CC BY-ND
52
ЦШШ №12 (261) ЗНиСО
21
g
g
Предельно допустимые концентрации (ПДК) химических веществ в воде водных объектов хозяйственно-питьевого и культурно-бытового водопользования: ГН 2.1.5.1315—03. М.: Российский регистр потенциально опасных химических и биологических веществ Минздрав России. 2003. Зайцева Н.В. и др. Особенности изменений биохимических и гематологических показателей у детей, потребляющих питьевую воду с повышенным содержанием марганца / Н.В. Зайцева, М.А. Землянова, Д.Л. Мазунина //Здоровье населения и среда обитания. 2014. № 2 (251). С. 41—43.
Кулешов Н.П. Современные методы в клинической ци-тогенетике //Современные проблемы в клинической цитогенетике: Учебно-методическое пособие /Под ред. Н.П. Кулешова. М.: Наука. 1991. С. 91—146. Онищенко Г.Г. и др. Анализ риска здоровью в задачах совершенствования санитарно-эпидемиологического надзора в Российской Федерации / Г.Г. Онищенко, А.Ю. Попова, Н.В. Зайцева, И.В. Май, П.З. Шур //Анализ риска здоровью. 2014. № 2. С. 4—13.
Sen. S. Aneuploidy and cancer //Curr. Opinion Oncology. 2000. V. 12. P. 82—88.
Сычева Л.П. Биологическое значение, критерии определения и пределы варьирования полного спектра кариоло-гических показателей при оценке цитогенетического статуса человека //Медицинская генетика. 2007. Т. 6. № 11 (65). C. 3—11.
Флетчер Р. и др. Клиническая эпидемиология. Основы доказательной медицины / Р. Флетчер, С. Флетчер, Э. Вагнер. М.: Медиа Сфера, 1998. 352 с.
Контактная информация:
Землянова Марина Александровна, тел.: 8 (342) 236-39-30, e-mail: [email protected]
Contact information:
Zemlyanova Marina, phone: 8 (342) 236-39-30, e-mail: [email protected],
УДК 543.544.43
ГАЗОХРОМАТОГРАФИЧЕСКОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ВЫСОКОТОКСИЧНЫХ N-НИТРОЗАМИНОВ В МОЧЕ И ИДЕНТИФИКАЦИЯ МЕТОДОМ ХРОМАТО-МАСС-
СПЕКТРОМЕТРИИ
Т.С. Уланова, Т.В. Нурисламова, О.А .Мальцева ФБУН «Федеральный научный центр медико-профилактических технологий управления рисками здоровью населения»г. Пермь
Разработан современный инструментальный метод определения N-нитрозодиметиламина и N-нитрозодиэтиламина в моче. В процессе исследований был выбран и обоснован метод анализа — капиллярная газовая хроматография. Диапазон определяемых концентраций N-нитрозодиметиламина и N-нитрозодиэтиламина в моче составил 0,0095— 0,60 мг/л при погрешности метода 23,5 %. Высокие значения степени извлечения N-нитрозоаминов (99—100 %) из мочи методом анализа равновесной паровой фазы достигнуты при использовании высаливающего реагента сульфата натрия в количестве 16 г. В процессе выполнения идентификации N-нитрозодиметиламина в образце мочи установлены масс-спектр компонента, основной молекулярный ион массой m/z 74, подтверждающий ион массой m/z 42 и структурная формула.
Ключевые слова. N-нитрозодиметиламин, N-нитрозодиэтиламин, капиллярная газовая хроматография, метод парофазного анализа, термоионный детектор, хромато-масс-спектрометрическая идентификация (ХМС), масс-спектр.
T.S. Ulanova, T.V. Nurislamova, O.A. Maltseva □ GAS CHROMATOGRAPHIC DETERMINATION OF HIGHLY TOXIC N-NITROSAMINES IN URINE AND IDENTIFICATION BY GAS CHROMATOGRAPHY-MASS SPECTROMETRY □ Federal scientific center for medical and preventive health risk management technologies, Perm.
Designed modern instrumental methods of determining N-nitro so dimethy lamine and N-nitrosodiethylamine in the urine. The range ofdetermined concentrations ofN-nitrosodimethylamine and N-nitrosodiethylamine in the urine was 0,0095—0,60 mg/1 in the error of 23.5 %. High values of the degree of extraction of N-nitrosamines (99—100 %) of the urine by headspace achieved using sodium sulphate salting out agent in an amount of16g. During identifying N-nitrosodimethylamine in a urine sample mass spectrum component ions characteristic: the main molecular ion mass m /z 74, confirming the mass m /z 42 and the structural formula were detected.
Key words. N-nitrosodimethylamine, N-nitrosodiethylamine, capillary gas chromatography headspace analysis method, a thermionic detector, gas chromatography-mass spectrometric identification (XMC), mass spectrum.
Введение. В современных условиях проблема обеспечения гигиенической безопасности населения и управления медико-экологической ситуацией по своей значимости относится к числу первоочередных задач гигиенической науки и практики [1]. Известно, что техногенная деятельность человека приводит к увеличению загрязнения окружающей среды химическими соединениями, обладающими высокой токсичностью, канцерогенными и мутагенными свойствами. Среди веществ такого типа выделяется большая группа ^нитрозосоединений, из которых высокой кан-
церогенной активностью обладают алифатические ^нитрозоамины [2]. Эти вещества входят в список приоритетных токсикантов, который утвержден Международной организацией по исследованию рака (1АКС) и Агентством по охране окружающей среды (США) [3]. Содержатся ^нитрозосоединения в пищевых и промышленных продуктах, сельскохозяйственных ядохимикатах, лекарствах и др. [4].
Широкое распространение ^нитрозодиме-тиламина и ^нитрозодиэтиламина в окружающей среде и недостаточно изученные особенно-
22
ЗНиСО pm №12 (261)
сти действия на состояние организма, указывают на необходимость в разработке высокочувствительного и селективного метода определения этих соединений в биологических средах (моча). Высокие требования к качеству выполняемых исследований используемых в работах по оценке рисков создают необходимость подтверждения и надежной идентификации определяемых в биосредах контаминантов методом хромато-масс-спектрометрии [5].
Для этого специалистами отдела «химико-аналитических методов исследования» ФБУН «Федеральный научный центр медико-профилактических технологий управления рисками здоровью населения» (г. Пермь) разработан современный инструментальный метод количественного определения N-нитрозаминов (N-нитрозодиметиламин, N-нитрозодиэтиламин) в моче методом капиллярной газовой хроматографии. Компонентный состав подтвержден идентификацией целевых компонентов биосреды методом хромато-масс-спектрометрии.
Материалы и методы. Исследования по разработке метода определения N-нитрозаминов в моче выполнены на основе газохроматографиче-ского анализа равновесной паровой фазы методом капиллярной газовой хроматографии на хроматографе «Кристалл-5000» с термоионным детектором и использованием аналитической колонки серии DB-624-30m*0,32mm*1,8^m. На основании результатов предварительных экспериментальных исследований установлены оптимальные условия хроматографирования: деление потока 1 : 14, температура испарителя 200 °С; газ-носитель: азот, скорость потока 1,4 мл/мин; температура колонки от 50 до 200 °С, скорость программирования 10 °С/мин, температура детектора 320 °С.
Идентификация N -нитрозодиметиламина в образце мочи выполнена методом хромато-масс-спектрометрии (ГХ-МС) на газовом хроматографе с капиллярной колонкой HP-VOC 60 m«0,2 mm'1,12 ^m (длина 60 м и внутренний диаметр 0,2 мм), масс-селективным детектором 5975С и квадрупольным масс-анализатором.
В процессе эксперимента установлены оптимальные условия хромато-масс-спектрометрической идентификации N-нитро-зодиметиламина: масс-спектры, характеристические ионы (m/z = 74,42), время удерживания характеристического молекулярного иона (3,063 мин); режим хроматографа: температуры колонки (начальная температура 50 °С, линейное программирование со скоростью 10 °С/ мин, конечная температура колонки 240 °С). Газ-носитель — гелий, расход = 20 мл/мин, деление потока гелий : воздух 1 : 20. Для получения воспроизводимости масс-спектров ионизацию молекул N-нитрозодиметиламина проводили в газовой фазе методом электронного удара (режим ионизации электронным ударом при 70 эВ). Масс-хроматограмму строили по полному ионному току и по характеристическим ионам N-нитрозодиметиламина (m/z 74,0; 42). Чувствительность метода (LOQ) оценивали путем определения минимальной концентрации N-нитрозаминов в образце мочи с заданной степенью точности, которая характеризуется
предельно допустимой величиной относительного стандартного отклонения не более 20 % от предела количественного определения с достоверностью 80—100 %. Для этого проводили 5? эксперимент по внесению известных количеств ^^ аналитического стандарта N-нитрозаминов в образцы мочи на уровне предела определения в 5 повторениях. Нижний предел количественного ( определения (LOG) N-нитрозодиметиламина и N-нитрозодиэтиламина в газохроматографиче-ском методе в сочетании с анализом равновесной паровой фазы и условий пробоподготовки со- ^ ставил для N-нитрозодиметиламина 0,0018 мг/л, 3 N-нитрозодиэтиламина — 0,00022 мг/л.
Пробоподготовка пробы мочи к анали- s= зу. При отработке способа подготовки пробы мочи к хроматографическому анализу исследованы различные условия процедуры экстракции и подобраны различные условия проведения экстракции с высокими степенями извлечения N-нитрозодиметиламина и N-нитрозодиэтиламина (99—100 %).
В процессе исследований для извлечения N-нитрозоаминов из биологической жидкости (моча) для выбора высаливающего реагента применяли нейтральные соли щелочных и щелочноземельных металлов: Na2SO4, K2HPO4, NaCl, NH4HPO4 и смесь солей хлорида калия, К2НРО, Na2SO4. Прецизионность анализа и эффективность извлечения N-нитрозаминов из мочи устанавливали экспериментально способом «введено—найдено» с применением стандартных растворов. В исследуемый образец мочи в объеме 5 см3 добавляли высаливающий реагент и помещали в замкнутую систему дозатора равновесного пара. После установления фазового равновесия в изотермических условиях газохроматографиче-ским методом измеряли равновесную концентрацию N-нитрозоаминов в газовой фазе над исследуемым образцом мочи.
В процессе экспериментальных исследований установлено, что наибольшая степень извлечения N-нитрозодиметиламина и N-нитрозодиэтиламина из биологической жидкости достигнута с добавлением высаливающего реагента сульфата натрия (m = 16 г) в сочетании с методом анализа равновесной паровой фазы, что позволяет исключить влияние матричного эффекта биосреды и обеспечивает полное извлечение аналитов: для N-нитрозодиметиламина — 99 %, для N-нитрозодиэтиламина — 100 %.
Результаты исследований. Для оценки воздействия биомаркеров экспозиции (N-нитрозаминов) на здоровье были исследованы биосреды (моча) групп детей, проживающих в городах Пермского края, на содержание изучаемых соединений и проходивших лечение в стационаре и поликлинике ФБУН «ФНЦ медико-профилактических технологий управления рисками здоровью населения».
Для сравнительной оценки уровней N-нитрозаминов (N-нитрозодиметиламин и N-нитрозодиэтиламин) в моче обследуемой группы детей использовали содержание токсикантов в моче группы сравнения практически здоровых детей (n = 25), проживающих вне зоны антропогенного влияния.
ЦШШ №12 (261) ЗНиСО
23
Рис. 1. Фрагмент хроматограммы(а) и масс-спектр N-нитрозодиметиламина в образце мочи (б) (характеристические ионы m/z 74, 42)
Рис. 2. Масс-спектрограммы сравнения масс-спектра N-нитрозодиметиламина, содержащегося в образце мочи(а), с библиотечным спектром по характеристическим ионам (m/z 74, 42)(б
В процессе исследований было установлено, что у обследуемых детей, проживающих в зоне экспозиции, количество проб мочи с содержанием N-нитрозодиметиламина составило 36 % при средней концентрации (0,00960 ± 0,00575) (р = 0,002) и с содержанием N-нитрозодиэтиламина — 44 % при средней концентрации (0,00717 ± 0,00439) мкг/см3 (р = 0,003). Установленное количество биопроб с повышенным содержанием N-нитрозодиэтиламина в моче детей группы обследования составило 16 %. Установлены минимальная и максимальная концентрации N-нитрозодиметиламина в моче детей Cmin = 0,018 и Cmax =0,045 мкг/см3 соответственно и N-нитрозодиэтиламина Cmin = 0,0078 и Cmax = 0,033 мкг/см3 соответственно.
При анализе сложных смесей биологической матрицы часто обнаруживаются пики, которые являются результатом наложения компонентов из-за их неполного разделения. В связи с этим идентификация следовых количеств неизвестных органических соединений, входящих в состав многокомпонентных смесей, является одной из наиболее сложных и важных задач при разработке методов определения контаминантов в биологических средах.
Для подтверждения и достоверной идентификации соединений (N-нитрозодиметиламина), определяемых методом капиллярной газовой хроматографии с термоионным детектором, были проведены исследования образцов мочи обследуемой группы детей с использованием метода хромато-масс-спектрометрии (ГХ-МС).
Индивидуальную идентификацию N-нитро-зодиметиламина в образце мочи выполняли по параметрам удерживания (определено по градуировочным растворам) и путем сравнения характеристических ионов масс-спектров N-нитрозодиметиламина с библиотечными масс-спектральными данными. Фрагмент хромато-граммы и масс-спектр N-нитрозодиметиламина,
содержащегося в образце мочи, представлен на рис. 1.
Оценка подобия справочной и исследуемой спектрограмм показала идентичность масс-спектра стандартного образца N-нитрозодиметиламина (верхняя часть рис. 2) и его библиотечного спектра (нижняя часть рисунка). Масс-спектрограммы представлены на рис. 2.
Анализ масс-спектрограммы (рис. 2) показал, что в спектре ионов компонента N-нитро-зодиметиламина присутствуют характеристические ионы: основной молекулярный ион (определен по интенсивности сигнала пика иона) массой m/z 74 и подтверждающий массой m/z 42.
Разработанный метод определения N-нитрозодиметиламина и N-нитрозодиэтиламина в биологической среде (моча) рекомендован для измерения массовых концентраций при выполнении исследований по оценке риска.
ЛИТЕРАТУРА
1. Нитраты, нитриты и N-нитрозосоединения. Женева: Всемирная организация здравоохранения. 1981. 118 с.
2. IARC Monographs on the Evaluation of Carcinogenic Risks for Humans, Lyon, 1987, Suppl. 7. v. 1-42.
3. Montague P. Rachel's Environment & Health Weekly, 1995, № 439
4. Третьяков О.Б. и др. Влияние сырья и материалов на канцерогенные свойства шин / О.Б. Третьяков, М.Е. Ску-датин //Тезисы докладов 1-й Всероссийской конференции по каучуку и резине. Москва 26—28 февраля 2002 г., С. 307—308.
5. Уланова Т.С. и др. Идентификация метил-трет-бути-лового эфира в крови человека хромато-масс-спектрометрическим методом / Т.С. Уланова, Т.В. Нурис-ламова //Анализ риска здоровью. 2014. № 2. С. 76—81.
Контактная информация:
Нурисламова Татьяна Валентиновна, тел.: (342) 233-10-37, e-mail: [email protected] Contact information:
Nurislamova Tatiana, phone: (342) 233-10-37, e-mail: [email protected]
