CC BY
7
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
%
УДК 614.72:547.412.133 + 616.153.412.133]-074:543.544.25
ГАЗОВОХРОМАТОГРАФИЧЕСКОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЧЕТЫРЕХХЛОРИСТОГО УГЛЕРОДА В ВОЗДУХЕ И В КРОВИ
С. Ф. Я воровская, Н. Б. Губана
Институт гигиены труда и профзаболеваний АМН СССР, Москва
Метод газовой хроматографии благодаря своей высокой чувствительности и избирательности находит применение во всех областях химического анализа, в частности при определении газов и летучих органических соединений в биологических жидкостях — крови и моче.
Первые зарубежные работы, посвященные этому вопросу, появились в 1960 г. Томсон (SWR RI pegs trace compounds in body fluids) с помощью катарометра и ионизационного детектора определял в крови и в моче человека целый ряд токсических веществ: ацетон, ацетальдегид, метанол, фуран, ацетонитрил, диацетил и др. Анализировались пробы, полученные выдуванием летучих веществ и их последующим конденсированием в охлаждаемых ловушках. Определение тиоэфиров было использовано для диагностических целей.
Подготовку проб для анализа производят по разному: 1) анализируют пробы крови с добавленным антисвертывателем; 2) анализируют растворы, получаемые в результате экстрагирования исследуемых веществ из крови неполярным растворителем, в основном н-гептаном; 3) анализируют газ над исследуемой кровью.
Прямой ввод проб крови применяли Lowe и Beckham [2]. Исследуемую кровь отбирали в гепаринизированные шприцы или капилляры. Анализы выполняли немедленно или после хранения в холодильнике.
Извлечение анализируемых веществ из крови н-гептаном применяли Butler и Freeman. Приготовление гептановой вытяжки производилось в * пробирке с притертой пробкой. В пробирку вносили 2 мл н-гептана, анти-свертыватель и 3—4 стеклянных шарика. Затем приливали 2 мл свежей крови и осторожно путем постукивания перемешивали. Таким образом извлекали из крови до 95% летучего компонента.
Отбор проб газа над поверхностью его раствора называется «head space» (техникой переднего фронта). Это методика основана на предположении, что
установилось равновесие фаз.
В связи с этим, применив еще и технику высаливания, Керри (цит. Butler и Freeman) предложил следующий вариант определения летучих веществ в крови: 1 мл крови через силиконовую диафрагму вводят в пробирку с 1 г К2С03, встряхивают и отбирают для анализа пробу газа над жидкостью.
Отечественных работ, посвященных газовой хроматографии токсических летучих веществ в биологических жидкостях, пока опубликовано мало. В. Ф. Пономарев определял в крови и в моче алифатические спирты Сг — С3. Пробы крови вводились шприцем в испаритель, в котором находилась сетка из нержавеющей стали либо комочек из стальной проволоки или из стеклянной ваты. Анализы выполнялись на 2 последовательно соединенных колонках. В первой колонке (неподвижная фаза, глицерин) задерживалась вода, во второй клонке (неподвижная фаза, полиэтиленгликоль) разделялась
смесь спиртов.
Вопросом изучения распределения некоторых летучих промышленных ядов в организме крыс занимался Б. Б. Шугаев, который проводил исследования с алифатическими углеводородами: бутаном, дивинилом, изопреном, изобутиленом и гексенами. Применялся хроматограф с пламенно-ионизационным детектором. Колонка заполнялась твердым носителем ИНЗ-600, обработанным эфиром триэтиленгликоля и масляной кислоты. Анализировались эфирные, бензольные и изооктановые экстракты.
\
-3
С се/, -10 мг
Рис.
1. Хроматограммы и калибровочные графики для определения СС14.
в воздухе; б — в крови; / — воздух; 2 —
СС14.
S
I
s-
i
JlL
/ О
10 14 12 W 4 2
%
Время в минутах
О
Рис. 2. Хроматограммы определения СС14 после удаления сигнала воды.
а —способом насыщения потока газа-носителя парами воды; б— способом «переднего фронта» без высаливания; в — с высаливанием.
Нашей задачей являлось определение четыреххлористого углерода в воздухе и в крови. Эксперименты проводились на газовом хроматографе Хром-2. -
В основном был использован газоадсорбционный метод; сорбентом служил малоактивный носитель сферохром-1 (удельная поверхность — 1,6 м2/г).
Условия работы были следующие: колонка стальная, U-образная, 85x0,6 см; насадка сферохром; детектор водородный пламенно-ионизационный; газ-носитель азот, давление 0,1 ати, скорость 50 мл/мин; скорость водорода 35—40 мл/мин, скорость воздуха 700 мл/мин; температура колонки 80° при анализах проб воздуха и 100° при анализах проб воды и крови; объем проб воздуха 1—5 мм, объем проб крови 10—20 мкл.
\ Пробы воздуха из затравочных камер отбирали в цельностеклянные шприцы емкостью 100 мл и из них путем прокола резиновой заглушки отбирали пробы для анализа малыми медицинскими шприцами. На рис. 1, а изображена хроматограмма пробы воздуха из биокамеры и калибровочная кривая. Определенный минимум CCI 4 составлял 0,01 мг/л х. Количественные расчеты производили по высотам пиков.
При анализах проб крови и водных растворов СС14 мы встретились с рядом трудностей. Несмотря на то что пламенно-ионизационный детектор считается нечувствительным к воде, мы постоянно обнаруживали на хро-матограммах сигнал воды. Изучение литературных источников показало, что суждения о реакции пламенно-ионизационного детектора на пары воды
1 Селективный электронзахватный детектор
на 2—3 порядка.
довольно противоречивы. Например, Foster и Murfin, исследуя водные растворы этанола и бутанола, установили, что вода уменьшает сигнал пламенно-ионизационного детектора на 6—12%, что превышало ошибку анализов. Авторы утверждают, что, хотя*сигнал воды отсутствует, ни один анализ с пламенно-ионизационным детектором не может быть точным, если компонент и вода одновременно входят в детектор.
Cincotta и Feinland, определяя с помощью пламенно-ионизационного детектора кетоны, спирты, этилакрилат в разбавленных водных растворах, получили на хроматограммах вполне измеримые пики воды, причем пики кетонов выходили из разбавленных водных растворов с меньшим размыванием, чем из концентрированных. Авторы объясняют это положительным дезактивирующим действием воды на адсорбционные центры твердого носителя. Опыты показали, что даже многократный ввод проб воды объемом по 6 мкл не снижает точности и чувствительности анализов, не изменяет времени удерживания компонентов и не влияет на продолжительность «жизни» колонки, содержащей в качестве жидкой фазы силиконовую смазку или даже полиэтиленгликоль-400 (ПЭГ-400). При силиконовой смазке вода выходит первой, а на ПЭГ-400 этанол и пропанол выходят раньше пика воды.
И. А. Устиновская и соавт., анализируя разбавленные водные растворы уксусной, пропионовой, масляных и валериановых кислот на смеси твина-80 и изофталевой кислоты, нанесенных на силанизированный xp0M0C0p6W, наблюдали сигналы воды раньше выхода пиков кислот. Разделение было полным, чувствительность анализов составляла 0,05 вес. %, относительная ошибка не превышала 10%.
В нашей работе сигнал^воды мешал определению CCI 4, так как был очень большим и размытым. Поэтому был испробован ряд способов его устранения.
1. Применение осушителей: ангидрона,. безводного К2С03 и молекулярных сит СаА. Осушители в форколонке помещали в термостате хроматографа между испарителем и хроматографической колонкой. Опыты показали, что молекулярные сита сорбируют CCI 4 необратимо. Ангидрон и К2С03 его не задерживают, но после 10—12 определений начинают пропускать пары воды.
2. На отечественном пористом полимере полисорб-1, продутом током азота при 147° в течение 8 часов с целью удаления остаточного изооктана (растворитель), вода выходит очень быстро узким, симметричным пиком, но пик CCI 4 размыт, а время удерживания возросло.
3. Способ насыщения потока газа-носителя парами воды заимствован нами у Лоу и Бекхэма. С помощью метода получены хорошие результаты и он был использован в дальнейшей работе (рис. 2).
Ход анализа следующий. После того как хроматограф войдет на режим, через мембрану в нагретый испаритель вводят 0,5 мл воды. Через 1 час вводят анализируемую водную пробу и продолжают повторные анализы до начинающегося появления сигнала воды. В этом случае опять вводят воду, но уже в количестве 0,3 мл.
4. Применение насадки с полярной неподвижной жидкой фазой, ПЭГ-400, а также комбинирование колонок со сферохромом-1 и с ПЭГ-400 не дало положительных результатов, так как наблюдалось размывание пиков обоих компонентов.
5. Применение техники «переднего фронта» без высаливания и с добавлением безводного К2С03 показало, что этот вариант может быть использован при условии сохранения постоянства давления в сосуде с раствором СС14 (рис. 2, б, в).
Специально поставленная проверка подтвердила, что наличие воды в пробах не влияет на чувствительность определения СС14. Определяемые количества его составляли десятые и целые 10"3 мг.
К другим трудностям следует отнести загрязнение шприца, испарителя и соединительных трубок кровью и содержащимися в ней твердыми примесями. Требовалась частая очистка шприца 3 % перекисью водорода и дистил-лировйнной водой. Ежедневно в конце рабочего дня необходимо было очи-
щать испаритель и соединительную трубку. Перфорированная муфта со стальными стружками, находящаяся в испарителе, плохо задерживала пробы воды объемом даже в несколько микролитров. Нам все же пришлось остановиться на прямом анализе проб крови, так как гексановые вытяжки обусловливали появление на хроматограммах очень больших и размытых пиков гексана. ✓
Затруднение возникло также при отборе проб крови у животных (крысы). При отборе малых разовых проб из хвоста живых животных обнаруживались незначительные количества СС14 (0,5-10~3 л*г/20 мкл) вследствие его улетучивания. Значительно больше (2,2-10~3 мг/20 мкл) было найдено в крови убитого животного, объем которой составлял около 5 мл и испарение СС14 было замедлено. На рис. 1, б приведены хроматограммы крови и калибровочный график. Затравку животных проводили per os и ингаляционнЬ.
Концентрации СС14 в крови составляли около 6 мг/100 мл.
%
Выводы
9
1. Для определения микропримесей токсических веществ в крови и других биосредах рекомендуется применять газовые хроматографы с конструкцией испарителя, обеспечивающей его удобную и быструю очистку.
2. Оптимальными условиями для определения СС14 являются следующие: насадка сферохром-1, температура колонки 80—100°, температура испарителя 150°, газ-носитель азот со скоростью 50 мл/мин, детектор ПИД. Определяемый минимум СС14 в воздухе составляет 0,01 мг/л.
3. Наилучшим способом устранения мешающего влияния основного компонента (воды) при анализах проб крови является насыщение потока газа-носителя водяными парами. Применение осушителей (ангидрона и безводного К2СОа) связано с неудобствами, обусловленными недостаточно продолжительной поглотительной способностью осушителей (10—12 определений при длине слоя осушителя около 20 см).
ЛИТЕРАТУРА
Й % У
Пономарев В. Ф. Одновременное обнаружение алифатических спиртов и определение этилового алкоголя в крови и моче методом газо-жидкостной хроматографии. Дисс. канд. Душанбе, 1967.— Устиновская И. А., ГаврилинаЛ. Я., Малахов В. В. Завод, лабор., 1969, № 5, с. 553.— Шугаев Б. Б. В кн.: Общие вопросы промышленной токсикологии. М., 1967, с. 24.— Butler R.A., Freeman J., Brit. J. Anaesth., 1962, v. 34, p. 440.—С incotta J. J., Feinland R., Analyt., Chem., 1964, v. 36, p. 488.— Foster Y. S., Murfin J.W., Analyst., 1965, v. 90, p. 64.— L о w e H. J., BeckhamM. D., Biomedical Applications of Gas Chromatography. New York, 1964, v. 1, p. 307.—R о n k a i n e n P., Kern Teollisuus, 1969, No. 3, p. 215.— S w R. I., Chem. and Eng. News, 1960, v. 38, p. 36.
Поступила 3/VII 1970 r.
УДК 615.9:621 43.019.13].076:576.3.085.23
%
КУЛЬТУРА КЛЕТОК КАК МОДЕЛЬ ИЗУЧЕНИЯ
ТОКСИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ ВЫХЛОПНЫХ ГАЗОВ АВТОТРАНСПОРТА
Канд. мед. наук Л. 3. Гомелаури, доктор мед. наук В. И. Бахуташвили
Научно-исследовательский институт санитарии и гигиены им. Г. М. Натадзе, Тбилиси
Для оценки воздействия выхлопных газов автотранспорта в последнее время все более широкое распространение получает метод тканевых культур, который с успехом используется при исследовании самых разнообразных вопросов в биологии, вирусологии ит. д. (Robins и Endens, 1950). Появились работы, посвященные изучению влияния на тканевые культуры различных химических соединений. Так, Rounds и соавт. (1962) использовали культуру
