CC BY
25ХИМИЯ, ХИМИЧЕСКИЕ И БИОТЕХНОЛОГИИ
УДК 620.193.8
В.Р. Карташов1, М.В. Челнокова1, А.А. Калинина1, 12 2 Т.Н. Соколова , С.Ю. Радостин , А.А. Москвичев
ГЕНЕРАЦИЯ O2- МИКРООРГАНИЗМАМИ И ЕГО РОЛЬ В БИОЛОГИЧЕСКОЙ
КОРРОЗИИ МЕТАЛЛОВ
Нижегородский государственный технический университет им. Р. Е. Алексеева1,
Нижегородский филиал Института машиноведения им. А. А. Благонравова РАН2
Установлена способность микроорганизмов, в частности некоторых видов бактерий и микромицетов, вызывать коррозию цинка. Показана роль на начальной стадии процесса супероксидного анион-радикала О2-, выделяемого в окружающую среду микроорганизмами в процессе их жизнедеятельности.
Ключевые слова: супероксидный анион-радикал, бактериальная коррозия металлов, микромицетная коррозия металлов, активные формы кислорода, нитросиний тетразолий.
Исследование динамики коррозии ряда металлов при воздействии на них микроскопических грибов и бактерий-органотрофов позволило выявить нам ранее не описанные явления [1-5]. Наиболее важное из них состоит в том, что на начальном этапе, спустя 3 - 5 суток с начала экспозиции, на торцах металлов происходит накопление прозрачной жидкости (экссудата) с рН 8...11. Качественный микрохимический анализ экссудата [6] показал присутствие в нем ионов Na+ и K+ (вероятно, как противоионов ОН-), которыми микроорганизмы обмениваются с внешней средой, а также Н2О2 [7]. На основании этих данных нами было сделано предположение, что отмеченные особенности могут быть обусловлены участием в коррозионном процессе супероксидного анион-радикала О2-, образующегося при жизнедеятельности микроорганизмов. Хотя образование О2- характерно для всех форм жизни [8], его роль в биокоррозии металлов ранее не обсуждалась.
В настоящей работе приводятся данные, которые показывают, что О2-, генерируемый микромицетами и бактериями, способен переходить в окружающую среду и принимать участие в реакциях на поверхности металла.
Для регистрации внеклеточного О2- использовали нитросиний тетразолий (НСТ2), который широко применяется для этих целей в разнообразных химических и биохимических исследованиях, образуя при этом моно- и диформазаны, характеризующиеся максимумами поглощения при 530 и 560 нм соответственно (схема 1) [9].
На семисуточный газон микроскопических грибов наносили в виде нерастекающейся
2+
капли 0,01 М водный раствор НСТ в количестве 0,5 мл и оставляли в оптимальных условиях роста микромицетов. Через некоторое время в месте контакта раствора НСТ2+ с мицелием наблюдали появление синей окраски, вызванное осаждением на поверхность плохо растворимых в воде моно- и диформазанов. Продукты восстановления НСТ2+ экстрагировали хлороформом, после чего анализировали спектрофотометрическим методом (рис. 1). В качестве контроля использовали раствор НСТ с добавлением супероксиддисмутазы (СОД, 15 ед. акт.), которая очень быстро (1,9х109 М-1с-1) с абсолютной специфичностью разлагает О2- до Н2О2 и О2 [10].
© Карташов В.Р., Челнокова М.В., Калинина А.А., Соколова Т.Н., Радостин С.Ю., Москвичев А.А., 2013.
Схема 1
где R1 = C6H5; R2 = ^-NO2C6H4; R3 = да-СН30С6Н4, Kt -противоионы.
Рис. 1. Спектры поглощения продуктов восстановления НСТ , десорбированных с поверхности мицелия микромицетов после трех сут. экспозиции:
а - Alt. alternata; б - P. ochro-chloron; в - Alt. alternata с СОД через 6 ч
Возможность генерации О2 бактериями исследовалась при использовании их суспензии с количеством 930 млн клеток Echerichia coli 321-5 и 2200 млн клеток Pseudomonas
aeruginosa 969 в 1 мл. К 2 мл бактериальной суспензии добавляли 0,5 мл 0,01 М НСТ , в
2+
контрольном опыте сначала добавляли 0,15 мл СОД (15 ед. акт.), а затем
НСТ2+. После
15-минутной инкубации в опытах с НСТ2+ наблюдали появление синей окраски разной интенсивности. В контрольных опытах водная суспензия бактерий не окрашивалась. Полученные данные показывают, что О2-, образующийся при жизнедеятельности микроорганизмов, через транспортные каналы [11] может переходить во внеклеточную среду.
В настоящее время установлено, что супероксидный анион-радикал является основанием Бренстеда, которое находится в равновесии с гидропероксидным радикалом - сопряженной ему кислотой [12]:
НОО^
Ü2- • + Н+, pK = 4,8.
Гидропероксидный радикал и 02 • быстро превращаются в Н2О2 и ОН- в результате двух параллельно протекающих реакций [13]:
но2' + но2' но2' + о2 ' + н2о Ъ.
02 + Н202,
Ü2 + Н2О2 + ОН
к1=8,6х105 М-1с-1, к2=1,0х108 М-1с-1.
На отдельных участках поверхности металла, покрытой оксидной пленкой, могут адсорбироваться ионы ОН- с противоионами и Н2О2. С участием воды, извлекаемой из питательной среды, на этих участках постепенно формируется экссудат с основными свойствами (рис. 2, а, б). При накоплении значительного количества ОН- происходит разрушение оксидной пленки. В условиях высокого рН, в соответствии с константой кислотности НОО, главным реагентом становится 02 •, который, после разрушения оксидной пленки, способен непосредственно хемосорбироваться на поверхности металла. При взаимодействии с водой соединение (I) переходит в поверхностный продукт (II):
На этой стадии продолжается накопление экссудата, а рН достигает своего максимального значения. Поверхностное соединение (II) в силу его окислительных свойств со временем превращается в конечные продукты коррозии (оксиды, гидроксиды металлов). На долю последних приходится 50 - 80% от общего количества субстанции, собранной с поверхности металлов (рис. 2, в).
в)
Рис. 2. Внешний вид поверхности цинка:
а - при воздействии P. ochro-chloron на 5-е сутки экспозиции; б - при воздействии Alt. alternata на 1-е сутки экспозиции; в - при воздействием Alt. alternata на 60-е сутки экспозиции
Если инициировании биокоррозии действительно происходит при участии O2-, должна наблюдаться определенная связь между свойством микроорганизмов секретировать О2- и степенью коррозионного разрушения. Возможная корреляция такого рода исследовалось нами на примере коррозии цинка под воздействием микромицетов Alt. alternata и P. ochro-chloron. Из рис. 1 видно, что свойства Alt. alternata транспортировать O2- в окружающую среду существенно выше, чем у микромицета P. ochro-chloron. С другой стороны, характерные признаки начального этапа коррозии металла под воздействием Alt. alternata также выражены значительно сильнее, чем при использовании P. ochro-chloron. Если под воздействием последнего спустя 5 суток наблюдаются локальные образования экссудата (рН>8) (рис. 2, а), то в случае Alt. alternata экссудат покрывает существенно большую поверхность уже через одни сутки (рис. 2, б). На завершающих стадиях коррозия металла под воздействием Alt. alternata проходит также более глубоко (рис. 2, в).
Библиографический список
1. О роли активных форм кислорода в инициировании коррозии металлов микроскопическими грибами / Д.В. Белов [и др.] // Коррозия: материалы, защита. 2009. № 11. С. 43-48.
2. Коррозия алюминия и его сплавов под воздействием микроскопических грибов / Д.В. Белов [и др.] // Коррозия: материалы, защита. 2007. № 9. С. 36-41.
3. Коррозия алюминия и алюминиевых сплавов под воздействием микроорганизмов / Д.В. Белов [и др.] // Изв. вузов. Сер. Химия и химическая технология. 2007. Т. 50. № 6. С. 60-64.
4. Роль супероксидного анион-радикала в бактериальной коррозии цинка / Д.В. Белов [и др.] // Прикладная биохимия и микробиология. 2012. Т. 48. № 3. С. 302-307.
5. Соединения - акцепторы электронов в исследовании биокоррозионных явлений / А.А. Калинина [и др.] // Коррозия: материалы, защита. 2011. № 12. С. 29-32.
6. Столяров, К.П. Руководство по микрохимическим методам анализа: учеб. пособие / К.П. Столяров. -Л.: Изд-во Ленингр. ун-та. 1981. - 248 с.
7. Bailey, R. Differential Spectrophotometry Determination of Hydrogen Peroxide Using 1,10-Phenanthroline and Bathophenanthroline / R. Bailey, D.F. Boltz // Anal. Chem. 1959. V. 31. № 1. Р. 117 - 119.
8. Auchere, F. What is the ultimate fate of superoxide anion in vivo? / F. Auchere, F. Rusnak // J. Biol. Inorg. Chem. 2002. V. 7. P. 664-667.
9. Bielski, B.H.J. Reduction of nitro blue tetrazolium by C02 and 02 radicals / B.H.J. Bielski, G. S. Grace, S. Ba-juk // J. Phys. Chem. 1980. V. 84. P. 830-833.
10. Фридович, И. Свободные радикалы в биологии. Т. 1 / И. Фридович. - М.: Мир, 1979. С. 273-314.
11. Mao, G.D. Electron spin resonance study on the permeability of superoxide radicals in lipid bilayers and biological membranes / G.D. Mao, M.J. Poznansky // FEBS Letters. 1992. V. 305. № 3. Р. 233-236.
12. Bielski, B.H.J. Reevaluation of the spectral and kinetic properties of HO2 and O2- free radicals / B.H.J. Bielski // Photochemistry and Photobiology. 1978. V. 28. P. 645-649.
Дата поступления в редакцию 28.11.2012
V.R. Kartashov1, M.V. Chelnokovа1, A.A. ^тта1, T.N. Sokolovа1, S.J. Radostin2, A.A. Moskvichev2
O2- GENERATION MICRO-ORGANISMS AND THEIR ROLE IN BIOLOGICAL
CORROSION OF METALS
Nizhny Novgorod state technical university n.a. R.E. Alexeev1, Nizhny Novgorod branch of Institute of mechanical engineering n.a. A.A.Blagonravov
Purpose: Explore the possibility of participating in the corrosion process of the superoxide anion radical produced when microorganisms.
Design / methodology / approach: A review of literature and previously published data on the possibility of living organisms release of reactive oxygen species, particularly superoxide anion in the environment. Spectrophotometrically installed capacity allocation superoxide anion micromycetes and bacteria.
Findings: Installed capacity of microorganisms, particularly certain types of bacteria and micromycetes corrosive zinc. The role of the initial stage of the superoxide anion radical O2-, released into the environment by microorganisms during their life.
Research limitations/implications: Examined some of the factors initiating biological corrosion. Оriginality/value: A certain connection between the properties of microorganisms secrete superoxide anion and the degree of corrosion damage.
Key words: superoxide anion radical, bacterial corrosion of metals, mikromitsetnaya corrosion of metals, reactive oxygen species, NBT.
