п=15).
Продукцию супероксидного анион-ради-кала (*Ог-) исследовали модифицированным спектрофотометрическим методом при проведении теста с нитросиним тетразолием [2]. Для оценки его генерации НАДФН-зависимы-ми (микросомальными) электронно-транспор-тными цепями (ЭТЦ) и от Ж)-синтазы, НАД-Н-зависимым (митохондриальным) ЭТЦ и НАДФН-оксидазы лейкоцитов вводили индукторы в виде НАДН, НАДФН и бактериального липополисахарида (пирогенал). Модификация метода заключалась в том, что при оценке индукции пирогеналом тритон Х-100 вводился после 30-минутной инкубации. Это позволяет сохранить мембраны лейкоцитов неповреждёнными во время инкубации, а после нее облегчает выход «О; из лейкоцитов. Таким образом, точность оценки индукции пирогеналом повышается.
О показателях ПОЛ судили по количеству
веществ, образующихся в реакции с тиобарби-туровой кислотой (ТБК-реактантов) [7] и их приростом после инкубации в железо-аскорбатном буферном растворе. Определение активности супероксиддисмутазы (SOD, Е.С.1.15.1.1.) Проводили по определению ингибирования автоокисления адреналина в щелочной среде [4], ката-лазы (CAT, Е.С. 1.11.1.6.) - по убыванию содержания перекиси водорода в присутствии пробы [1]. Спектрофотометрические исследования проводились на фотоэлектрокалориметре «РМ-2111 Solar» (Беларусь). Результаты подвергались статистическому анализу методом ANOVA, с последующим анализом по Геймсу - Ховелу с поправкой по Данн - Сидаку. Статистическая обработка проводилась с помощью программы MícrosoftExcel и расширения Real Statistic.
Результаты. Изолированная фторидная интоксикация увеличивает базовую генерацию на 52,5 %, микросомальными ЭТЦ и от NO-синтазы (NOS) - на 59 %, митохондриальным ЭТЦ на 8,6 %, от лейкоцитов ткани - на 54,1 %. Нитратная интоксикация показала другую динамику: базовая генерация «Or увеличена на 105 %, микросомальными ЭТЦ и от NO-синтазы - на 39,5 %, митохондриальным ЭТЦ - на 91,8 %, от лейкоцитов ткани генерация уменьшилась - на 5,3 %. Хотя нитраты и
* riseofievanúhma il. ru
43
1 КАЗАХСКИЙ МЕДИЦИНСКИЙ IУНИВЕРСИТЕТ НЕПРЕРЫВНОГО ОБРАЗОВАНИЯ
Вестник АГИУВ № 3, 2016
фториды имеют тенденцию к усилению генерации *Ог митохондриальным ЭТЦ, нитраты увеличивают генерацию на 76,69 %, относительно фторидной интоксикации, что объясняется влиянием нитратов на ЭТЦ митохондрий [10]. Генерация «Ог- микросомальным ЭТЦ и от NOS также имеет тенденцию к увеличению относительно интактной группы, однако фториды на 14 % сильнее индуцируют генерацию «Оу микросомальным ЭТЦ и от NOS, что связано с активацией ионами фтора различных изоформ NOS [10]. Влияние на НАДФН-оксидазу лейкоцитов носит разнонаправленный характер, что может быть связано с ингибирующим эффектом нитратов на iNOS [10, 13].
Сочетанное избыточное поступление нитратов и фторидов увеличивает базовую генерацию «О:- на 93 %, микросомальными ЭТЦ и от NO-синтазы - на 12 %, НАДН митохондриальным ЭТЦ - на 66 %, от лейкоцитов ткани - на 33 %. Таким образом, можно сделать вывод об синергическом эффекте нитратов и фторидов на базовую генерацию *Оз-. Сочетанное влияние фторидов и нитратов на микросомальные ЭТЦ оказывает выраженный антагонизм этих факторов: снижение генерации *Ог на 29,47 % относительно фторидной интоксикации и на 19,6% относительно нитратной.
Активность SOD при изолированной фторидной интоксикации снижается на 64,38 %, CAT повышается на 78,92 %. При нитратной интоксикации SOD повышается на 58,9 %, CAT - сни-
жается на 28,9 2 %. При сочетанной патологии активность SOD снижается на 54,79 %, CAT -снижается на 33,33 %. При сочетанном введении нитратов и фторидов достоверных различий в активности SOD при сравнении с фторидной группой не наблюдается. В ходе анализа активности CAT достоверных различий между нитратной и сочетанной интоксикациями также не обнаружено.
При анализе количества ТБК-реактантов примечательна тенденция к увеличению их содержания до инкубации как при фтористой интоксикации (на 184 %), так и при нитратной (на 46,39 %). Сочетанная интоксикация повышает содержание ТБК-реактантов на 124 %. Прирост ТБК-реактантов при сочетанной интоксикации увеличивается на 33,1 % при сравнении с фторидной, и на 23,38 % - при сравнении с нитратными интоксикациями. Это позволяет сделать заключение о синергетическом угнетающем эффекте нитратной и фторидной интоксикации на неферментативную антиоксидантную систему.
Выводы
Сочетанная нитратная и фторидная интоксикация оказывает синергетический эффект на базовую генерацию Юг- и прирост ТБК-реак-тантов. Стимулированные генерации от микро-сомальных и митохондриального ЭТЦ имеют антагонистическую динамику Ферментативные же антиоксидантные системы показали определенную тропность к ионам фтора (преимущественно CAT) и нитрат-ионам (SOD).
ЛИТЕРАТУРА
1 Королюк М.А., Иванова Л.И., Майорова И.Г. Метод определения активности каталазы // Лабораторное дело. - 1988. - № 1. - С. 16-19.
2 Костенко В.О., Цебржинський О.1. Продукщя супероксидного ашон-радикала та оксиду азоту у тканин! нирок теля х1рурпчного втручання // Ф1зюлог. журн. - 2000. - Т. 46, № 5. - С. 56-62.
3 Назаренко Е.А., Нтозять Ю.Б., Iващенко О.Д. Проблеми забруднення фторидамигрунпв 1 вод геох1м1чнох провшцн (на приклад1 Полтавсько! обласп) // Еколопчна безпека. - 2014. - № 1. -С. 59-63.
4 Мегоди юпшчних та експериментальних дослщжень в медицин! / [Л.В.Беркало, О.В.Бобо-вич, Н.О.Боброва та ед.] // шд ед. 1.П.Кайдашев. - Полтава: Пол1мет, 2003. - 96-99 с.
5 Серикбаева А.К. Качество природных вод Республики Казахстан / А.К.Серикбаева, Л.М.Са-таева, А.М.Азимов // Междунар. науч. ин-т «ЕскюаПо». - 2015. - № 2 (9). - С. 21-23.
6 Смоляр В.1. Нгграти, нггрити та нпрозоамши у харчових продуктах 1 рацюнах / ВЛ.Смоляр, ОЛ.Циганенко, ГЛ.Пстрашенко // Проблеми харчування. - 2007. - № 3. - С. 35-44.
7 Стальная И.Д. Метод определения малонового диальдегида с помощью тиобарбитуровой кислоты // Современные методы в биохимии. - М.: Медицина, 1977. - С. 66-68.
44
*riseofrevan@mail. ru
8 Bouaziz-Ketata H. Nitrate-induced Biochemical and Histopathological Changes in the Liver of Rats: Ameliorative Effect of Hyparrheniahirta / H.Bouaziz-Ketata, G.B.Salah, H.B.Salah [et al.] // Biomed Environ Sci. - 2014. - Vol. 27 (9). - P. 695-706.
9 Finn B.L., Lombarte M„ RigaUi J.P. et al. Fluoride increases superoxide production and impairs the respiratory chain in ROS 17/2.8 osteoblastic cells // PLOS ONE. - 2014. - Vol. 9. - Is. 6. - P. 1-6.
10 Romero-Puertas M.C., Sandalio L.M. Nitric oxide level is self-regulating and also regulates its ROS Partners // Front. Plant. Sci. - 2016. - Vol. 7. - Is. 316. - P. 1-6.
11 Shivarayaschankara Y.M., Shivashankara A.R., Bhat PG. et al. Effect of fluoride intoxication on lipid peroxidation and antioxidant systems in rats / Y.M.Shivarayaschankara // Fluoride. - 2001. - Vol. 34. -P. 108-113.
12 Shushua X., Ziyoti L.. Ling Y. et al. A Role of Fluoride on Free Radical Generation and Oxidative Stress in BV-2 Microglia Cells // Mediators Imflamm. - 2012. - Vol. 13. - Ait. 102954. - P. 1-8.
13 Yang T., Pelleli M, Zollbrecht C. et al. Inorganic nitrite attenuates NADPH oxidase-derived superoxide generation in activated macrophages via a nitric oxide-dependent mechanism // Free Radic. Biol. Med. - 2015. - Vol. 83. - P. 159-166.
Т¥Й1Н
Зерттеу супероксидл анион-радикал (*Ог~) таралуына нитратты жене фторидл уйлескен улану эсерш зерттеу, ферме нтативл антиоксид а нтты жуйелердщ к,ызмет етуЫ, антиоксидантты кортауды интегралды керсетюш1 мен егеукуйрьщтьщ аск^занында*ы шырышты кабаттыц липидтердщ пероксидтл кышкылдану (ЯП*) керсетюштерш зерттеу мак,сатында 30 кун бойы Вистар туцымыныц жыныс мушелер1 жеттген 52 егеукуйрьщтарына зерттеу журпзтген. Нэтижелерд1 талдау ЯП* процестерше фторидл жене нитратты уланудыц синергиялык ыкпалын аныцтауга муминд1к берд1. «Ог- жэне антиоксидантты жуйен1ц таралуына веер ету курдел1 езара ерекетке ие.
Нег1зг1 сездер: супероксидл анион-радикал, на но дисперст1 кремнезем, натрий нитраты, натрий фторид!, су перо кс идд и ему таза, каталаза, ТБК-реактанттар.
SUMMARY
The study was conducted on 52 adult Wistar rats for 30 days to examine the effect of combined nitrate and fluoride intoxication on the generation of superoxide anion radical ( «Or ), the functioning of enzymatic antioxidant systems, integrated indicator of antioxidant protection and indicators of lipid peroxidation (LPO) in rat gastric mucosa. Analysis of the results allowed us to establish a synergistic effect of fluoride and nitrate toxicity on processes of lipid peroxidation. The impact on the generation of *0; and antioxidant system has a complex interaction.
Key words: superoxide anion-radical, sodium nitrate, sodium fluoride, superoxide dismutase, catalase, TBA-reactants.
* riseofievtmUhma il. ru
45
