CC BY
29УДК 620.193.8
М.В. Челнокова, А.А. Калинина, Т.А. Аникина, Т.Н. Соколова, В.Р. Карташов РОЛЬ ПЕРОКСИДА ВОДОРОДА ПРИ БАКТЕРИАЛЬНОЙ КОРРОЗИИ ЦИНКА
Нижегородский государственный технический университет им. Р.Е. Алексеева
Установлена коррозионная активность бактерий Echerichia coli 321-5, Proteus vulgaris 1212, Pseudomonas aeruginosa 9691, Staphylococcus aureus 956, Staphylococcus epidermidis 1061 по отношению к цинку. Получены экспериментальные подтверждения схемы инициирования биокоррозии цинка с участием O2- и Н2О2 количественным определением Н2О2 в экссудате спектрофотометрически.
Ключевые слова: бактериальная коррозия, цинк, супероксидный анион-радикал.
Большинство металлов и промышленные изделия на их основе в средах, содержащих микроорганизмы, подвергаются глубокой деструкции. Среди сообщества микроорганизмов особое место занимают бактерии. Бактериальная коррозия вносит основной вклад в разрушение промышленных объектов, подверженных микробиологическим разрушениям.
Биокоррозия начинается с образования на поверхности объекта биохимических структур, известных как биопленки. Клеточные метаболиты, в том числе коррозионно-активные, входящие в состав биопленки, могут играть решающую роль в инициировании биокоррозии на начальном этапе, когда наблюдается изменение рН культуральной среды и морфологии поверхности [1].
В настоящее время к числу наиболее активных деструкторов относят широкий круг веществ химической и биохимической природы, таких как органические и неорганические кислоты очень разнообразной номенклатуры, аммиак, ионы металлов, сорбированные биопленкой, полисахариды, аминополисахариды, липиды и фосфолипиды, нуклеиновые кислоты, ряд ферментов и некоторые другие соединения.
К числу внеклеточных веществ, продуцируемых микроорганизмами, способных вызывать деструкцию металлов, относится супероксидный анион О2- - продукт одноэлектрон-ного восстановления кислорода. Пути образования О2- in vivo, его роль в жизнедеятельности организмов и физико-химические свойства изучены достаточно детально и рассматриваются в ряде монографий и обзорных статьях [2-3].
Ранее в наших работах [4-5] было показано, что О2-, образующийся при жизнедеятельности микроскопических грибов, может переходить в околоклеточную среду и выполнять роль инициатора физико-химических процессов, ведущих к глубокой деструкции металлов.
Известно, что О2- в водном растворе существует в виде равновесной смеси основания и сопряженной кислоты - гидропероксидного радикала. При рН>7равновесие сдвинуто в сторону O2- , радикалы равновесной смеси в водных растворах быстро превращаются в устойчивые продукты в результате протекания двух параллельных реакций [2]:
НОО' 02 +Н+,Ха=1,610~5 (1)
НОО^ + НОО^ ^ О2 + Н2О2, k=8,6-105 М-1с-1 (2)
НОО' + 02 + Н20 ^ 02 + Н202 + 01Г, k=l,02 108 M'V1 (3)
В связи с этим важной прикладной задачей является установление механизма биокоррозии под действием бактерий и инициирующего агента для дальнейшего ингибирова-ния процесса коррозии.
В качестве тест-организмов использовали музейные штаммы бактерий из числа
© Челнокова М.В., Калинина А.А., Аникина Т.А., Соколова Т.Н., Карташов В.Р., 2012.
наиболее распространенных в естественной среде: Echerichia coli 321-5, Proteus vulgaris 1212, Pseudomonas aeruginosa 969, Staphylococcus aureus 956, Staphylococcus epidermidis 1061, которые были предоставлены Всероссийской коллекцией микроорганизмов (г. Пущино Московской обл.).
Объектом исследования выбран цинк, который широко используется в создании защитных покрытий на поверхности стали.
Образцы металлов предварительно шлифовали до получения гладкой поверхности и полировали до зеркального блеска. После этого их промывали водой, обезжиривали поверхность тетрахлорметаном, затем этиловым спиртом, вторично промывали водой и высушивали. Стерилизацию образцов до и после экспозиции проводили фламбированием.
Выращивание бактериальных культур на плотной питательной среде (мясопептон-ный агар) осуществляли в суховоздушном термостате в чашках Петри при температуре 37±2°С и влажности воздуха 90%. Засев на плотную питательную среду производили водной суспензией суточных культур бактерий, выращенных в пробирках на скошенном агаре. После чего на поверхность питательной среды помещали подготовленные металлические образцы, которые инкубировались в термостате при 37±2°С до 90 суток. Контрольный эксперимент проводили в аналогичных условиях на плотной питательной среде, не зараженной микроорганизмами.
Характерные проявления микробиологической коррозии цинка наблюдаются спустя 24-48 часов с начала экспозиции в виде образования жидкой фазы (экссудата), имеющего основные свойства.
Из рис. 1 видно, что образование жидкой фазы наблюдалось лишь на отдельных участках поверхности и, в первую очередь, на торцах образцов. На остальной части в начальный период поверхности происходило лишь потускнение.
Рис. 1. Внешний вид образцов цинка через трое суток под воздействием бактерий:
а - Echerichia coli 321-5; б - Pseudomonas aeruginosa 9691
Динамика накопления экссудата и рост рН показаны на рис. 2, 3.
Значение рН возрастало в процессе биокоррозии, достигая значения 10,3 спустя 3-4 суток с начала экспозиции, количество экссудата также возрастало, достигая максимального значения примерно через 4 суток.
Разрушение металлической поверхности начинается с заселения бактериальными клетками участков, имеющих дефекты и структурные несовершенства. Начальный этап заселения завершается формированием биопленки, основу которой составляют внеклеточные полимерные вещества, образующие своего рода матрицу для жизнедеятельности микроорганизмов.
В экссудате после трех суток экспозиции методами качественного анализа с помощью реактива Несслера [6-9] был идентифицирован аммиак в виде свободного основания и иона аммония.
ш
-1-1-1
О 5 10 15
т.сут
Рис. 2. Зависимость накопления экссудата на поверхности цинка под воздействием бактерий:
а - Echerichia coli 321-5; б - Staphylococcus aureus 956; в - Pseudomonas aeruginosa 9691
10,8 10,6 10,4 10,2 _ 10 cL 9,8 9,6 9,4 9,2 9 8,8
Рис. 3. Зависимость рН экссудата на поверхности цинка от времени экспозиции при воздействии бактерий:
а - Echerichia coli 321-5; б - Staphylococcus aureus 956; в - Pseudomonas aeruginosa 9691
Качественный анализ химического состава экссудата, с использованием стандартных реакций на ионы калия и натрия [7-9], показал наличие в нем катионов Na+, K+. В то же время в экссудате не обнаруживаются ионы цинка при использовании в качестве реагентов ди-тизона и гексацианоферрата (II) калия [7].
Важным компонентом экссудата является пероксид водорода. Его присутствие доказано качественными реакциями с титановой кислотой и берлинской лазурью [10-11], а также спектроскопическим методом по полосе поглощения J3- (X = 350 нм).
Количество пероксида водорода (мкмоль/л) определяли спектрофотометрически в экссудате, объем которого составлял 0,1 мл и который был собран с поверхности нескольких образцов цинка. Метод основан на восстановлении пероксида водорода большим избытком иодида калия в щелочной среде при катализе гетерополикислотой (NH4)6Mo7O24*4 Н2О [12]:
(NH4)6M07O24*4 Н2О
H2O2 + 2J- -► 2OH- + J2
J2 + KJ (изб) ^ KJ3-
УФ-спектр поглощения J3- имеет характерную полосу поглощения с максимумом при 350 нм (рис. 4).
20
18
16
U 14
Cf-, 0 12
— 10
X
8
6
4
2
0
D
Рис. 4. УФ - спектры поглощения J3 , образующемся при восстановлении KJ:
а -Pseudomonas aeruginosa 9691;б - Echerichia coli 321-5,'в - Staphylococcus aureus 956
На рис. 5 представлено изменение концентраций Н2О2 в экссудате в зависимости от рода бактерии и времени экспозиции.
4
О "I-1-1-г-
5 7 9 11
т.сут
Рис. 5. Изменение концентрации Н2О2 в жидком экссудате на поверхности цинка под воздействием бактерии:
а - Pseudomonas aeruginosa 9691; б - Echerichia coli 321-5,'в -Staphylococcus aureus 956
Как видно из графических данных, представленных на рис. 5, количество Н2О2, образующегося в экссудате, очень сильно зависит от вида бактерий. Кроме того, в отличие от кинетики накопления количества гидроксильных ионов с экстремальной зависимостью (рис. 3) рост концентрации пероксида водорода описывается монотонно возрастающей функцией.
Следует отметить, что зависимость накопления Н2О2 от природы микроорганизма иная чем при накоплении гидроксильных ионов. Если по способности образовывать гидрок-сильные ионы в экссудате бактерии располагаются в ряд Echerichia coli 321-5 > Staphylococcus aureus 956 > Pseudomonas aeruginosa 9691, то по способности генерировать Н2О2 Echerichia coli 321-5 и Pseudomonas aeruginosa 9691 меняются местами.
Накопление уже на ранних стадиях экспозиции коррозионно-активного Н2О2 может приводить к существенным деструктивным изменениям поверхности.
Коррозионный эффект Н2О2, по-видимому, связан с процессом разложения Н2О2 при акцептировании электрона из объема металла по схеме аналогичной реакции Фентона:
Н2О2 + е ^ •ОН + ОН-; ^ОН + е ^ ОН-
В подтверждении этой схемы можно привести следующие данные. В 1984 г. Фенто-ном [13] было установлено, что Н2О2 в присутствии каталитических количеств солей железа
является очень мощным окислителем органических соединений. В настоящее время окислительная система Н2О2 - Ре2+ называется реактивом Фентона. Позднее Габер и Вейсс (1934 г.) обосновали, что высокая окислительная способность реактива Фентона обусловлена супероксидным анионом О2- и радикалом НО, которые образуются в следующем каталитическом цикле [2, 14]:
Н2О2 + Бе2+ ^ Бе3+ + ОН- + НО^ (1)
НО' + Н202 Н20 + НОО' (2)
НОСУ 02 +Н+ (3)
О2- + Н2О2 ^ О2 + НО- + НО^ (4)
(5)
(6)
Fe3+ + H2O2 ^ Fe2+ + О2- + 2H+
Fe3+ + О2-
^ Fe2+ + О2
При увеличении времени экспозиции происходит снижение рН, которое сопровождается частичным переходом экссудата в гелеобразное состояние (рис. 6), а при длительной экспозиции (20 и более суток) в консистенцию полутвердого продукта (рис. 7).
а
б
Рис. 6. Внешний вид образцов цинка (стадия гелеобразования):
а - стадия гелеобразования под воздействием бактерии Staphylococcus aureus 956 спустя 10 суток; б - стадия кристаллизации продуктов коррозии спустя 30 суток под воздействием Staphylococcus aureus 956;
После двухмесячной экспозиции, цинк, на поверхности которого наблюдали особенно интенсивное накопление экссудата, покрывался продуктами коррозии в виде рыхлого объемного осадка, состоящего из оксидных и гидроксидных соединений, идентифицированных по стандартным методикам, и органической фракции (80%) [15].
Выводы
1. Установлена коррозионная активность бактерий Echerichia coli 321-5, Proteus vulgaris 1212, Pseudomonas aeruginosa 9691, Staphylococcus aureus 956, Staphylococcus epidermidis 1061 по отношению к цинку.
2. Показано, что коррозионный процесс начинается с формирования на отдельных участках поверхности металла жидкого экссудата с основными свойствами. В ряду микроорганизмов выявлена корреляция между коррозионной активностью и способностью к образованию и накоплению на поверхности цинка жидкого экссудата: Echerichia coli 321-5 > Staphylococcus aureus 956 > Pseudomonas aeruginosa 9691.
3. Спектрофотометрически определено количественное содержание пероксида водорода в экссудате.
Библиографический список
1. Davey, M. E. Microbial Biofilms: from Ecology to Molecular Genetics / M.E. Davey, G.A. O'Toole // Microbiology and Molecular Biology Reviews Dec. 2000. V. 64. No. 4. Р. 847-867.
2. Bielski, B.H.J. Reactivity of HO2/O2" Radicals in Aqueous Solution / B.H.J. Bielski, D.E. Cabelli, R.L. Arudi, A.B. Ross // J. Phys. Chem. Ref. Data. 1985. V. 14. № 4. P. 1041-1100.
3. Rich, P.R. The sites of superoxide anion generation in higher plant mitochondria / P.R. Rich, W.D. Bonner // Archives of Biochemistry and Biophysics. 1978. V. 188. № 1. P. 206-213.
4. Белов Д.В. Коррозия алюминия и его сплавов под воздействием микроскопических грибов / Д.В.Белов [и др.] // Коррозия: материалы, защита. 2007. № 9. С. 36-41.
5. Смирнов, В.Ф. Микробиологическая коррозия материалов на основе алюминия / В.Ф. Смирнов, Д.В. Белов, Т.Н. Соколова // Прикладная биохимия и микробиология. 2008. Т. 44. № 2. С. 213-218.
6. Борисова, О. М. Химические, физико-химические и физические методы анализа / О.М. Борисова, В.Д. Сальников. - М.: Металлургия, 1991. - 296 с.
7. Столяров, К. П. Руководство по микрохимическим методам анализа: учеб. пособие / К.П. Столяров. - Л.: Изд-во Ленингр. ун-та, 1981. - 248 с.
8. Алексеев, В. Н. Курс качественного химического полумикроанализа / В. Н. Алексеев; под ред. П. К. Агасяна. - М.: Химия, 1973. - 584 с.
9. Кунце, У. Основы качественного и количественного анализа / У. Кунце, Г. Шведт. - М.: Мир, 1997. - 625 с.
10. Bailey, R. Differential Spectrophotometric Determination of Hydrogen Peroxide Using 1,10-Phenanthroline and Bathophenanthroline / R. Bailey, D.F. Boltz // Anal. Chem. 1959. V. 31. №1. Р. 117-119.
11. Reichert, J.S., McNeight, S.A., Rudel, H.W. // Ind. Eng. Chem. Anal. Ed. 1939. V. 11. P. 194-197.
12. Allen, A.O. Decomposition of water and aqueous solutions under mixed fast neutron and gamma radiation / A O. Allen [et al.] // J. Phys. Chem. 1952.V.56(5). Р. 575
13. Fenton, H.J. Oxidation of tartaric acid in the presence of iron // J. Chem. Soc. London. 1984. V.65. P. 899-910.
14. Sawyer, D.T. The chemistry of superoxide ion / D.T. Sawyer, M.J. Gibian // Tetrahedron. 1979. V. 35. P. 1471-1481.
15. Кирхнер, Ю. Тонкослойная хроматография: в 2 т.: [пер. с англ. Д.Н. Соколова] / Ю. Кирхнер; под ред. В.Г. Березкина. - М.: Мир, 1981. Т. 1. - 616 с., Т. 2. - 523 с.
Дата поступления в редакцию 02.02.2012
M.V. Chelnokova, A.A. Kalinina, T.A. Anikina, T.N. Sokolova, V.R. Kartashov THE ROLE OF HYDROGEN PEROXIDE IN BACTERIAL CORROSION OF ZINC
Nizhny Novgorod State Technical University n.a. R.Y. Alexeev
Purpose: Identification of physical and chemical phenomena on metal surfaces in contact with bacteria and their relation to corrosion processes in the initial stages. Quantitative determination of hydrogen peroxide in the exudate, which is formed on the metal surface with biocorrosion under the action of bacteria.
Design/methodology/approach: The concentration of H2O2 in the exudates collected from the surface of 10 samples of zinc was determined spectrophotometrically at the absorption band of J3 -(X = 350 nm) formed in the recovery of hydrogen peroxide in alkaline solution of potassium iodide.
Research: limitations/implications It is possible, for example, for the development of physical-chemical bases of biocorrosion and the establishment of the scheme of its initiation.
Originality/value: It is established that the main character of the exudate is determined by chemical transformations of superoxide ion, O2-, produced by the bacteria into the extracellular medium. The ability of bacteria to allocate from the cells O2 confirmed by quantification of exudates by UV spectroscopy of H2O2 as a product of chemical reactions of O2-in the aquatic environment.
