CC BY
65
УДК 575.853
ГЕМОПОЕТИЧН1 ПРОГЕШТОРШ КЛ1ТИНИ ПЛАЦЕНТИ ТА ПУПОВИННО1 КРОВ1: 1МУНОФЕНОТИПОВИИ АНАЛ1З ТА ПОТЕНЦ1АЛ ДО ДИФЕРЕНЩАЦП in vitro
Институт молекулярно!' бiологГï i генетики НАН Украши, Ки1в
21нститут клiтинноï терапп, Кт'в, Украша
3ДУ «1нститут генетично!' та регенеративно!" медицини НАМНУ», Кшв, Украша
E-mail: [email protected]
Отримано 29.05.2014
Метою роботи було пор1вняльне дослщження характеру диференщювання гемопоетичних прогешторних клгтин плаценти та пуповинно! кров1 in vivo та ïxrnx мультипотентних властивостей in vitro. Застосовували методи видглення фракци мононуклеарних клгтин i3 пуповинно! кров1, тканини зрiлоï плаценти i фетального хорГона, проточно! цитометрiï та аналiзу потенцiалу до диференцiацiï. Виявлено, що бiльшiсть гемопоетичних прогенiторниx клггин як у зрiлiй плацентi, так i в пуповиннш кровГ залишаються незрiлими елементами, але при цьому плацентарна тканина вщрГзняеться вищим вмятом лiнiйно-комiтованиx клгтин, серед яких: мГелощш попередники з фенотипом CD34+CD45lowCD33+SSClow, бГльш зрш мГелощш прогенiтори з фенотипом CD34+CD45lowCD14+SSClow (вмкт достовГр
но вищий, шж у пуповиннш кровГ), еритрощш прогенiтори з фенотипом CD34+CD45lowCD235+SSCow (вмГст достовГрно вищий, шж у пуповиннш кровГ), В-лГмфощш прогенiтори з фенотипом CD34+CD45lowCD19+SSClow, Т-лГмфощш прогенiтори та Natural Killer Cells-прогенiтори з фенотипом CD34+CD45lowCD7+SSClow,
а також зрги Т-лГмфоцити на рГзних стадiяx дозрiвання з фенотипами CD7+CD45+ та CD7+CD45RA+CD45+ вщповщно. В умовах in vitro гемопоетичш прогешторш клГтини плацентарно! тканини мають подГбний до клгтин пуповинно1 кровГ мультипотентний потенцiал. Наявнiсть у плацентарнш тканинi кровотворних клгтин на рГзних стадiяx та напрямах диференцiювання свщчить про те, що в плацента вiдбуваeться гемопоез упродовж усього термшу гестацiï.
Ключовi слова: плацентарний гемопоез, гемопоетичш прогешторш клгтини.
М. Д. Кучма1 2 В. А. Шаблш1' 2 В. М. Кирик3 Г. М. Ceimina2 Ю. М. Шаблш2 Ю. К. Прокопець2 Т. М. 1пдичепко2 Л. Л. Лукаш1 Г. С. Лобипцева2
Значною проблемою гематологи залиша-еться дефщит донорiв гемопоетичних прогешторних клiтин (ГПК) для трансплантацп за онкогематологiчних захворювань i вродже-них порушень кровотворення. У 1988 р. було вперше застосовано трансплантащю ГПК пуповинно! кров^ яку на сьогоднi широко застосовують у лiкуваннi пацieнтiв з онкоге-матологiчними та iншими захворюваннями.
ГПК пуповинно! кровi мають сво! переваги та недолши порiвняно з кл^инами iнших джерел — шсткового мозку та мобiлiзованоï периферично! кров^ що !х використовують пiд час трансплантацш. Переваги: легкiсть i безпека одержання клггин; ефективне збе-р^ання типованих за HLA (human leukocyte
antigen) кл^ин у KpiOKOHcepBOBaHOMy ста-Hi в банках пуповинно'! KpoBi, якi доступш для негайного використання, а також зраз-KiB, сум^них лише за 3 чи 4 генами HLA; досить низька вiрогiднiсть розвитку гостро'! та хронiчноi реакцп «трансплантат проти хазя'на». Проте ^нують i недолiки порiвня-но з ГПК шсткового мозку, зокрема б^ьш тривалий час вiдновлення нормального рiв-ня нейтрофiлiв, тромбоцитiв та лiмфоцитiв; менша вiрогiднiсть приживлення трансплантата, недостатня шльшсть зiбраних клiтин [1]. Тому актуальним залишаеться подаль-ший пошук нових додаткових джерел ГПК.
Було встановлено, що плацента людини ввдграе важливу роль в ембрюнальному ге-
Monoe3i [2, 3]. Однак iмунофенотип плацен-тарних ГПК i 1хню мультипотентнiсть ще недостатньо вивчено. Дослщження плацен-тарних ГПК i порiвняння ''хшх властивос-тей з кл^инами iнших джерел необхiднi для ощнки можливостей ix клiнiчного застосу-вання. Отже, метою роботи було дослщжен-ня особливостей iмунофенотипу кровотвор-них клiтин плаценти та ixнього потенцiалу до диференщацп порiвняно з ГПК пуповин-ноi кровi in vitro.
Матерiали i методи
Видшення фракцй мононуклеарних клi-тин i3 пуповинног Kpoei, тканини зршог плаценти та фетального хорюна. Плаценту одержували тсля полопв ^зюлопчних або шляхом кесаревого розтину) на 39-41-му тижш ваптноста у 23-36^чних жiнок за 'хньо'' шформовано'' згоди. Пуповинну кров збирали за стандартною методикою. Джере-лом фетальноi плаценти були абортивш емб-рiони людини 7-8 тижнiв гестацii в результата добров^ьного переривання вагiтностi за iнформованоi згоди жiнок. Пуповинну кров i плаценту брали вiд донорiв, у кровi яких не метилось антитiл до HIV-1/2, HCV, corHBV, HBsAg, Treponema pallidum, а тканина плаценти була негативна на ДНК Chlamidium trachomatis, Mycoplasma genitalis, Ureaplasma urealyticum, Ureaplasma parvum та HSV-1/2. Для вид!лення кл^ин плаценту очищали вщ амнiотичноi оболонки i вiдрiзали пуповину. Плацентарну тканину подрiбню-вали стерильними ножицями на фрагменти 1-3 мм, ям промивали розчином Хенкса для видалення залишшв кровi до повного знебарвлення розчину для промивання. Потам тканину обробляли розчином ензимiв: 0,2% колагенази I (Serva, Шмеччина), 0,35 мг/мл гiалуронiдази (Sigma, США), 100 од/мл DNase I (Sigma, США) з додаван-ням 1 мг/мл бичачого сироваткового альбу-мшу (BSA) протягом 30-50 хв при +37 °С. Далi плацентарнi кл^ини збирали шляхом фiльтрування через клггинний фiльтр з дiа-метром пор 70 мкм (Becton Dickinson, США). Шсля оброблення ензимами ''х вщмивали у фосфатно-сольовому буферному розчинi (PBS) з додаванням 1 мг/мл BSA. Тканину, що залишилась, iнкубували зi свiжою пор-цieю ензимiв упродовж 30-60 хв за +37 °С. Кттини також вiдмивали i об'еднували. 1з фетального xорiона клiтини вид^яли тим самим методом, що й зi зрiлоi плаценти, од-нак час оброблення ензимами скорочували до 15-30 хв. Фракщю мононуклеарних кль
тин 3i зрiлоi та фетально'' плаценти i пупо-винно'' KpoBi видiляли фракцiонуванням на фiколi (шДльшсть 1,077 г/мл, Biochrome, Hi-меччина), двiчi вiдмивали, фiльтрували через клгтинний фiльтр з дiаметром пор 40 мкм. Фракщю мононуклеарних клггин i3 пупо-винно'' кровi обробляли такою самою сумь шшю ензимiв, як i тканину плаценти, протягом 50 хв за 37 °С i вiдмивали вiд залишшв ензимiв у PBS, додаючи 1 мг/мл BSA.
Проточна цитометрiя. Для iмунофено-типування плацентарних кл^ин та кл^ин пуповинно'' кровi використовували так1 флуорохром-мiченi моноклональнi антитiла (Becton Dickinson, США): anti-CD34 APC, anti-CD90 FITC, anti-CD45 APC-Cy7, anti-CD105 PerCP-Cy 5.5, anti-CD73 PE, anti-CD14 Pacific Blue, anti-CD31 PE, anti-CD133 PE, anti-45RA FITC, anti-CD7 PE, anti-CD19 PE-Cy7, anti-CD33 FITC, anti-CD235a PE. Аналiзували лише популяцiю живих клiтин, якi не забарвлювалися 7-AAD. 1мунофеноти-пування проводили на лазерному проточному цитофлуориметрi-сортерi BD FACSAria (Becton Dickinson, США) за допомогою про-грами FACSDiva 6.1.2, аналiзуючи одно-часно 2 параметри свiтлорозсiювання та 6 — флуоресценцп. Для налаштування компенсацп перекриття спектрiв емiсii флуорохромiв тд час багатопараметричного аналiзу використовували контрольш зразки клiтин без внесення антитал (unstained control), зразки з кожним з антитал окремо (single stained control) та зразки з комбшащею декшькох антитал без одного (fluorescence minus one control).
Аналiз потенщалу до диференщацп. Ви-д^еш й очищен за наведеною вище методикою кл^ини культивували в середовишi MethoCult (Stem Cell Technologies, Канада) при +37 °С в атмосферi з 5% СО2 в дублях. Колонii тдраховували на живих препаратах на 14-ту добу культивування.
Статистичний аналiз. Результати подано у виглядi середшх величин з 95% -м довiрчим iнтервалом. Статистичну значу-шiсть вщмшностей визначали за допомогою U-критерiю Манна-У'тш.
Результати та обговорення
У робота проанатзовано експресiю лшш-них маркерiв, зокрема CD33, CD14, CD235, CD19, CD7, CD45RA у вйх популящях ГПК iз загальним фенотипом CD34+CD45lowSSClow зi зрiлоi i фетально'' плацентарно'' тканини та пуповинно'' кровi.
69,4% (45,3-88,9%) у популяцп ГПК зр^о'' плаценти та 87,6% (76,8-95,3%)
у популяцп ГПК пуповинно! кровГ не екс-пресували жодних з аналiзованих лшшних маркерiв (CD34+CD45lowLin-SSClow). Такий фенотип свщчить про те, що бГльшГсть ГПК як у плацентi, так i в пуповиннш кровГ за-лишаються незрiлими елементами, однак при цьому вмГст лiнiйно-комiтованих клГтин у плацентарнш тканинi достовГрно вищий, шж у пуповиннш кровГ (рис. 1).
CD45low SSClow
Рис. 1. Присутнiсть недиференцiйованих
(CD34+CD45lowLin-SSClow), мieлоï'дних (CD34+CD45lr
CD34+CD45lowCD14+SSClow
lowCD33+SSClow
CD34+CD45lowCD33+CD14+SSClow),
Т^мфо'дних (CD34+CD45lowCD7+SSClow), еригро'дних (CD34+CD45lowCD235+SSClow) та В^мфо'дних (CD34+CD45lowCD19+SSClow) прогенiторних клiтин:
у плацентарнш тканин (а) та пуповиннш кров1 (б) (тут i далк *Р < 0,05, n = 6)
ЗрГла плацентарна тканина, як i пу-повинна кров, метить популящю раннiх мГелощних попередникiв Гз фенотипом CD34+CD45lowCD33+SSClow у кГлькостГ 5,5% (1,8-11,0%) та 5,9% (0,4-17,3%) шдпошдно серед усГх ГПК (CD34+CD45lowSSClow) (рис. 2). Як вгдомо, CD33 — один з маркерГв, що харак-терний для клГтин ранньо! стадп диференщю-вання в мГелощному напрямГ [4, 5], а клГти-ни, що експресують одночасно CD34+CD33+, належать до мГелощних прогешторГв [6]. В умовах культури CD34+CD13+CD33+ клГтини шсткового мозку утворюють колони пере-важно мГелощного походження [7].
Нами встановлено, що бГльшГсть з усГх комГтованих у рГзш напрями прогешторГв у популяцп пуповинно! кровГ припадае на CD34+CD45lowCD33+SSClow-клiтини, що було продемонстровано i в роботах шших авторГв [8, 9]. Ми дослщжували наявшсть CD34+CD45lowCD33+SSClow-клiтин у феталь-нш плацента 8-го тижня гестацп та спостерь гали 1,7% таких клГтин серед усГх ГПК (рис. 3). Barcena та ш. також виявляли субпопуля-цГ! CD34++CD45low- i CD34+CD45low-клiтин, що експресували CD13, CD 33 i CD44, але на 12-му тижш гестацп. При цьому бГльшГсть
CD34-клiтин експресували CD13, а 5-30% CD34-клiтин — CD33, але найбГльш незрШ популяцп CD34++CD45low-клiтин мали низь-кий рГвень експресп цього антигену [2].
У зрШй плацентарнГй тканиш виявле-но також субпопуляцГю бГльш зрГлих мГелощних попередникГв Гз фенотипом CD34+CD45lowCD14+SSClow у кГлькостГ 9,8% (1,3-25,0%, n = 6) серед усГх ГПК, однак така субпопуляцГя мГстилась у пуповиннГй кровГ в незначнш кГлькостГ (рис. 2). CD14 вважають мГелощним маркером, вГн з'яв-ляеться на моноцитах тзшших стадГй до-зрГвання, а експресуеться на базофГлах та нейтрофГлах [10, 11]. CD 14 експресуеться також на початкових i промГжних етапах диференщювання дендритних клГтин [12]. CD34+CD14+CD1a--клiтини пуповинно! кровГ можуть диференщюватись у моноцитар-ш або в дендритнГ клГтини залежно вщ дГ'1
Ql
■ • S '. ■m л- _ Q3 01
CD33 F1TC-A
Q1
03
""III.........
0 10
Q2
Q4
........—
10s
пттгг-10*
TTnmmi ,о3
CD33 FITC-A
Рис. 2. Двовимiрнi гiстограми експресп поверхневих MapKepiB CD33 та CD14 на клггинах i3 фенотипом CD34+CD45lowSSClow тканини:
плаценти (а) та пуповинноï кровГ (б). На осях вГдкладено iнгенсивнiсгь флуоресценцп у вГдповГдних каналах (програма BD FACSDiva 6.1.2)
а
б
рiзних ростових факторiв [13]. G данi, що CD14+ мiелоiдноподiбнi клiтини пуповин-но1 кровi можуть бути прогешторами NK (Natural Killer Се11в)-кл^ин. Так, клiтини i3 фенотиповими характеристиками мiело-iдних клiтин, зокрема з коекспрейею CD14, CD11b, CD11c, CD13 i CD33, можуть дифе-ренцiюватись у NK-клiтини за культивуван-ня з такими факторами росту, як ^3-лпанд чи SCF- та штерлейкш-15 [14]. Таку субпопу-лящю CD34+-клiтин, яка коекспресуе CD14 у пуповиннш кровi, ранiше могли й не знахо-дити [8], однак з'ясовано, що CD34+-клiтини пуповинноi кровi можуть експресувати пiзнi маркери: CD14 та CD15 [15], але ''хня част-ка зовсiм незначна [9]. У шстковому мозку CD34+-клiтини не експресують такi маркери зрiлих клггин, як CD3, CD11b, CD14, CD20 [16]. Ми показали, що 7,2% ГПК у феталь-нш плацента 8-го тижня гестацп мають фенотип CD34+CD451owCD14+SSC1ow (рис. 3). За-галом, як було з'ясовано рашше, популяцiя ГПК плаценти досить гетерогенна i мiстить клiтини з фенотипами CD34+++CD451ow, CD34++CD451ow та CD34+/1owCD451ow. При цьому зi зменшенням рiвня CD34 зб!льшу-еться експресiя маркера CD14, а також CD19 та CD7. Слщ зазначити, що субпопулящя CD34++CD451ow, яка е найбiльш незрiлою, осшльки експресуе CD133 i е негативною за CD33, CD235, CD19, CD7 та CD45RA, харак-теризувалась експрейею CD14 на рiвнi 3% (0,5-7,6%, n = 4) [17]. Подiбну залежнiсть було також встановлено Barcena та iн., якi з'ясували, що зростання експресп CD14 на CD13+CD33+-клiтинах корелювала зi втра-тою CD34 у тканиш хорiона 12-го тижня гестацп. Це свщчило про наявшсть субпопу-ляцii зрiлих мiелоiдних CD14+-клiтин, якi е спецiалiзованими резидентними макрофагами, присутш, починаючи з 4-го тижня гестацп до утворення зр^о' плаценти, i ста-новлять першу зр^у й найпоширенiшу по-пулящю лейкоцитiв у плацентi [2]. У нашш роботi показано, що в зрШй плацентарнiй тканинi деяка частина CD14+-клiтин мае фенотип прогенiторних клгтин, а отже, це — шзш мiелоiднi прогенiтори. До того ж не вс CD34+CD451owCD14+SSC1ow-клiтини експресують CD33, осшльки популяцiю з фенотипом CD341ow451owCD14+CD33+SSC1ow вияв-лено лише в кiлькостi 2,1% (0,9-3,5%), на вщмшу вiд пуповинно' кровi, де ми знахо-дили таку популящю лише в деяких зраз-ках у незначнш кiлькостi. Вважаемо, що CD341ow451owCD14+CD33+SSC1ow-клiтини, ймовiрно, е субпопуляцiею прогенiторних клiтин промiжноi стадii комiтування.
Рис. 3. Двовимiрнi гiстограми експресп поверхневих MapKepiB CD33, CD14 та CD235 на кл^инах iз фенотипом CD34+CD45lowSSClow фетально'1 плаценти 8-го тижня гестацп
Отже, б^ьш^ть iз комiтованих прогень торiв, як у пуповиннiй кровь так i в плацентi, е мiелоiдними, однак у плацентi вони б^ьш диференцiйованi, нiж у пуповиннш кровь Iншi автори, що вивчали плаценту людини на першому триместра виявляли макро-фагальнi прогенiтори в плацента нав^ь до моменту, коли наставала фетоплацентар-на циркулящя: вони утворювались de novo в плацента або мпрували туди як прогешто-ри крiзь позазародкову мезодерму [18]. Ми показали, що там прогештори залишаються i в зрШй плацентi. Загалом, у плацентi вм^т та гетерогеннiсть мiелоiдних клiтин вишД, нiж у пуповиннiй кровi. Вщмшшстю та осо-бливiстю плацентарних ГПК, як у зрШй, так й у фетальнш плацентi, е наявшсть знач-но' кiлькостi пiзнiх мiелоiдних прогенiторiв iз фенотипом CD34+CD451owCD14+SSC1ow.
Зр^а плацентарна тканина мiстить досто-вiрно бiльшу кiлькiсть еритро'дних проге-нiторiв iз фенотипом CD34+CD451owCD235+ SSC1ow, нiж пуповинна кров, вмiст ''х серед уйх ГПК становив 3,8% (0,5-9,7%, n = 6, Р < 0,05) та 0,2% (0,1-0,3%, n = 6, Р < 0,05) вщповщно (рис. 4). Як вщомо, CD235
а
б
CM4 A PC-A
Рис. 4. Двовимiрнi гiстограми експресп поверхневого маркера CD235 на клггинах i3 фенотипом CD34+CD45lowSSClow гканини:
плаценти (а) та пуповинноï KpoBi (б)
(Glycophorin A) експресуеться на зр1лих ери-троцитах [19] та примГтивних ембр1ональних еритрощних кл1тинах, серед яких е клГтини з фенотипом Glycophorin A+CD41+, що можуть коекспресувати CD34 i мГстять еритрощш та мегакар1оцитарн1 прогенiтори, а також клГга-ни-попередники, що дають змiшанi колони [20].
Встановлено, що деяка частина ГПК пуповинно! кровь кГсткового мозку та мо-бШзовано! периферично! кровГ коекспре-суе CD34 i CD235, при цьому рiвень !х експресп не вiдрiзняеться [21]. Хоча не у всГх роботах виявляли коекспресiю CD34 та CD235 на клГтинах пуповинноï кровГ [8], однак у незначнГй шлькоста продемонстро-вано коекспресГю маркерГв CD34 та CD36 (останнш експресуеться на еритрощних прогенГторах) [8, 22]. З'ясовано, що в пуповиннш кровГ присутш клГтини з фенотипом CD34+CD71+, якГ е раннГми еритроïдними прогешторами [23], але в меншш шлько-стГ, нГж мiелоïднi [8]. У фетальнш плацента 8-го тижня гестацп вмГст еритрощних по-передникГв (CD34+CD45lowCD235+SSClow)
у популяцп ГПК становив 10,9% (рис. 3). Barcena та ш. також показали, що в пла-центарнГй тканинГ, але на 21-му тижш гес-тацiï, CD34+CD45low-клiтини експресують CD235 i EpoR. При цьому багато з них не експресували CD235, що може свщчити про належшсть до раннГх еритроïдних проге-нГторГв; були також присутнГ клГтини, що експресували CD235, EpoR, CD71, та рГзний рГвень CD34, що вказуе на наявшсть у плацента промГжних еритрощних попередникГв шзшх стадГй комГтування [2]. Як показано рашше, кшцеве дозрГвання та енуклеащя раннГх незрГлих червоних клГтин кровГ лю-дини вГдбуваеться на першому триместр1 вагГтностГ в плацентарних ворсинках, при цьому примГтивш еритроïднi клГтини було знайдено у ворсинках хорюна мГж 5-7-м тижнями розвитку [18]. Таким чином, нами встановлено, що еритропоез продовжуеться до кшцевого термшу вагГтностГ.
Ми виявили, що зрГла плацентарна тканина, як i пуповинна кров, мГстить Т-лГм-фоïднi та/або NK-прогенГтори з фенотипом CD34+CD45lowCD7+SSClow, ïх вмГст серед усГх ГПК становив 6,3% (0,6-17,3%, n = 6, Р < 0,05) та 2,8% (1,5-4,5%, n = 6, Р < 0,05) вщпо-вщно (рис. 5). Як вщомо, CD7 вважаеть-ся найбГльш раншм маркером Т-клiтинноï диференцiацiï i детектуеться на Т-клГти-нах-прогенГторах [24, 25]. ЛГмфощш комь тованГ прогенГтори з фенотипом CD34+CD7+ е клГтинами, що заселяють тимус [26], але експресГя CD7 е характерною не лише для Т-клГтин-прогешторГв, але й для В-лГмфо-Щних [27] та мГелощних клГтин-прогешто-рГв дорослого кГсткового мозку i фетальноï печГнки [25]. Однак CD34+CD7+-популяцiя мГстить лише мГнорну субпопулящю клГтин, комГтованих у мГелощному напрямГ, що пГдтверджуе тест на колошеутворювальну активнГсть (CFU) та здатшсть до продуку-вання гранулоцитГв у культурах Гз тривалою пГдтримкою [28]. CD34+CD7+-популяцiя зба-гачена на клГтини, що перебувають на стадп промГжного етапу диференцГювання в NK клГтини [5], яка е ранньою стадГею в комГту-ваннГ гемопоетичних прогешторГв в NK-на-прямГ [29].
Показано коекспресГю CD34 i CD7 на кль тинах пуповинноï кровГ, кГсткового мозку та мобiлiзованоï периферичноï кровГ [21]. У пуповиннГй кровГ виявлено бГльший вмГст клГтин Гз фенотипом CD34+CD7+, шж у кГст-ковому мозку й периферичнш кровГ [30, 31], при цьому в кГстковому мозку та периферичнш кровГ вш е однаковим [32]. Водно-час однакову кГлькГсть CD34+CD7+-клiтин
а
б
ST 01
ог
■ - V , ' *
CD19PE-Cy7-A
—i—-—i i i 111 -li3
CDI9 РЕ-СуГ-Л
Рис. 5. Двовимiрнi гiсгограми експресп поверхневих MapKepiB CD19 га CD7 на клггинах i3 фенотипом CD34+CD45lowSSClow гканини:
плаценти (а) та пуповинноï кровГ (б)
фшсували i в пуповиннш кровГ, шстко-вому мозку та периферичнш кровГ [21]. За нашими тдрахунками, 27,1% (14,641,8%) CD7+CD45+- та 10,1% (5,9-15,2%) CD7+CD45RA+CD45+-клiтин присутш
у фракцп плацентарних клГтин, очищених на фГколГ. CD45RA експресуеться як на лГм-фощних, так i на грануломоноцитарних про-генГторних клГтинах [33], а також на «нена-вчених» Т-лГмфоцитах, якГ втрачають його експрейю, коли стають клГтинами пам'ята [34]. Barcena та Гн. не знаходили на 22-му тижш гестацп в плацентарнш CD45+-попу-ляцп клГтин Т-лГмфоцитГв Гз маркером CD3
i фшсували дуже мало NK-клГтин Гз маркером CD56 [2]. При цьому Т-клГтини не ви-являли починаючи з 12,5 тижшв гестацп до 39,5 тижшв, а кГлькГсть NK-клГтин ста-новила вГд 0,05 до 3,5% упродовж 10-39,5 тижшв гестацп. Отже, у зрШй плацента знайдено попередники Т-лГмфоцитГв i K-кль тини Гз фенотипом CD34+CD45lowCD7+SSClow, а також зрШ Т-лГмфоцити i Т-лГмфоцити на промГжних стадГях дозрГвання з фено-
типами CD7+CD45+ та CD7+CD45RA+CD45+ вщповщно. Ми стверджуемо, що щ кль тини мГстяться в тканиш, а не е залишка-ми пуповинно! кровГ, про що свщчить у 10 разГв вищий вмГст клГтин Гз фенотипом CD34+CD45lowCD7+SSClow у деяких зразках плаценти. Загалом виявлено тенденщю до бГльшого вмГсту попередникГв Т-лГмфоци-тiв/NK-клiтин у зрГлш плацентарнГй тка-нинГ, шж у пуповиннГй кровГ, однак достовГрно! рГзнищ !х кГлькостГ немае, можливо у зв'язку з вГдносно малою вибГркою (рис. 1).
СпостерГгали незначний вмГст В-лГмфо-щних прогешторГв у зрШй плацентарнГй тканинГ та пуповиннГй кровГ з фенотипом CD34+CD45lowCD19+SSClow, !х кГлькГсть серед усГх ГПК становила 0,5% (0,1-1,0%, n = 6, Р < 0,05) та 0,7% (0,05-2,2%, n = 6, Р < 0,05) вГдповГдно (рис. 5). CD19 — маркер B-лГм-фощних клГтин, що з'являеться дуже рано й не зникае на тзшх стадГях дозрГвання [23, 35-37]. ПорГвнюючи там джерела ГПК, як шстковий мозок, пуповинна та периферична кров, найбГльший вмГст В-лГмфощних прогешторГв Гз фенотипом CD34+CD19+ знаходили в шстковому мозку [21, 38, 31]. На 12-19-му тижш гестацп cD34++CD45low-клiтини фе-тального хорюна в спещальному середовищ1 для лГмфощних клГтин утворювали незнач-ну кГлькГсть CD19-клiтин.
Плацента мГстить попередники гемопое-тичних клГтин, якГ на 14-ту добу культи-вування дають початок колошям: еритро-щних попередникГв BFU-E (burst-forming unit-erythroid), CFU-E (сolony forming unit-erythroid); попередникГв гранулоци-тГв та моноцитав CFU-M (colony-forming unit-macrophage), CFU-G (colony-forming unit-granulocyte), CFU-GM (colony-forming unit-granulocyte, macrophage) i змГша-ним колонГям CFU-GEMM (сolony-forming unit-granulocyte, erythrocyte, monocyte/ macrophage, megakaryocyte) (рис. 6). До того ж, як ми встановили рашше, колошеутво-рювальна актившсть ГПК зрГло! плацентар-но! тканини зберГгаеться i тсля крГокон-сервування тканини [39].
ПорГвняння кГлькостГ клГтин, що утворю-ють рГзнГ типи колонш, показало, що !х рь вень у плацентарнГй тканинГ та пуповиннГй кровГ достовГрно не вГдрГзняеться, на вщмь ну вГд даних, отриманих за фенотипування, що свщчить про схожий диференщюваль-ний потенщал ГПК плаценти та пуповин-но! кровГ (рис. 7). G данГ, що CD34+CD45low, ГзольованГ зГ зрГло! плаценти, продукують незначну кГлькГсть еритрощних колонш, тимчасом як гемопоетичш клГтини першого
а
б
Рис. 6. Колони клггин плаценгарно'1 тканини:
а — CFU-B; б — CFU-GM; в — CFU- GEMM, свгглова мшроскошя, ок. х10, об. х5
i другого триместру не генерують чисп еритрощш колони, що вказуе на яшсну рiзницю у властивостях плацентарних прогенiгорiв гемопоетичних клiгин ранньо! та зр^о! плаценти [2]. Проте iншi автори вiдзначаюгь, що частота виявлення CFU-B залишаеться однаковою серед кл^ин i3 плаценти 6-, 9-, 15-го тижня гестацп, i спостерпають ^тотне збiльшення кiлькосгi CFU-GM, CFU-Mix ко-лонiй починаючи з 9-го тижня [40]. Показано, що при цьому практично вй колони (по-над 90%) були фетального походження [3].
Результата фенотипового анатзу ГПК, ям показали наявшсть у плацента мiелоïд-них, еритрощних, Т^мфо'Щних, В^мфо-Щних попередникiв i високий колошеутво-рювальний погенцiал, свiдчагь про те, що в зрШй плацента активно проходить гемо-поез. За результатами роботи можна при-пустити, що використання ГПК пуповинно'1 кровi разом iз клiгинами зрiлоï плацентар-но! тканини для грансплангацiй дасть змо-гу усунути декiлька недолив пуповинно'1 кровi, що пов'язанi з недостатньою шль-кiсгю зiбраних кл^ин i тривалим часом вiдновлення нормального рiвня нейтрофь лiв, громбоцигiв та утворення лiмфоци-гiв. Це можливо, осшльки, на вiдмiну вiд пуповинно! кровi, у плаценгарнiй тканиш б^ьший вмiсг комiгованих у мiелоïдно-му напрямi клiгин i наявна велика шль-кiсгь бiльш пiзнiх мiелоïдних прогенiгорiв iз фенотипом CD34+CD45lowCD14+SSClow. Встановлена тенденщя до вищого вмiсгу Т^мфо'Щних прогенiгорiв iз фенотипом CD34+CD45lowCD7+SSClow у плацента порiв-няно з пуповинною кров'ю також е безпе-речною перевагою ще! популяцiï клiгин, осшльки однiею iз основних проблем пщ час грансплангацiï пуповинно! кровi е затримка вщновлення лiмфопоезу.
Таким чином з'ясовано, що б^ьш^ть ГПК як у плацента, так i в пуповиннш кро-вi залишаються незр!лими, однак при цьому вмiсг лшшно-ком^ованих клiгин у плаценгарнiй гканинi достовiрно ви-
Рис. 7. Колонieугворювальний погенщал клiгин: плаценгарно'1 тканини (а) га пуповинно'1 кров1 (б) in vitro, n (плацент) = 6, n(пуповинноï кров^ =10 (значения наведено у ввдсотках)
щий. Б^ьш^ть з усiх комiтованих в рiз-них напрямах прогенiторiв серед пупо-винно! кровi припадае на популящю раннiх мiело'ïдних попередникiв iз фенотипом CD34+CD45lowCD33+SSClow, а в плацен-тi — на бiльш шзш мiело'ïднi прогенiтори
з фенотипом CD34+CD45 CD14+SSC , вмiсг яких у пуповиннiй кровi незначний. У плацен-тарнiй тканиш вмiст еритрощних прогешто-рiв iз фенотипом CD34+CD45lowCD235+SSClow достовiрно вищий. У зрiлiй плацентi при-сутнi Т^мфо'Щш прогештори^К-прогень тори з фенотипом CD34+CD45lowCD7+SSClow, а також Т-лiмфоцити на рiзних стадiях дозрiвання з фенотипами CD7+CD45+ та CD7+CD45RA+CD45+ вщповщно. Ми ви-являли незначну кiлькiсть В-лiмфо'ïдних прогенiторiв у зрiлiй плацентарнiй тканиш та пуповиннiй кровi з фенотипом CD34+CD45lowCD19+SSClow. За умов культу-ри ГПК плацентарно! тканини мають подiб-ний до клiтин пуповинно! кровi мультипо-тентний потенцiал, утворюючи при цьому колони CFU-B, CFU-E, CFU- M, CFU-G, CFU-GM, CFU-GMEM в однаковому сшввщно-шенш. Наявшсть у плацентарнш тканиш кровотворних кл^ин на рiзних стадiях та напрямах диференщювання свiдчить про те, що в плацента вщбуваеться гемопоез протя-гом усього термiну гестацi'ï.
б
а
в
REFERENCES
1. Broxmeyer H. E., Farag S. Background and future considerations for human cord blood hematopoietic cell transplantation, including economic concerns. Stem Cells Developt. 2013, 22(1), 103-110.
2. Barcena A., Kapidzic M, Muench M. O, Gorm-ley M, Scott M. A., Weier J. F., Ferlatte C., Fisher S. J. The human placenta is a hematopoietic organ during the embryonic and fetal periods of development. Dev Biol. 2009, 327(1), 24-33.
3. Serikov V., Hounshell C, Larkin S., Green W., Ikeda H, Walters M. C, Kuypers F. A.. Human term placenta as a source of hematopoietic cells. Exp. Biol. Med. (Maywood). 2009, 234(7), 813-823.
4. Gaipa G, Coustan-Smith E., Todisco E, Mag-lia O., Biondi A., Campana D. Characterization of CD34+, CD13+, CD33- cells, a rare subset of immature human hematopoietic cells. Haema-tologica. 2002, 87(4), 347-356.
5. Carvalho J. M., Souza M. K., Buccheri V., Rubens C. V., Kerbauy J., Oliveira J. S. CD34-positive cells and their subpopulations characterized by flow cytometry analyses on the bone marrow of healthy allogenic donors. Sao Paulo Med J. 2009, 127(1), 12-18.
6. Terstappen L. W., Huang S., Safford M, Lansdorp P. M., Loken M. R. Sequential Generations of Hematopoietic Colonies Derived From Single Nonlineage-Committed CD34+CD38- Progenitor Cells. Blood. 1991, 77(6), 1218-1227.
7. Boezeman J., Raymakers R., Vierwinden G., Linssen P. Automatic analysis of growth onset, growth rate and colony size of individual bone marrow progenitors. Cytometry. 1997, 28(4), 305-310.
8. Thoma S. J., Lamping C. P., Ziegler B. L. Phenotype analysis of hematopoietic CD34+ cell populations derived from human umbilical cord blood using flow cytometry and cDNA-polymerase chain reaction. Blood. 1994, 83(8), 2103-2114.
9. D'Arena G., Musto P., Cascavilla N., Di Giorgio G., Zendoli F., Carotenuto M. Human umbilical cord blood: immunophenotypic heterogeneity of CD34+ hematopoietic progenitor cell. Haematologica. 1996, 81(5), 404-409.
10. Terstappen L. W., Hollander Z., Meiners H., Loken M. R. Quantitative Comparison of Myeloid Antigens on Five Lineages of Mature Peripheral Blood Cells. J. Leukoc. Biol. 1990, 48(2), 138-148.
11. Antal-Szalmas P., Strijp J. A., Weersink A. J., Verhoef J., Van Kessel K. P. Quantitation of surface CD 14 on human monocytes and neutrophils. J. Leukoc. Biol. 1997, 61(6), 721-728.
12. Prokopovych S. K., Vinnitzkiy S. K. Dendritic cells and prospects of their use in immunotherapy of cancer. Oncologiia. 2001, 3(2-3), 126-131. (In Russian).
13. Lathers D. M., Lubbers E., Wright M. A., Young M. R. Dendritic cell differentiation pathways of CD34+ cells from the peripheral blood of head and neck cancer patients. J. Leukoc. Biol. 1999, 65(5), 623-628.
14. Perez S. A., Sotiropoulou P. A., Gkika D. G, Mahaira L. G, Niarchos D. K, Gritzapis A. D, Kavalakis Y. G, Antsaklis A. I., Baxeva-nis C. N., Papamichail P. A novel myeloid-like NK cell progenitor in human umbilical cord blood. Blood. 2003, 101(9), 3444-3450.
15. Egeland T., Steen R, Quarsten H, Gaudernack G, Yang Y. C, Thorsby E. Myeloid differentiation of purified CD34+ cells after stimulation with recombinant human granu locyte-monocyte colony-stimulating factor (CSF), granulocyte-CSF, monocyte-CSF, and interleukin-3. Blood. 1991, l78(12), 3192-3199.
16. Bender J. G, Unverzagt K. L, Walker D. E., Lee W, Van Epps D. E., Smith D. H, Stewart C. C., To L. B. Identification and comparison of CD34-positive cells and their subpopulations from normal peripheral blood and bone marrow using multicolor flow cytometry. Blood. 1991, 77(12), 2591-2596.
17. Kuchma M., Shablii V., Kyryk V., Onishchen-ko A., Shablii Yu., Lukash L., Lobintseva G. Phenotypic heterogenecity of hematopoirtic progrnitor cells from placental tissue comparative analysis with umbilical cord blood and fetal liver. Cell Organ Transplant. 2013, 1(1), 66-69.
18. Van Handel B., Prashad S. L., Hassanzadeh-Kiabi N., Huang A., Magnusson M., Atanassova B., Chen A., Hamalainen E. I., Mikkola H. K. The first trimester human placenta is a site for terminal maturation of primitive erythroid cells. Blood. 2010, 116(17), 3321-3330.
19. Loken M. R., Shah V. O., Dattilio K. L., Civin C. I. Flow cytometric analysis of human bone marrow: I. Normal erythroid development. Blood. 1987, 69(1), 255-263.
20. Klimchenko O., Mori M., Distefano A., Langlois T., Larbret F., Lecluse Y., Feraud O., Vainchenker W., Norol F., Debili N. A common bipotent progenitor generates the erythroid and megakaryocyte lineages in embryonic stem cell-derived primitive hematopoiesis. Blood. 2009, 114(8), 1506-1517.
21. Fritsch G., Stimpfl M., Kurz M., Printz D, Buchinger P., Fischmeister G., Hoecker P., Gadner H. The composition of CD34 subpopulations differs between bone marrow, blood and cord blood. Bone Marrow Transplant. 1996, 17(2), 169-78.
22. Okumura N., Tsuji K., Nakahata T. Changes in cell surface antigen expressions during proliferation and differentiation of human erythroid progenitors. Blood. 1992, 80(3), 642-650.
23. Rappold I., Ziegler B. L., Kohler I., Marchet-to S., Rosnet O., Birnbaum D., Simmons P. J., Zannettino A C., Hill B., Neu S., Knapp W., Alitalo R., Alitalo K., Ullrich A, Kanz L., Bühring H. J. Functional and phenotypic characterization of cord blood and bone marrow subsets expressing FLT3 (CD135) receptor tyrosine kinase. Blood. 1997, 90(1), 111-125.
24. Haynes B. F., Denning S. M., Singer K. H, Kurtzberg J. Ontogeny of T-cell precursors: A model for the initial stages of human T-cell development. Immunol. Today. 1989, 10(3), 87-91.
25. Bárcena A., Muench M. O., Roncarolo M. G., Spits H. Tracing the expression of CD7 and other antigens during T- and myeloid-cell differentiation in the human fetal liver and thymus. Leuk Lymphoma. 1995, 17(1-2), 1-11.
26. Schmitt C., Ktorza S., Sarun S., Verpil-leux M. P., Blanc C., Deugnier M. A., Dal-loul A., Debr P. CD34-positive early stages of human T-cell differentiation. Leuk. Lymphoma. 1995, 17(1-2), 43-50.
27. Grümayer E. R., Griesinger F., Hummell D. S., Brunning R. D., Kersey J. H. Identification of Novel B-Lineage Cells in Human Fetal Bone Marrow That Coexpress CD7. Blood. 1991, 77(l), 64-68.
28. Chabannon C., Wood P., Torok-Storb B. Expression of CD7 on normal human myeloid progenitors. J. Immunol. 1992, 149(6), 2110-2113.
29. Miller J. S., Alley K. A., Mc Glave P. Differentiation of natural killer (NK) cells from human primitive marrow progenitors in a stroma-based long-term culture system: identification of a CD34+7+ NK progenitor. Blood. 1994, 83(9), 2594-2601.
30. Bender J. G., Unverzagt K., Walker D. E., Lee W., Smith S., Williams S., van Epps D. E. Phenotypic analysis and characterization of CD34+ cells from normal human bone marrow, cord blood, peripheral blood, and mobilized peripheral blood from patients undergoing autologous stem cell transplantation. Clin. Immunol. Immunopathol. 1994, 70(1), 10-8.
31. Steen R., Tj0nnfjord G. E., Egeland T. Comparison of the phenotype and clono-genicity of normal CD34+ cells from umbilical
cord blood, granulocyte colony-stimulating factor-mobilized peripheral blood, and adult human bone marrow. J. Hematother. 1994, 3(4), 253-262.
32. Bender J. G., Unverzagt K. L., Walker D. E, Lee W., van Epps D. E., Smith D. H, Stewart C. C., To L. B. Identification and comparison of CD34-positive cells and their subpopulations from normal peripheral blood and bone marrow using multicolor flow cytometry. Blood. 1991, 77(12), 2591-2596.
33. Olweus J., Lund-Johansen F., Terstappen L. CD64IFcyRI Is a Granulo-monocytic Lineage Marker on CD34 Hematopoietic Progenitor Cells. Blood. 1995, 85(9), 2402-2413.
34 Carrasco J., Godelaine D., van Pel A., Boon T., van der Bruggen P. CD45RA on human CD8 T cells is sensitive to the time elapsed since the last antigenic stimulation. Blood. 2006, 108(9), 2897-2905.
35. Loken M. R., Shah V. O., Dattilio K. L, Civin C. I. Flow cytometric analysis of human bone marrow. II. Normal B lymphocyte. Blood. 1987, 70(5), 1316-1324.
36. Nadler L. M., Anderson K. C., Marti G, Bates M., Park E., Daley J. F., Schlossman S. F. B4, a human B lymphocyte-associated antigen expressed on normal, mitogen-activated, and malignant B lymphocytes. J. Immunol. 1983, 131(1), 244-50.
37. Loken M. R., Shah V. O., Dattilio K. L., Civin C. I. Flow cytometric analysis of human bone marrow. II. Normal B lymphocyte development. Blood. 1987, 70(5), 1316-1324.
38. Van Epps D. E., Bender J., Lee W., Schilling M, Smith A., Smith S., Unverzagt K., Law P., Burgess J. Harvesting, characterization, and culture of CD34+ cells from human bone marrow, peripheral blood, and cord blood. Blood Cells. 1994, 20(2-3), 411-423.
39. Shablii V. A., Kuchma M. D., Kyryk V. M, Onishchenko A. N., Lukash L. L., Lobyn-tseva G. S. Cryopreservation human placental tissue as source of hematopoietic and mesenchymal stem cells. Kletochnaia transplantologiia i tkanevaia inzheneriia. 2012, 7(1), 54-62. (In Russian).
40. Robin C., Bollerot K., Mendes S., Haak E., Crisan M., Cerisoli F., Lauw I., Kaimakis P., Jorna R., Vermeulen M., Kayser M., van der Linden R., Imanirad P., Verstegen M., Nawaz-Yousaf H., Papazian N., Steegers E., Cupedo T., Dzierzak E. Human placenta is a potent hematopoietic niche containing hematopoietic stem and progenitor cells throughout development. Stem Cell. 2009, 5(4), 385-395.
ГЕМОПОЭТИЧЕСКИЕ ПРОГЕНИТОРНЫЕ КЛЕТКИ ПЛАЦЕНТЫ И ПУПОВИННОЙ КРОВИ: ИММУНОФЕНОТИПИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ И ПОТЕНЦИАЛ К ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ in vitro
М. Д. Кучма1' 2, В. А. Шаблий1,2, В. М. Кирик3, А. Н. Свитина2, Ю. Н. Шаблий2, Ю. К. Прокопец2, Т. М. Индыченко2, Л. Л. Лукаш1, Г. С. Лобынцева2
1Институт молекулярной биологии и генетики
НАН Украины, Киев 2Институт клеточной терапии, Киев, Украина 3ГУ «Институт генетической и регенеративной медицины НАМНУ», Киев, Украина
E-mail: [email protected]
Целью работы было сравнительное исследование характера дифференцировки гемопо-этических прогениторных клеток плаценты и пуповинной крови in vivo и их мультипо-тентных свойств in vitro. Использовали методы выделения фракции мононуклеарных клеток из пуповинной крови, ткани зрелой плаценты и фетального хориона, проточной цитометрии и анализа потенциала к дифференциации. Установлено, что большинство гемопоэтических прогениторных клеток как в зрелой плаценте, так и в пуповинной крови остаются незрелыми элементами, но при этом в плацентарной ткани обнаружено большее содержание линейно-коммитированных клеток, среди которых: миелоидные предшественники с фенотипом CD34+CD45l0WCD33+SSCl0W' более поздние миелоидные прогениторы с фенотипом CD34+CD45lowCD14+SSClow (содержание достоверно выше, чем в пуповинной крови), эритроидные прогениторы с фенотипом CD34+CD45lowCD235+SSClow (содержание достоверно выше, чем в пуповинной крови), В-лимфоидные прогениторы с фенотипом CD34+CD45lowCD19+SSClow, Т-лимфоидные прогениторы и Natural Killer Cells-прогениторы с фенотипом CD34+CD45lowCD7+SSClow, а также зрелые Т-лимфоциты на разных стадиях созревания с фенотипами CD7+CD45+ и CD7+CD45RA+CD45+ соответственно. В условиях in vitro гемопоэтические прогениторные клетки плацентарной ткани имеют сходный с клетками пуповинной крови мультипотент-ный потенциал. Наличие в плацентарной ткани кроветворных клеток на разных стадиях и направлениях дифференцировки свидетельствует о том, что в плаценте происходит гемопоэз на протяжении всего срока гестации.
Ключевые слова: плацентарный гемопоэз, гемопоэтические прогениторные клетки.
HEMATOPOIETIC PROGENITOR CELLS OF PLACENTAL AND UMBILICAL CORD BLOOD: IMMUNOPHENOTYPIC ANALYSIS AND DIFFERENTIATION POTENTIAL
in vitro
M. D. Kuchma1 2, V. A. Shablii1'2, V. M. Kyryk3, A. N. Svitina2, Yu. N. Shablii2, Yu. K. Prokopets2, T. M. Indichenko2, L. L. Lukash1, G. S. Lobyntseva2
institute of Molecular Biology and Genetics, of the National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv
2Institute of Cellular Therapy, Kyiv, Ukraine 3State Organization «Institute of Genetic and Regenerative Medicine of the National Aademy of Medical Sciences of Ukraine», Kyiv
E-mail: [email protected]
The aim of the work was the comparative studing of the character of differentiation of he-matopoietic progenitor cells of the placenta and umbilical cord blood in vivo and their multipotent properties in vitro. The proposed methods were used for mononuclear cells isolation from umbilical cord blood, placental tissue and mature fetal chorion, of flow cytometry and of analysis of the potential for differentiation. We found that majority of hematopoietic progenitor cells both in mature placenta and umbilical cord blood remains uncommitted, however in placental tissue we found more amount of differentiated cells that include myeloid progenitor with a phenotype CD34+CD45l0WCD33+SSCl0W' later myeloid progenitors with a phenotype CD34+CD45lowCD14+SSClow (their content is significantly higher than in cord blood), erythroid progenitors with a phenotype CD34+CD45lowCD235+SSClow (their number significantly above than that in cord blood), B-lymphoid progenitors with a phenotype CD34+CD45lowCD19+SSClow, T-lymphoid
progenitors and Natural Killer Cells-progenitors with a phenotype CD34+CD45lowCD7+SSClow, and also T-lymphocytes at the different stages of maturation with a phenotypes CD7+CD45+ and CD7+CD45RA+CD45+ respectively. Placental hematopoietic progenitor cells have similar potential for differentiation in vitro in comparison with cord blood ones. Presence of he-matopoietic cells in placental tissue at different stages and lines of differentiation suggests that the placental hematopoiesis last during all term of gestation.
Key words: placental hematopoiesis, hemato-poie tic progenitor cells.
