CC BY
8Ветеринарный врач. 2022. № 6. С. 37 - 43. The Veterinarian. 2022; (6): 37 - 43.
Научная статья
УДК 619:616.98:636.2
DOI: 10.33632/1998-698Х_2022_6_37
Гель-фильтрация продуктов экстракции клеточного дебриса Mycobacterium bovis
Альбина Валерьевна Москвичева1, Анна Равкатовна Валеева2, Анна Борисовна Третьякова3, Марина Олеговна Коровина2, 3, Геворг Гарикович Казарян2
1 Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности», Казань, Россия 2Казанская государственная медицинская академия - филиал ФГБОУ ДПО РМАНПО Минздрава России, Казань
3Казанский (Приволжский) федеральный университет, институт экологии и природопользования, кафедра прикладной экологии, Казань, Россия
Автор, ответственный за переписку: Анна Равкатовна Валеева, anna-valeeva@mail.ru
Аннотация. За последние 30-40 лет было выявлено множество антигенов изM. bovis. Большое количество исследований связано с компонентами клеточной стенки. Целью данной работы являлось выявление спектра серопозитивных антигенов, легко экстрагируемых из дебриса клеток M. bovis. В статье приведены результаты исследования серологической активности продуктов, экстрагированных из клеточного дебриса. Клеточный дебрис получали из тщательно отмытой культуры M. bovis, которую разрушали в гомогенизаторе Fast Prep 24™ (США) с использованием пробирок Blue Lysing Matrix В (США). Экстракцию материала проводили интенсивным встряхиванием клеточного дебриса в 20 мМ Трис-HCl буфере, рН 7,0. Фракционирование полученного материала проводили с использованием Sephadex G-200 superfine на колонке Econo-Column Chromatography Columns, 1,5 x 30 см. Серологическую активность полученных элюатов исследовали в реакции иммуноблотинга. В общей сложности были отобраны 3 элюата, содержащих от 4 до 6 серопозитивных фракций с молекулярными массами в 14 кДа, 15 кДа, 16 кДа, 24 кДа, 33 кДа, 36 кДа и 40 кДа. Таким образом, описанный метод может быть использован для получения серологически активных антигенов в препаративных количествах.
Ключевые слова: M. bovis, антиген, гель-фильтрация, электрофорез, иммуноблоттинг
Gel filtration of extraction products obtained from cell debris Mycobacterium bovis
Albina V. Moskvicheva1, Anna R.Valeeva2, Anna B. Tretyakova3, Marina O. Korovina2,3, Gvorg G. Kazaryan2
'Federal Center for Toxicological, Radiation and Biological safety, Kazan, Russia 22072209@mail.ru 2Russian Medical Academy of Continuous Professional Education of the Ministry of Healthcare of the Russian Federation (Kazan State Medical Academy Branch), Kazan, Russian 3Kazan Federal University, Kazan, Russian
Corresponding author: Anna Rafkatovna Valeeva, anna-valeeva@mail.ru
Abstract. Over the past 30-40 years, many antigens fromM. bovis have been identified. A lot of research relates to the components of the cell wall. The objective of the research was to identify of seropositive antigens easily extracted from the cell debris M. bovis. The article presents the results of research on the serological activity of products extracted from cellular debris. Cellular debris was obtained from a thoroughly washed M. bovis culture, which was destroyed in a FastPrep 24 ™ (USA) homogenizer using vials Blue Lysing Matrix B (USA). Extraction of the material was carried by intense shaking of the cellular debris in a 20mM Tris-HCl buffer, pH 7.0. Fractionation of the obtained material was performed using Sephadex G-200 superfine on an Econo-Column Chromatography Columns,2.5 x 30 cm. Eluates were obtained with serological activity. In total, 3 preparations were selected, which containing from 4 to 6 seropositive fractions with molecular mass of 14 kDa, 15 kDa, 16 kDa, 24 kDa, 33 kDa, 36 kDa and 40 kDa. Thus, the described method can be used to obtain serologically active antigens in preparative quantities.
Keywords: M. bovis, antigen, gel-filtration chromatography, electrophoresis, western blotting
Введение. Использование неочищенных бактериальных препаратов обеспечивают удовлетворительную чувствительность классических серологических тестов. Однако в ИФА тест-системах эти препараты проявляют низкую специфичность из-за большого сходства с антигенами не туберкулезных микобактерий. За последние 30-40 лет было выявлено множество серологически активных антигенов M. bovis. Так, уже в 1994 году была опубликована работа, описывающая исследование гуморального и клеточного иммунного ответа КРС на очищенные антигены M. bovis с молекулярными массами в 12 кДа, 19 кДа, 22а кДа, 22б кДа, 24 кДа, 25 кДа, 30 кДа, 32 кДа, 39 кДа, 65 кДа и 70 кДа [3]. Идентифицированы как серологически активные антигеныM. bovis следующие белки: ESAT-6, 14-kDa белок, MPT-63, MPT-70, MPT51 и MPT32, MPB59, MPB64, MPB70, MPB83, Acrl, PstS-1 [8, 10].
Следует отметить, что большое количество исследований было проведено с антигеном МРВ83. Sridhara A.A. и соавторы зафиксировали, что в отличие от химерного антигена CFP-10/ESAT-6 МРВ83 обладает наибольшей иммуногенностью и вызывает ранний гуморальный ответ [11]. Его исследовали в сочетании с антигеном МРВ70 [14] и химерными белками МРВ70/80 [13], CFP-10/ESAT-6 [9, 10], МРВ70/МРВ83 и CFP10 / ESAT6. [7].
Представляет интерес тот факт, что CFP10, ESAT-6, МРВ70 и МРВ80 являются секреторными растворимыми антигенами. В отличие от них МРВ83 является выделяемым из стенки бактериальной клетки липопротеином [4]. Этот факт и явился побудительным моментом проведения исследования с продуктами, экстрагированными из клеточного дебриса M. bovis.
Цель данной работы заключалась в выявлении спектра серопозитивных антигенов, легко экстрагируемых из клеточного дебриса M. bovis.
Материалы и методы. МикобактерииMycobacterium bovis Bovinus-8 штамм 700201 (ГИСК им. Л. А Тарасевича) выращивали на твердой питательной среде Левенштейна-Йенсена в течение 28-30 дней. Клетки, снятые с питательной среды, суспендировали в 20 мМ Трис-HQ буфера (рН 7,2), отмывали от остатков питательной среды и затем гомогенизировали в стеклянном гомогенизаторе (Standard Round Body Homogeniser, GPE Scientific Ltd) до получения однородной мелкодисперсной суспензии. Суспензию центрифугировали 30 минут при 4500 g. Осадок суспендировали в небольшом объеме 20 мМ Трис HQ буфера, рН 7,2 (составляющим 1/10 от исходного объема). Взвесь клеток наслаивали на ступенчатый градиент плотности сахарозы (от 20 % до б0 %) и разделяли по плавучей плотности при 90000 g в течение 1 часа.
В результате ультрацентрифугирования были получены 3 опалесцирующие зоны. В эксперименте использовали материал наиболее плотной зоны. Полученный материал трижды промывали в физиологическом растворе с последующим центрифугированием для удаления остатков сахарозы.
Полученный осадок ресуспендировали в 20 мМ Трис-HCl буфере, рН 7,0 и вносили в пробирки Blue Lysing Matrix В (MP Biomedicals, США) с шариками из карбида кремния, диаметром 0,1 мм и обрабатывали в течение 45 с при скорости вибрации 6,5 м/с в гомогенизаторе Fast Prep 24™ (MP Biomedicals, США) дважды с интервалом в 5 мин. После обработки пробирки выдерживали 1-3 мин для осаждения частиц карбида кремния и декантированием отбирали надосадочную взвесь разрушенных клеток. Далее 20 мин центрифугировали при 7500 g, отделяли клеточный дебрис, который трёхкратно промывали в 20 мМ Трис-HQ буфере, рН 7,0 путем 5 мин интенсивного встряхивания с последующим осаждением клеточного дебриса центрифугированием.
Фракционирование полученного материала проводили с использованием Sephadex G-200 superfine на колонке Econo-Column Chromatography Columns, 1,5 x 30 см (Bio-Rad). Материал вносили в колонку в объеме, не превышающем 10 % высоты колонки. В качестве элюента использовали 0,1 М Tris-HCl pH 7,0. Элюируемые пробы собирали на коллекторе фракций FRAC 100 (Pharmacia LKB), спектрофотометрический контроль осуществляли при помощи Optical Unit UV-1, запись результатов детектировали на самописце Recorder Rec 102 (Pharmacia LKB), скорость элюции регулировали перистальтическим насосом Peristaltic Pump P-1 (GE Healthcare Bio-Sciences AB). Скорость элюции составляла 125 мкл/мин, объем элюата 2,5 мл.
Состав белков в элюатах определяли аналитическим электрофорезом в 12,5 % полиакриламидном геле (ПААГ) в присутствии 0,1 % додецилсульфата натрия по U. K. Laemmli [6]. Электрофорез элюатов проводили с туберкулином, очищенным (ППД) для млекопитающих (БИОК), вакциной туберкулезной (БЦЖ) (Микроген) и маркерами молекулярных масс SDS-PAGE Standards broad range (Bio-Rad) и PageRuler Broad Range Unstained Protein Ladder (Thermo Scientifiic). ПААГ фиксировали в водном растворе, содержащем 40 % этанола и 7 % уксусной кислоты, и окрашивали азотнокислым серебром по Э. И. Гребиножко [1].
Перенос фракционированных в ПААГ белков на нитроцеллюлозную мембрану (НЦМ) осуществляли по Н. Towbin [12]. Серологическую активность определяли в реакции иммуноблотинга c использованием гипериммунной сыворотки крови кроликов против M. bovis, а также положительной на туберкулез сыворотки крупного рогатого скота [5].
Полученные результаты документировали на приборе Gel Doc XR+ (Bio-Rad), и обрабатывали с использованием программы Image Lab Softwaer 5.1 (Bio-Rad).
Результаты исследования. Из клеточного дебриса после гомогенизации и трехкратной промывки были получены 3 супернатанта, которые далее исследовали электрофорезом в 12,5 % ПААГ. Электрофоретический спектр экстрагированного материала представлен на рисунке 1. Молекулярная масса анализируемого материала локализовалась в диапазоне от 6,5 кДа до 100 кДа. Большинство белковых фракций было выявлено в области молекулярных масс от 70 кДа и ниже. Это дает основание полагать, что использование метода гель-фильтрации позволит наработать белки с низкими молекулярными массами.
1-3 треки - супернатанты после трехкратной промывки разрушенных клеток; М - маркер молекулярных масс SDS-PAGE Standards broad range (Bio-Rad, США)
Рисунок 1 - Результаты аналитического электрофореза экстрактов, полученных из клеточного дебриса M. bovis в 12,5 % ПААГ, окрашивание азотнокислым серебром по Э. И. Гребиножко
номера фракции
По оси абсцисс номера фракций, по оси ординат - оптическая плотность при длине волны
280 нм
Рисунок 2 - Результаты фракционирования материала, экстрагированного из клеточного дебриса, методом гель-фильтрационной хроматографии с использованием матрицы Sephadex G-200 superfine
Анализ результатов электрофореза показал, что полученный материал состоял практически из идентичных фракций. Это позволило объединить супернатанты и сконцентрировать их путем лиофилизации. Далее лиофилизат растворили в 0,05М Трис- НС1 буфере (рН 7,0-7,2) с учетом
первоначального объема 1/10 и фракционировали с помощью гель-фильтрационной хроматографии (рисунок 2).
Серологическую активность элюантов исследовали методом иммуноблоттинга с использованием гипериммунной сыворотки кролика, полученной против интактных клеток M. bovis (рисунок 3). Большой интерес представляют элюаты 7-9, содержащие 1 мажорную серопозитивную фракцию с молекулярной массой 24 кДа, и элюаты 10-18, которые содержали по 3 серопозитивные фракции с молекулярными массами в 14 кДа, 16 кДа и 24 кДа.
исх. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19
20 21 22 23 24 25 26 27 28 29
Трек 1 - исходный препарат; цифрами обозначены порядковые номера элюатов
Рисунок 3 - Результаты реакции иммуноблоттинга 29 элюатов, полученных методом гель-фильтрационной хроматографии на матрице Sephadex G-200 superfine с гипериммунной сывороткой крови кроликов против M. Bovis.
Элюаты, имеющие сходные спектры, были объединены в 6 групп следующим образом: препарат № 1 содержал элюаты с 1 по 5; № 2 - элюаты 6-10; № 3 - элюаты 11-14; № 4 - элюаты 15-18; № 5 - элюаты 19-23, № 6 - элюаты 24-29. Указанные препараты были также исследованы методом иммуноблоттинга. При этом один и тот же набор препаратов одновременно фракционировали в двух пластинах ПААГ, материал с которых был перенесен на НЦМ. Материал одной НЦМ исследовали с использованием гипериммунной кролика против M. bovis, другой - с использованием положительной на туберкулез сыворотки КРС. На обеих нитроцеллюлозных мембранах в качестве контролей присутствовали антиген коммерческого препарата туберкулина и полный клеточный лизат вакцинного штамма БЦЖ.
Треки: 1 - исходный материал; 2 - препарат № 1; 3 - препарат № 2; 4 - препарат № 3; 5 -препарат № 4; 6 - препарат № 5; 7 - препарат № 6; 7 - туберкулин очищенный (ППД) для млекопитающих (БИОК); 8 - полный клеточный лизат вакцины туберкулезной (БЦЖ) (Микроген); М - маркер молекулярных масс PageRuler Broad Range Unstained Protein Ladder (Thermo Scientifiic)
Рисунок 4 - Результаты реакции иммуноблоттинга объединенных элюатов: А и Б иммуноблоты с гипериммунной сывороткой крови кролика против M. bovis и положительной на туберкулез сывороткой КРС
На рисунке 4 (А) видно, что представляют интерес препараты под № 2, № 3, № 4 и № 5. Препарат № 2 содержит 6 фракций, отличающихся по молекулярной массе. Препараты № 3 и № 4 содержат 4 мажорные фракции. Препарат № 5 - 1 мажорную фракцию. Эти препараты предполагается использовать как исходные для дальнейшей очистки, определения свойств и возможности использования в диагностических и терапевтических целях.
На рисунке 4 (Б) видно, что сыворотка КРС прореагировала с антигенами препарата № 1 с молекулярными массами: 24 кДа, 33 кДа, 36 кДа и 40 кДа. Следует отметить, что данный препарат требует дальнейшей очистки. Представляет интерес то, что исходный экстракт клеточного дебриса содержит практически тот же набор серопозитивных фракций, который присутствует в полном клеточном лизате БЦЖ. Отсутствие серопозитивных фракций с антигенами, содержащимися в препаратах № 2, № 3 и № 4, активно прореагировавших с сывороткой кролика, свидетельствует, вероятно, о том, что наборы иммунодоминантных антигенов M. bovis для иммунных систем КРС и кроликов различаются, а также это связано с реактивностью иммунной системы КРС.
Заключение. В результате выполненных экспериментов установлено, что использование гомогенизатора Fast Prep, пробирок Blue Lysing Matrix В и 20 мМ Трис-HCl буфера (рН 7,0) с последующей гель-фильтрацией на матрице Sephadex G-200 superfine позволяет из клеточного дебриса экстрагировать материал в препаративных количествах, содержащих от 4 до 6 серопозитивных антигенов с молекулярными массами в 14 кДа, 15 кДа, 16 кДа, 24 кДа, 33 кДа, 36 кДа и 40 кДа.
Полученные результаты согласуются с данными зарубежных исследователей, отмечающих, что микобактериальные антигены, имеющие относительно небольшие молекулярные массы, представляют диагностическую ценность [2]. Кроме того, следует отметить что полученные препараты с молекулярной массой 15 кДа соответствуют антигену, полученному из M. bovis MPB 70, а 24 кДа -MPB 80. MPB70 и MPB80 (MPB70/80) и MPB83 являются близкородственными антигенами, которые экспрессируются M. bovis [13]. Линейные эпитопы MPB70 - 15 кДа являются основными антигенами и представляют интерес при получении гипериммунных сывороток против M. bovis.
Литература
1. Гребиножко, Э. И. Простой метод обнаружения белков в полиакриламидном геле с помощью импрегнации их серебром / Э. И. Гребиножко, А. И. Николаенко, Ф. П. Иванов // Укр. биохим. журнал. - 1986. - Т. 58, № 5. С. 62-65.
2. Bayesian analysis to evaluate tests for the detection of Mycobacterium bovis infection in free-ranging wild bison (bison athabascae) in the absence of a gold standard / N. Chapinal, B. A. Schumaker, D. O. Joly [et al.] // J. Wildl Dis. - 2015. - Vol. 51 - Р. 619-625. - URL: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/25973619/. - Дата публикации: 14.05.2015.
3. Cellular end Humoral Immune Responses of Cattle to Purified Mycobacterium bovis Antigen. Scand / T. Fifis, L. A. Corner, J. S. Rorhel, P. R. Wood // J. Immunol. - 1994. - Vol. 39. - P 267-74. - URL: http:// pubmed.ncbi.nlm.nih.gov>8128186/. - Дата публикации: 04.03.1994.
4. Diversity of antigen recognition by serum antibodies in experimental bovine tuberculosis / K. P. Lyashchenko, J. M. Pollock, R. Colangeli, M. L Gennaro // Infect. Immun. - 1998. - Vol. 66. - P. 53445349. - URL: http:// pubmed.ncbi.nlm.nih.gov>9784542/. - Дата публикации: 17.11.1998.
5. Extraction and serological properties of Mycobacterium cell surface and excreted proteins / K. S. Khaertynov, A. R Valeeva, A. V. Ivanov [et al.] // BioNanoScience. - 2018. - Vol. 8, № 1. - P. 459-466. - doi.org/10.1007/s12668-017-0492-1. - URL: http:// kpfu.ru>staff files...Khaertynov Extraction...2018.pdf. - Дата публикации: 19.12.2017.
6. Laemmli, U. K. Cleavage structural proteins during the assembly of the bacteriophage T4 / U. K. Laemmli // Nature. - 1970. - Vol. 227. - P. 680-685. - URL: http:// pubmed.ncbi.nlm.nih.gov>5432063/. - Дата публикации: 14.08.1970.
7. Lyashchenko, K. P. Differential antigen recognition by serum antibodies from three bovid hosts of Mycobacterium bovis infection. / K. P. Lyashchenko, A. A. Sridhara, A. Johnathan-Lee [et al.] // Comp. Immunol. Microbiol. Infect. Dis. - 2020. - 69: 101424. - Doi: 10.1016/j.cimid.2020.101424. - URL: http:// pubmed.ncbi.nlm.nih.gov>31972498/. - Дата публикации: 17.01.2020.
8. Mc Nair, J. Characterizatio of the Early Antibody Response in Bovin Tuberculosis: MPB83 is an Early Target with Diagnosyic Potential / J. Mc Nair, D. M. Corbett, R. M. Girvin [et al.] // Scand. J. Immunol.
- 2001. - Vol. 53. - P. 365-371. - URL: http:// pubmed.ncbi.nlm.nih.gov> 11285116 /. - Дата публикации: 04.04.2001.
9. Miller, M. A. Serological reactivity to MPB83 and CFO/ESAT-6 antigens in three suid hosts of Mycobacterium bovis infection. / M. A. Miller, C. Gostazar, E. O. Roos et al. // Vet. Microbiol. - 2019 - 235: P. 285-288. - URL: http:// pubmed.ncbi.nlm.nih.gov>31383314/. - Дата публикации: 09.08.2019.
10. Rapid detection of serum antibody by dual-path platform VetTB assay in white-tailed deer infected with Mycobacterium bovis / K. P. Lyashchenko, R. Greenwald, J. Esfandiari // Clin. Vaccine Immunol. - 2013. - Vol. 20. - P 907-911. - URL: http:// pubmed.ncbi.nlm.nih.gov>23595504/. - Дата публикации: 17.04.2013.
11. Sridhara, A. A. Strong antibody responses to Mycobacterium bovis infection in domestic pigs and potential for reliable serodiagnostics. / A. A. Sridhara, A. Johnathan-Lee, R. Elahi [et al.] // Vet Immunol and Immunopathol. - 2021. - 231: 110161. - URL: http:// pubmed.ncbi.nlm.nih.gov>33276278/. - Дата публикации: 19.11.2020.
12. Towbin H. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: Procedure and some applications. / H. Towbin, T. Staehelint, J. Gordon // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 1979.
- Vol. 76, No 9. - P. 4350-4354. - URL: http:// pubmed.ncbi.nlm.nih.gov>388439/. - Дата публикации: 12.09.1979.
13. Wiker, H. G. Immuochemical characterization of the MPB70/MPB80 andMPB83 protein pf Mycobacterium bovis / H. G. Wiker, K. P. Lyashchenko, A. M. Aksoy et al. // Infect. Immun. - 1998. - Vol. 66. - P.1445-1452. - URL: http:// pubmed.ncbi.nlm.nih.gov>9529066/. - Дата публикации: 29.04.1998.
14. Wiker, H. G. MPB70 and MPB83 - major antigens of Mycobacterium bovis. // Scand. J. Immun.
- 2009. - Vol. 69 (6) - P. 492-499. - URL: http:// pubmed.ncbi.nlm.nih.gov>19439009/. - Дата публикации: 08.06.2009.
References
1. Grebinozhko, E. I. A simple method of protein determination in polyacrylamide gel using silver staining / E. I. Grebinozhko, A. N. Nikolaenko, A. P. Ivanov // Ukrainskii biokhimicheskii zhurnal. - 1986. -Vol. 58, No 5. - P. 62-65.
2. Bayesian analysis to evaluate tests for the detection of Mycobacterium bovis infection in free-ranging wild bison (bison athabascae) in the absence of a gold standard / N. Chapinal, B. A. Schumaker, D. O. Joly [et al.] // J. Wildl Dis. - 2015. - Vol. 51 - Р. 619-625. - URL: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/25973619/. - Published: 14.05.2015.
3. Cellular end Humoral Immune Responses of Cattle to Purified Mycobacterium bovis Antigen. Scand / T. Fifis, L. A. Corner, J. S. Rorhel, P. R. Wood // J. Immunol. - 1994. - Vol. 39. - P 267-74. - URL: http:// pubmed.ncbi.nlm.nih.gov>8128186/. - Published: 04.03.1994.
4. Diversity of antigen recognition by serum antibodies in experimental bovine tuberculosis / K. P. Lyashchenko, J. M. Pollock, R. Colangeli, M. L Gennaro // Infect. Immun. - 1998. - Vol. 66. - P. 53445349. - URL: http:// pubmed.ncbi.nlm.nih.gov>9784542/. - Published: 17.11.1998.
5. Extraction and serological properties of Mycobacterium cell surface and excreted proteins / K. S. Khaertynov, A. R. Valeeva, A. V. Ivanov [et al.] // BioNanoScience. - 2018. - Vol. 8, No 1. - P. 459-466. - doi.org/10.1007/s12668-017-0492-1. - URL: http:// kpfu.ru>staff files...Khaertvnov Extraction...2018.pdf. - Published: 19.12.2017.
6. Laemmli, U. K. Cleavage structural proteins during the assembly of the bacteriophage T4 / U. K. Laemmli // Nature. - 1970. - Vol. 227. - P. 680-685. - URL: http:// pubmed.ncbi.nlm.nih.gov>5432063/. -Published: 14.08.1970.
7. Lyashchenko, K. P. Differential antigen recognition by serum antibodies from three bovid hosts of Mycobacterium bovis infection. / K. P. Lyashchenko, A. A. Sridhara, A. Johnathan-Lee [et al.] // Comp. Immunol. Microbiol. Infect. Dis. - 2020. - 69: 101424. - Doi: 10.1016/j.cimid.2020.101424. - URL: http:// pubmed.ncbi.nlm.nih.gov>31972498/. - Published: 17.01.2020.
8. Mc Nair, J. Characterizatio of the Early Antibody Response in Bovin Tuberculosis: MPB83 is an Early Target with Diagnosyic Potential / J. Mc Nair, D. M. Corbett, R. M. Girvin [et al.] // Scand. J. Immunol.
- 2001. - Vol. 53. - P. 365-371. - URL: http:// pubmed.ncbi.nlm.nih.gov> 11285116 /. - Published: 04.04.2001.
9. Miller, M. A. Serological reactivity to MPB83 and CFO/ESAT-6 antigens in three suid hosts of Mycobacterium bovis infection. / M. A. Miller, C. Gostazar, E. O. Roos et al. // Vet. Microbiol. - 2019 - 235: P. 285-288. - URL: http:// pubmed.ncbi.nlm.nih.gov>31383314/. - Published: 09.08.2019.
10. Rapid detection of serum antibody by dual-path platform VetTB assay in white-tailed deer infected with Mycobacterium bovis / K. P. Lyashchenko, R. Greenwald, J. Esfandiari // Clin. Vaccine Immunol. - 2013. - Vol. 20. - P 907-911. - URL: http:// pubmed.ncbi.nlm.nih.gov>23595504/. - Published: 17.04.2013.
11. Sridhara, A. A. Strong antibody responses to Mycobacterium bovis infection in domestic pigs and potential for reliable serodiagnostics. / A. A. Sridhara, A. Johnathan-Lee, R. Elahi [et al.] // Vet Immunol and Immunopathol. - 2021. - 231: 110161. - URL: http:// pubmed.ncbi.nlm.nih.gov>33276278/. - Published: 19.11.2020.
12. Towbin H. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: Procedure and some applications. / H. Towbin, T. Staehelint, J. Gordon // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 1979.
- Vol. 76, N 9. - P. 4350-4354. - URL: http:// pubmed.ncbi.nlm.nih.gov>388439/. - Published: 12.09.1979.
13. Wiker, H. G. Immuochemical characterization of the MPB70/MPB80 andMPB83 protein pf Mycobacterium bovis / H. G. Wiker, K. P. Lyashchenko, A. M. Aksoy et al. // Infect. Immun. - 1998. - Vol. 66. - P.1445-1452. - URL: http:// pubmed.ncbi.nlm.nih.gov>9529066/. - Published: 29.04.1998.
14. Wiker, H. G. MPB70 and MPB83 - major antigens of Mycobacterium bovis. // Scand. J. Immun.
- 2009. - Vol. 69 (6) - P. 492-499. - URL: http:// pubmed.ncbi.nlm.nih.gov>19439009/. - Published: 08.06.2009.
Вклад авторов:
Москвичева А. В. - проведение исследований, анализ полученных результатов, написание исходного текста.
Валеева А. Р. - составление концепции исследования, статистический анализ полученных результатов. Третьякова А. Б. - научное редактирование текста, участие в проведении исследований. Коровина М. О. - участие в проведении исследований, редактирование графического материала. Казарян Г. Г. - инструментальное измерение результатов и их анализ. Все авторы сделали эквивалентный вклад в подготовку публикации. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Contribution of the authors:
Moskvicheva A. V. - conducting research, analyzing the results obtained, writing the source text.
Valeeva A. R. - preparation of the research concept, statistical analysis of the results obtained.
Tretyakova A. B. - scientific editing of the text, participation in research.
Korovina M. O. - participation in research, editing of graphic material.
Kazaryan G. G. - instrumental measurement of results and their analysis.
Contribution of the authors: the authors contributed equally to this article.
The authors declare no conflicts of interests.
© Москвичева А. В., Валеева А. Р., Третьякова А. Б., Коровина М. О., Казарян Г. Г. 2022
