CC BY
73
УДК 57.086.14; 57.086.18
ВИЯВЛЕННЯ ТА ХАРАКТЕРИСТИКА ПЛОСКИХ ЕРИТРОЇДНИХ КОЛОНІЙ У НАПІВТВЕРДИХ КУЛЬТУРАЛЬНИХ СЕРЕДОВИЩАХ
М. Д. Кучма1, 2 1Інститут молекулярної біології та генетики НАН України, Київ
В. А. Шаблій1, 2
В. М. Кирик3 2ТОВ «Інститут клітинної терапії», Київ, Україна
Г. М. Світіна2
Ю. К. Прокопець2 3ДУ «Інститут генетичної та регенеративної медицини НАМН»,
Т. М. Індиченко2 Київ, Україна
О. М. Цупіков3 Л. Л. Лукаш1 Г. С. Лобинцева2 E-mail: kuchma@gmx.com
Отримано 25.02.2014
За культивування ядровмісних клітин пуповинної крові, плаценти та «мобілізованої» периферичної крові в напівтвердих культуральних середовищах утворюються плоскі еритроїдні колонії. На 14-ту добу культивування вони можуть формувати один або декілька червоних агрегатів та досягати великих розмірів, що свідчить про їхню високу проліферативну активність і подібність до гра-нулоцитарних, еритроцитарних, моноцитарно/макрофагальних, мегакаріоцитарних колонієутво-рювальних одиниць. Нами було встановлено, що 92% клітин плоских колоній експресують CD235, що вказує на їх належність до еритроїдного клітинного ростка, однак морфологія відрізняється від еритроїдних бурстоутворювальних та еритроїдних колонієутворювальних одиниць. Імовірність появи їх у метилцелюлозовмісному середовищі становить 2,5% ±1%, що достовірно нижче, ніж в агарвмісному, — 58%±4,8%. Таким чином, за підрахунку та класифікації після культивування в напівтвердому культуральному середовищі плоскі колонії варто або виділяти в окрему групу, або, з огляду на низьку ймовірність їх появи в метилцелюлозовмісному середовищі, відносити до еритро-їдних бурстоутворювальних одиниць.
Ключові слова: еритроїдні колонії, колонієутворювальна активність, пуповинна кров, плацента, мобілізована периферична кров.
Визначення колонієутворювальної активності є одним із найбільш поширених методів для обчислення кількості функціональних гемопоетичних клітин-попередни-ків у таких тканинах, як пуповинна кров, кістковий мозок та мобілізована периферична кров. Визначаючи колонієутворювальну активність, оцінюють кількість різних типів колоній у напівтвердому культуральному середовищі після посіву певної кількості клітин. Відносний вміст різних типів коло-нієутворювальних одиниць дає інформацію про здатність до проліферації та диференціювання (у гранулоцитарному, моноцитар-ному, еритроїдному та мегакаріоцитарному напрямах) [1]. Однак іноді за культивування можуть траплятися колонії, які важко класифікувати без використання додаткових методів дослідження. Так, ми спостерігали наявність плоских еритроїдних колоній
(ПЕК), опис яких відсутній у відповідній доступній літературі з визначення морфології колоній у напівтвердому середовищі під час культивування кровотворних клітин [2]. Метою роботи було охарактеризувати ПЕК та встановити фенотип клітин, які утворюють їх у напівтвердому культуральному середовищі з подальшим визначенням належності до певного типу колоній методом візуаліза-ції на «живих» препаратах з використанням мікроскопа, без додаткових аналізів.
Матеріали і методи
Виділення фракції ядровмісних клітин (ЯК) із пуповинної крові та тканини зрілої плаценти
Пуповинну кров, зібрану за стандартною методикою, та плаценту одержували після пологів (фізіологічних або шляхом кесаре-
вого розтину) на 39-41-му тижні вагітності у 23-36-річних жінок за їхньою інформованою згодою. Пуповинну кров і тканину плаценти тестували на наявність аеробних, анаеробних бактерій, а також грибкової інфекції.
Для отримання ЯК до пуповинної крові додавали розчин 6%-го гідроксіетилкрохма-лю та седиментували за кімнатної температури до чіткого розділення фракції еритроцитів і ЯК, після чого фракціонували й центрифугували при 400 g протягом 20 хв. Осад клітин ресуспендували у вихідному розчині.
Для виділення клітин із плаценти очищали її від амніотичної оболонки і відрізали пуповину. Плацентарну тканину подрібнювали стерильними ножицями на фрагменти 1-3 мм, які промивали розчином Хенкса для видалення залишків крові до повного знебарвлення розчину. Потім тканину обробляли розчином ензимів: 0,2% колагенази І (Serva, Німеччина), 0,35 мг/мл гіалуроніда-зи (Sigma, США), 100 од/мл DNase I (Sigma, США) з додаванням 1 мг/мл BSA упродовж 30-50 хв за +37 “С. Після цього плацентарні клітини одержували шляхом фільтрування суспензії через клітинний фільтр із діаметром пор 70 мкм (Becton Dickinson, США). Клітини після ензимації відмивали у фосфатно-сольовому буферному розчині, додаючи 1 мг/мл бичачого сироваткового альбуміну, центрифугуванням суспензії при 300 g протягом 10 хв та суспендуванням у тому самому розчині. Тканину, що залишалась, інкубували зі свіжою порцією ензимів протягом 30-60 хв при +37 “С. Клітини також відмивали і об’єднували. Фракцію ЯК одержували фракціонуванням на фіколі (щільність
1,077 г/мл, Biochrome, Німеччина), двічі відмивали від фіколу, фільтрували через клітинний фільтр з діаметром пор 40 мкм.
«Мобілізована» периферична кров
Гемопоетичні стовбурові клітини (ГСК) отримували із проб периферичної крові пацієнтів з гострими нелімфобластними лейкозами, яким було проведено попередню процедуру мобілізації ГСК з використанням відповідних мобілізуючих агентів і подальшим збором клітин CD34+ за стандартною методикою.
Кріоконсервування пуповинної крові
До суспензії ЯК, яку одержували вищеописаним методом, повільно додавали розчин 10% ДМСО (Sigma, США) до кінцевої концентрації 5%, розливали в кріоампули і проводили кріоконсервування за програ-
мою, наведеною в [3], за допомогою приладу програмного заморожувача ЗП-6.00.00.00. За температури -140 “С процес охолодження в програмному заморожувачі зупиняли й переносили матеріал у рідкий азот (-196 “С) на довгострокове зберігання. Розморожування здійснювали на водяній бані (від +38 до +40 “С) до появи в кріоампулі рідкої фази (0 “С).
Культивування фракції ЯК пуповинної крові, плаценти та «мобілізованої» периферичної крові в метилцелюлозовмісному й агарвмісному середовищах
Для дослідження колонієутворювальної здатності плаценти та «мобілізованої» периферичної крові культивували нативні зразки. З метою аналізу колоній ЯК пуповинної крові культивували нативні та кріоконсерво-вані зразки. Кріоконсервовані ЯК пуповинної крові розморожували, як описано вище,
і відмивали від кріопротектора шляхом додавання до суспензії клітин з кріопротек-тором розчину 2,5%-го альбуміну людини (Біофарма, Україна) та 5%-го декстрану 40 (Юрія-Фарм, Україна) у розчині хлориду натрію 0,9%, дуже повільно, краплинами, до кінцевої концентрації ДМСО 2,5%. Суспензію центрифугували при 300 g протягом 10 хв. Клітини підраховували у камері Го-ряєва. Потім культивували їх у кількості 5104 на чашку Петрі діаметром 35 мм у дублікатах в метилцелюлозовмісному середовищі MethoCult (Stem Cell Technologies, Канада) або в агарвмісному середовищі при 37 “С в атмосфері з 5% СО2. Агарвмісне середовище містило такі компоненти: середовище AIM-V (Gibco , Німеччина), 50 нг/мл SCF, 10 нг/мл G-CSF, 10 нг/мл GM-CSF, 10 нг/мл IL-3, 9 нг/мл Еро (Biochrom, Німеччина), 30% ФБС (Gibco, Німеччина) та 0,3% агару.
Проводили спостереження за ростом колоній до 21-ї доби культивування за допомогою інвертованого мікроскопа CKX41 (Olympus, Японія).
Проточна цитометрія
Для імунофенотипування клітин ПЕК пуповинної крові на 15-ту добу культивування ізолювали колонії з агарвмісного культурального середовища за допомогою піпеткового дозатора під інвертованим мікроскопом, відмивали в культуральному середовищі альфа-МЕМ та буфері Cell Wash (BD, США), інкубували при +4 “С протягом 30 хв із первинними моноклональними антитілами в робочій концентрації 0,5 мкг на 106 клітин. При цьому використовували такі флуорохром-мічені моноклональні антитіла
(Becton Dickinson, США), як anti-CD33 FITC, anti-CD235a PE та anti-CD14 Pacific Blue. Не зв’язані антитіла відмивали в буфері Cell Wash. Аналізували лише популяцію живих клітин, які не забарвлювались барвником 7-AAD. Імунофенотипування проводили із застосуванням лазерного проточного ци-тофлуориметра-сортера BD FACSAria (Becton Dickinson, США) і спеціальної програми FACS Diva 6.1.2, аналізуючи одночасно 2 параметри світлорозсіювання та 3 параметри флуоресценції. Для налаштування компенсації перекриття спектрів емісії флуорохро-мів за багатопараметричного аналізу використовували контрольні зразки клітин без внесення антитіл (unstained control), зразки з кожним із антитіл окремо (single stained control) та зразки з комбінацією декількох антитіл без одного (fluorescence minus one control).
Імуноцитохімічні дослідження
Для проведення імуноцитохімічного аналізу клітин ПЕК пуповинної крові на 14-ту добу культивування ізолювали колонії із агарвмісного середовища за допомогою пі-петкового дозатора під інвертованим мікроскопом і наносили у вигляді мазка на предметне скло, висушували та фіксували забу-ференим розчином 4%-го параформальдегіду впродовж 15 хв. Неспецифічне зв’язування антитіл блокували інкубуванням цитопрепа-ратів за кімнатної температури в розчині 0,1 М фосфатного буфера, що містив 0,5% сироваткового альбуміну бика. Для детекції гліко-форину А використовували флуорохром-мі-чені моноклональні антитіла anti-CD235a PE (Becton Dickinson, США) і для посилення сигналу візуалізації проводили зв’язування первинних антитіл зі вторинними антитілами goat anti mouse-Alexa 488 (Invitrogen, Німеччина). Контролем слугували цитопрепарати, які після блокування не інкубували з атитіла-ми anti-CD235a PE, а витримували зі вторинними антитілами goat anti mouse-Alexa 488. Візуалізували зображення на конфокальному лазерному сканyвальному мікроскопі FV1000-BX61WI (Olympus, Японія).
Статистичний аналіз
Результати подано у вигляді середніх величин з 95%-м довірчим інтервалом. Статистичну значущість відмінностей між вибірками визначали за допомогою U-критерію Манна-Уїтні. Середню помилку розраховували шляхом встановлення достовірності відмінностей за альтернативного варіювання. Для визначення статистичної значущості
відмінностей з’ясовували, чи розрізняються суттєво відносні частоти появи подій.
Результати та обговорення
Під час культивування клітин пуповинної крові, плаценти та мобілізованої периферичної крові в напівтвердому середовищі спостерігали всі характерні для клітин крові типи колоній, зокрема колонії еритроїдних попередників: BFU-E (бурстоутворювальні еритроїдні одиниці), CFU-E (колонієутво-рювальні еритроїдні одиниці); колонії попередників гранулоцитів та моноцитів: CFU-M (колонієутворювальні макрофагальні одиниці), CFU-G (колонієутворювальні грану-лоцитарні одиниці), CFU-GM (колонієутво-рювальні гранулоцитарні та макрофагальні одиниці) і змішані колонії: CFU-GEMM (ко-лонієутворювальні гранулоцитарні, еритро-цитарні, моноцитарно/макрофагальні, мега-каріоцитарні одиниці). Окрім таких колоній, у культурі ЯК пуповинної крові, плаценти та мобілізованої периферичної крові були наявні ПЕК (рис. 1, б).
ПЕК виявляли в 58% ± 4,8% (n = 108) випадках культивування як нативної, так і кріо-консервованої пуповинної крові в агарвміс-ному середовищі. Однак за культивування нативної або кріоконсервованої пуповинної крові в метилцелюлозовмісному середовищі (n = 238) імовірність появи ПЕК, на відміну
Рис. 1. ПЕК (а) та CFU-B (б) нативної пуповинної крові в агарвмісному напівтвердому середовищі
14-та доба культивування, світлова мікроскопія, ок.х10,об. х10
від агарвмісного середовища, була достовірно нижчою (Р = 0,0006) і становила 2,5% ± 1%. Розрахунок ймовірності появи таких колоній проводили разом для ЯК нативної та кріоконсервованої пуповинної крові, оскільки кріоконсервування пуповинної крові не впливало на вірогідність появи ПЕК. Про це свідчила відсутність достовірної різниці в частотах появи таких колоній у культурі нативної (n = 138) та кріоконсервованої (n = 108) пуповинної крові в метилцелюло-зовмісному середовищі (Р = 0,0006) і натив-ної (n = 54) та кріоконсервованої (n = 44) пуповинної крові в агарвмісному середовищі (Р = 0,0006). Відносна кількість ПЕК ЯК пуповинної крові не залежала від складу середовища і становила 4,4% (0,9-10,6%) (n = 6) у метилцелюлозовмісному середовищі
та 3,6% (2,1-5,6%) (n = 58) в агарвмісному середовищі, однак в окремих випадках кількість їх досягала майже 50%. При цьому відносна кількість ПЕК пуповинної крові була достовірно вищою (Р < 0,01), ніж кількість CFU-GEMM, відсоток яких становив 1,7 (0,6-3,5%, при n = 20). Відносна кількість ПЕК плацентарної тканини в агарвмісному середовищі дорівнювала 16,2% (7,3-27,7%, n = 4).
За культивування ПЕК пуповинної крові, плаценти або мобілізованої периферичної крові на дні культуральних чашок утворювалися кластери, що складалися з 3-12 клітин, які розміщувались поодиноко на невеликій відстані або утворювали так звані поля вже на 7-му добу (рис. 2, а), що могли досягати великих розмірів порівняно з колоніями інших типів. Уже на початку культивування
б
Щ* '•
Ш'М-
ж&
-• " - ' :
Рис. 2. Колонії клітин нативної пуповинної крові в агарвмісному напівтвердому середовищі
(світлова мікроскопія):
а — ПЕК;
б — еритроїдна або мієлоїдна колонія, 7-ма доба культивування, ок. x10, об. x10; в — ПЕК з одним агрегатом, 14-та доба культивування, ок. x 10, об. x 10; г — ПЕК із двома агрегатами, 14-та доба культивування, ок. x10, об. x5; д — велика колонія у вигляді поля, 14-та доба культивування, ок. x10, об. x5; е — зруйновані клітини ПЕК, 17-та доба культивування, ок. x10, об. x10
в
такі кластери добре помітні й відрізняються від усіх інших кластерів (рис. 2, б). На 14-ту добу культивування вони, як правило, мають правильну округлу форму і чітко окреслені краї (рис. 1, а). Клітини в колонії щільно прилягають одна до одної. На цей час у структурі колонії можуть утворюватись один (рис. 2, в) або декілька агрегатів (рис.
2, г), які мають червоне забарвлення. У деяких випадках такі колонії перетворювались на величезні поля клітин (рис. 2, д). Вже на 17-ту добу культивування клітини починали руйнуватися (рис. 2, е).
Під час культивування ЯК пуповинної крові в метилцелюлозовмісному середовищі, а також ЯК кріоконсервованої пуповинної
крові, клітин плаценти та мобілізованої не-риферичної крові в агарвмісному середовищі ПЕК утворюються у такий спосіб, як описано вище, і мають такий самий вигляд, як ПЕК нативної пуповинної крові в агарвмісному середовищі (рис. 3).
Оскільки ймовірність виявлення ПЕК була більшою в агарвмісному середовищі, дослідження імунофенотипу таких колоній проводили в культурі ЯК нативної пупо-винної крові з використанням середовища, до складу якого входив агар. Результати проточної цитометрії клітин, ізольованих з ПЕК, показали, що 92% клітин експресують CD235 (рис. 4, а). При цьому 80,8% клітин мали фенотип CD235+CD33 CD14-. Були
д
е
Рис. 3. Утворення ПЕК ЯК пуповинної крові в метилцелюлозовмісному середовищі, а також ЯК кріоконсервованої пуповинної крові, клітин плаценти та мобілізованої периферичної крові
в агарвмісному середовищі (світлова мікроскопія):
а — ПЕК нативної нуновинної крові в метилцелюлозовмісному середовищі, 14-та доба культивування, ок. x10, об. x10;
б — ПЕК з одним агрегатом, ок. x10, об. x5 нативної нуновинної крові в метилцелюлозовмісному середовищі, 14-та доба культивування; в — ПЕК клітин кріоконсервованої нуновинної крові, 14-та доба культивування, ок. x10, об. x10; г — початок утворення ПЕК клітин плацентарної тканини, 5-та доба культивування, ок. x10, об. x10; д — колонія ПЕК з агрегатом клітин плацентарної тканини, 14-та доба культивування, ок. x10, об. x5; е — ПЕК клітин «мобілізованої» периферичної крові, 14-та доба культивування, ок. x10, об. x5
також присутні клітини, що мали фенотип СБ235+СБ33+СБ14+ у кількості 5,2%, і клітини з фенотипом СБ235+СБ33СБ14+ у кількості 4,9% та 1% клітин СБ235+СБ33+СБ14-. Клітини з таким фенотипом трапляються також у популяціях нативної пуповинної крові (рис. 4, в) і плацентарної тканини (рис. 4, г). Ми виявили серед аналізованих клітин 13% таких, що експресували СБ33, та 16,9% —
із експресією СБ14, при цьому 11,6% мали фенотип СБ33+СБ14+, 5,4% — фенотип СБ33СБ14+ і 1,8% — фенотип СБ33+СБ14-(рис. 4, б).
Результати імуноцитохімічного дослідження показали, що ПЕК без агрегатів, які росли в культурі ЯК нативної пуповинної крові в агарвмісному середовищі, експресу-ють СБ235 (рис. 5).
У роботі описано ПЕК, що трапляються за культивування ЯК пуповинної крові, плаценти та «мобілізованої» периферичної крові
в напівтвердому середовищі. У разі класифікації колоній з використанням світлового мікроскопа ПЕК схожі на СЕИ-ОЕММ, оскільки мають великі розміри і можуть містити агрегат еритроїдних клітин. СЕИ-ОЕММ — колонії, які частіше містять в центрі еритро-їдні клітини, а також гранулоцити, макрофаги, мегакаріоцити, які розміщуються на периферії. Значно рідше останні концентруються з іншого боку від еритроїдних клітин, при цьому такі колонії більші за розмірами, ніж БЕИ-Е та СЕИ-ОМ, трапляються відносно рідко і в більшості зразків присутні в кількості менше 10% [4, 5]. Однак проведені нами дослідження показали, що ПЕК не належать до СЕИ-ОЕММ. Про це свідчить більша кількість ПЕК у культурі, ніж СЕИ-ОЕММ, а в окремих культурах відносна кількість ПЕК сягає майже 50%, що не характерно для колоній СЕи-ОЕММ.
С'а, 6
О
О
міІ....принц..........|........
-139
10'
CD235 PE-A
......І—г
10" 10s
о
33+14- CD33+14+
ijyA'j . ' .
~;А 30t---v ■
|у ■ ■ CD33-H+
||||||||[||[|||
10
1D 10
CD1 4 DAPI-A
ю
1 І І НІНІ—ГГТТ1 ЦІ] ТІ 11 III І—Г
з .!г S
'.UL.JSI 111 ТІ II <ча-!
О-< -■ . ШВяЯК}1' »*■ * ■ "
Q : ■ . .
CDZ35hil4hi
■304
I,..............
С10 ш
I 11II
10'
CD235a PE-A
I I I Mill—г * Ш5
0 10 10 10
С0235а РЕ-А
Рис. 4. Двовимірні гістограми експресії поверхневих маркерів: а — СБ235 та СБ33 на клітинах ПЕК нативної пуповинної крові на 15-ту добу культивування в агарвмісному середовищі;
б — СБ14 та СБ33 на клітинах ПЕК нативної пуповинної крові на 15-ту добу культивування в агарвмісному середовищі;
в — ОБ235 і ОБ14 на нативних клітинах пуповинної крові та плаценти; г — СБ235 і СБ14 на нативних клітинах плаценти;
на осях позначено інтенсивність флуоресценції на відповідних каналах (програма ВБ ЕЛСЯБІуа 6.1.2)
б
a
в
г
Рис. 5. Виявлення експресії CD235 на поверхневій мембрані клітин ПЕК без агрегатів у культурі ЯК пуповинної крові в агарвмісному середовищі
(комбінація флуоресцентної мікроскопії та фазового контрасту)
Природу ПЕК було встановлено за допомогою проточної цитометрії та імуноцито-хімічного аналізу. Клітини, які було нами проаналізовано методом проточної цитоме-трії, ізольовані переважно з колоній, які не містили яскраво вираженого еритроїдного агрегату. Значна кількість клітин експресу-вала CD235. Як відомо, CD235 (Glycophorin A) експресується на зрілих еритроцитах [6] та на примітивних фетальних еритроїдних клітинах [7]. Серед аналізованих клітин у незначній кількості були присутні клітини, що експресували CD33 та/або CD14. Відомо, що CD33 — один із маркерів, що характерний для клітин ранньої стадії диференціювання в мієлоїдному напрямі [8, 9]. CD14 вважають мієлоїдним маркером, він з’являється на моноцитах на більш пізніх стадіях дозрівання, експресується на базофілах і нейтрофілах [10, 11]. CD14 також експресується на початкових та проміжних етапах диференціювання дендритних клітин [12].
Таким чином, більша частина аналізованих клітин ПЕК були еритроїдними, а ті мієлоїдні клітини, які ми виявили під час аналізу ПЕК, можуть бути макрофагами та їхніми попередниками, які, як відомо, підтримують еритропоез у гемопоетичних тканинах [13-15]. Не виключено, що ці клітини могли потрапити із сусідніх колоній за відбору ПЕК. Цікаво, що аналізовані клітини містили невелику кількість таких клітин з фенотипами CD235+CD33+CD14+, CD235+CD33-CD14+ та CD235+CD33+CD14-. Нами також встановлено, що наявність клітин з таким фенотипом є характерною для нативної пупо-винної крові та тканини плаценти. Відомо, що еритроїдна і мієлоїдна лінія диференцію-
вання мають спільні клітини-попередники. Так, CD133+ клітини кісткового мозку в умовах культивування утворюють клітини, що коекспресують CD13 та CD36 і мають здатність до диференціювання в еритроїдному та мієлоїдному напрямах залежно від наявності відповідних факторів росту [16]. Тож можливо, що ПЕК або містять такі мієлоеритроїдні прогенітори, або ж вони потрапили до аналізованих клітин із сусідніх колоній.
Для підтвердження еритроїдної природи таких колоній імуноцитохімічним аналізом було досліджено клітини ПЕК, які не містили еритроїдного агрегату, і виявлено експресію CD235 на аналізованих клітинах. Це дає підстави стверджувати, що ПЕК, які трапляються за культивування ЯК пуповинної крові, плаценти та мобілізованої периферичної крові в напівтвердому середовищі, є ери-троїдними. Однак морфологія ПЕК суттєво відрізняється від BFU-E та CFU-E. CFU-E — невеликі колонії у вигляді одного або двох кластерів червоного чи коричневого кольору, що містять 8-200 еритробластів. BFU-E — колонії у вигляді одного або декількох кластерів червоного або коричневого кольору, що містять більше 200 клітин, які є менш диференційованими еритроїдними проге-ніторами, ніж клітини колоній CFU-E [17, 5]. Нами було показано, що ПЕК здатні перетворюватися на величезні поля клітин; це свідчить про високу проліферативну активність клітин-попередників, які утворюють такі колонії, а отже, про те, що вони можуть бути дуже ранніми прогеніторами. Тому слід вважати, що в разі визначення морфології колоній після культивування в напівтвердому середовищі ПЕК варто виділяти в окрему групу колоній або відносити до BFU-E, оскільки вони утворені з ранніх еритроїдних прогеніторів.
Плацентарна тканина, як і пуповинна та мобілізована периферична кров, містить прогенітори, з яких утворюється ПЕК. Наше спостереження щодо подібності росту еритро-їдних ПЕК, утворених клітинами плаценти, пуповинної та «мобілізованої» периферичної крові, показує схожість гемопоетичних про-геніторних клітин із різних джерел. Аналогічні дані в доступній літературі не описано. Вони мають значення у зв’язку з тим, що плаценту почали розглядати як можливе додаткове джерело гемопоетичних прогенітор-них клітин [18-20], оскільки існує дефіцит донорів цих клітин для трансплантацій. Тож актуальним є порівняння властивостей гемо-поетичних прогеніторних клітин плаценти з властивостями таких клітин, ізольованих з
інших джерел, для оцінки можливостей їх клінічного застосування [21].
Таким чином, показано, що під час культивування ЯК пуповинної крові, плаценти та мобілізованої периферичної крові в напівтвердому середовищі утворюються ПЕК, які складаються з клітин, що ростуть в одній площині й можуть утворювати один або декілька агрегатів на 14-ту добу культивування. ПЕК можуть досягати великих розмірів, тому клітини, які їх утворюють, є ранніми прогеніторами. 92% клі-
REFERENCES
1. Sarma N. J., Takeda A., Yaseen N. R. Colony Forming Cell (CFC) Assay for Human Hematopoietic Cells. J. Visual. Experim. 2010, (46). Doi: 10.3791/2195.
2. Nissen-Druey C., Tichelli A., Meyer-Monard S. Human hematopoietic colonies in health and disease. Acta Haematol. 2005, 113(1), 5-96.
3. Pat. UA 46673А. Method of the human hematopoietic cells preserving. Lobintseva G. S. Appl. 14.01.2002; Published 15.05.2002, Bull. № 5.
4. Ash R. C., Detrick D. A. Zanjani E. D. Studies of human pluripotential hemopoietic stem cells (CFU-GEMM) in vitro. Blood. 1981, 58 (2), 309-16.
5. Stem cell technology. Identification of Colonies Derived from Human Hematopoietic Progenitors. Manual for usingMethoCult. 1-2.
6. Loken M. R., Shah V. O., Dattilio K. L., Civin C. I. Flow cytometric analysis of human bone marrow: I. Normal erythroid development. Blood. 1987, 69 (1), 255-263.
7. Klimchenko O., Mori M., Distefano A., Langlois T., Larbret F., Lecluse Y., Feraud O., Vainchenker W., Norol F., Debili N. A common bipotent progenitor generates the erythroid and megakaryocyte lineages in embryonic stem cell-derived primitive hematopoiesis. Blood. 2009, 114 (8), 1506-17.
8. Gaipa G., Coustan-Smith E., Todisco E., Maglia O, Biondi A., Campana D. Characterization of CD34+, CD13+, CD33- cells, a rare subset of immature human hematopoietic cells. Haematologica. 2002, 87 (4), 347-56.
9. Carvalho J. M., Souza M. K., Buccheri V., Rubens C. V., Kerbauy J., Oliveira J. S. CD34-positive cells and their subpopulations characterized by flow cytometry analyses on the bone marrow of healthy allogenic donors. San Paulo Med. J. 2009, 127(1), 12-8.
10. Terstappen L. W., Hollander Z., Meiners H., Loken M. R. Quantitative Comparison of Myeloid Antigens on Five Lineages of Mature Peripheral Blood Cells. J. Leukoc. Biol. 1990, 48 (2), 138-48.
11. Antal-Szalmas P., Strijp J. A., Weersink A. J.,
Verhoef J., van Kessel K. P. Quantitation of surface CD14 on human monocytes and neutrophils. J. Leukoc. Biol. 1997, 61 (6), 721-8.
тин ПЕК експресують CD235, що свідчить про належність колоній до еритроїдних. За підрахунку та класифікації колоній після культивування в напівтвердих середовищах імовірність появи їх у метилцелюлозовмісному середовищі достовірно нижча, ніж в агарвмісному (2,5% ± 1%). Отже, ПЕК варто або виділяти в окрему групу, або, з огляду на низьку ймовірність появи їх у метилцелюлозовмісному середовищі, відносити до BFU-E, оскільки вони утворені з ранніх еритроїдниих прогеніторів.
12. Prokopovych S. K., Vinnitzkiy S. K. Dendritic cells and prospects of their use in immunotherapy of cancer. Oncology. 2001, 3 (2-3), 126-131. (In Russian).
13. Sadahira Y., Mori M. Role of the macrophage in erythropoiesis. Pathol. Int. 1999, 49 (10), 841-848.
14. Van Handel B., Prashad S. L., Hassanzadeh-Kiabi N., Huang A., Magnusson M., Atanasso-va B., Chen A., Hamalainen E. I., Mikkola H. K. The first trimester human placenta is a site for terminal maturation of primitive erythroid cells. Blood. 2010, 116 (17), 3321-30.
15. Grischenko V. I., Lobyntseva G. S., Votyakova I. A., Shereshkov S. I. Fetal liver hematopoietic cells. Kyiv: Naukova dumka, 1988, 192 p. (In Russian).
16. Chena L., Gaoa Z., Zhua J., Rodgers G. P. Identification of CD13+CD36+ cells as a common progenitor for erythroid and myeloid lineages in human bone marrow. Exp. Hematol. 2007, 35 (7), 1047-1055.
17. Tepperman D., Curtis J. E. McCulloch E. A. Erythropoietic Colonies in Cultures of Human Marrow. Blood. 1974, 44 (5), 659-669.
18. Barcena A., Kapidzic M., Muench M. O., Gor-mley M., Scott M. A., Weier J. F., Ferlatte C, Fisher S. J. The human placenta is a hematopoietic organ during the embryonic and fetal periods of development. Dev Biol. 2009, 327(1), 24-33.
19. Serikov V., Hounshell C., Larkin S., Green W., Ikeda H., Walters M. C., Kuypers F. A. Human term placenta as a source of hematopoietic cells. Exp Biol Med (Maywood). 2009, 234(7), 813-23. doi: 10.3181/0809-BC-262. Epub 2009 May 8.
20. Shablii V. A., Kuchma M. D., Kyryk V. M., Onishchenko A. N., Lukash L. L., Lobintseva G. S. Cryopreservation human placental tissue as source of hematopoietic and mesenchymal stem cells. Cellular transplantation and tissue engineering. 2012, 7(1), 54-62. (In Russian).
21. Kuchma M., Shablii V., Kyryk V., Onishchenko A., Shablii Yu., Lukash L., Lobintseva G. Phenotypic heterogenecity of hematopoirtic pro-grnitor cells from placental tissue compaative analysis with umbilical cord blood and fetal liver. Cell and organ transplantology. 2013, 1(1), 66-69.
ВЫЯВЛЕНИЕ И ХАРАКТЕРИСТИКА ПЛОСКИХ ЭРИТРОИДНЫХ КОЛОНИЙ В ПОЛУТВЕРДЫХ КУЛЬТУРАЛЬНЫХ СРЕДАХ
М. Д. Кучма1, 2 В. А. Шаблий1, 2 В. М. Кирик3 А. Н. Свитина2 Ю. К. Прокопец2 Т. М. Индыченко2 О. М. Цупиков3 Л. Л. Лукаш1 Г. С. Лобынцева2
1Институт молекулярной биологии и генетики НАН Украины, Киев
2ООО «Институт клеточной терапии», Киев, Украина
3ГУ «Институт генетической и регенеративной медицины НАМН», Киев, Украина
E-mail: kuchma@gmx.com
При культивировании ядросодержащих клеток пуповинной крови, плаценты и «мобилизованной» периферической крови в полутвердых культуральных средах образуются плоские эритроидные колонии. На 14-е сут культивирования они могут формировать один или несколько красных агрегатов и достигать больших размеров, что свидетельствует об их высокой пролиферативной активности и сходстве с гранулоцитарными, эритроцитарными, моноцитарно/макрофагальными, мегакарио-цитарными колониеобразующими единицами. Нами было установлено, что 92% клеток плоских колоний экспрессируют CD235, что указывает на принадлежность их к эритроид-ному клеточному ростку, хотя морфология колоний отличается от эритроидных бурстообра-зующих и эритроидных колониеобразующих единиц. Вероятность появления их в метилцел-люлозосодержащей среде составляет 2,5% ± 1%, что достоверно ниже, чем в агарсодержащей, — 58% ± 4,8%. Таким образом, при подсчете и классификации после культивирования в полутвердой культуральной среде плоские колонии следует либо выделять в отдельную группу, либо, ввиду низкой вероятности их появления в метилцеллюлозосодержащей среде, относить к эритроидным бурстообразующим единицам.
DETECTION AND CHARACTERISTIC OF FLAT ERYTHROID COLONIES IN SEMISOLID CULTURAL MEDM
M. D. Kuchma1, 2 V. A. Shablii1 2 V. M. Kyryk3 A. N. Svitina2 Yu. K. Prokopets2 T. M. Indichenko2 O. M. Tsupykov3 L. L. Lukash1 G. S . Lobyntseva 2
institute of Molecular Biology and Genetics of the National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv
2Institute of Cellular Therapy, Kyiv, Ukraine
3Institute of Genetic and Regenerative Medicine of the National Academy of Medical Sciences of Ukraine, Kyiv
E-mail: kuchma@gmx.com
It have been shown that progenitor cells of cord blood, bone marrow and “mobilized” peripheral blood in semisolid media gave flat erythroid colonies. These colonies are able to form one or more red centers on the
14th day of cultivation and get a big size that evidence about high proliferative activity and resemble granulocyte, erythrocyte, monocyte/ macrophage, megakaryocyte colony-forming units. However 92% of the cells of flat colonies express CD235. It shows that the colonies are erythroid, although colony morphology differs from burstoforming erythroid units and erythroid colony forming units. Their occurrence probability in methylcellulose-containing medium is 2,5%±1%, that is significantly lower than in agar- containing medium (58%±4,8%). Thus, we suggested that flat colonies should be counted separately or they should be ascribed as BFU-E.
Key words: erythroid colonies, colonyforming activity, umbilical cord blood, placenta, mobilized peripheral blood.
Ключевые слова: эритроидные колонии, колониеобразующая активность, пуповинная кровь, плацента, мобилизованная периферическая кровь.
