CC BY
35
ПРОФИЛАКТИЧЕСКАЯ МЕДИЦИНА
УДК 543.544.546.299
О.М. Журба, А.Н. Алексеенко
ГАЗОХРОМАТОГРАФИЧЕСКОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ СОДЕРЖАНИЯ ТИОДИГЛИКОЛЕВОЙ КИСЛОТЫ В МОЧЕ У РАБОТНИКОВ ПРОИЗВОДСТВА ПОЛИВИНИЛХЛОРИДА
Ангарский филиал ФГБУ «ВСНЦ ЭЧ» СО РАМН - НИИ медицины труда и экологии человека (Ангарск)
Разработана и аттестована методика определения тиодигликолевой кислоты в моче методом газожидкостной хроматографии, на капиллярной колонке HP-5 с пламенно-ионизационным, детектированием. Выбраны, оптимальные условия хроматографирования; оптимизированы, условия пробоподготовки путём, использования химической дериватизации метанолом, с последующей жидкостно-жидкостной микроэкстракцией; проведены, метрологические исследования. В работе использовали, газовый хроматограф Agilent 7890A с пламенно-ионизационным, детектором. (ПИД), снабжённым, автодозатором. Agilent 7693, позволяющим, регулировать глубину погружения иглы хроматографического шприца в виалу. Управление работой хроматографа и автодозатора, а также сбор и обработка хроматограмм осуществляется программой GC ChemStation. Для. приготовления, модельных растворов и. подготовки, проб применяли следующие реактивы, и. материалы: тиодигликолевая кислота (98 %, Aldrich), диметиловый эфир ТДГК, этилацетат (о.с.ч.), метанол (о.с.ч.), серная кислота (х.ч.), сульфат натрия. (х.ч.), вода дистиллированная, образцы мочи, которые не содержат. ТДГК. Подготовка пробы, включает, дериватизацию метанолом, в присутствии, серной кислоты, жидкость-жидкостную микроэкстракцию диметилового эфира ТДГК этилацетатом и центрифугирование. Идентификацию на хроматограмме диметилового эфира ТДГК проводили, по абсолютному времени удерживания, которое в свою очередь контролировали сравнением и наложением, полученных хроматограмм, с двумя хроматограммами модельных смесей ТДГК в моче разной концентрации, а также с хроматограммой, модельной смеси, диметилового эфира ТДГК в этилацетате. Получение градуировочной, характеристики, проводили, по пяти модельным растворам ТДГК в воде. Диапазон определяемых концентраций, в моче 0,4—90 мкг/см3, внутрилабораторная прецизионность Sr 0,065, точность (P = 0,95) 15 %. Изучено содержание тиодигликолевой. кислоты, у работников основных цехов производства поливинилхлорида. Установлено, что содержание данного метаболита зависит от. длительности, и. дозы, воздействия. Наибольшие значения, концентраций. ТДГК в моче характерны работникам, цеха по получению винилхлорида из 1,2-дихлорэтана.
Ключевые слова: винилхлорид, производство поливинилхлорида, тиодигликолевая кислота в моче, газожидкостная хроматография
GAS CHROMATOGRAPHIC DETERMINATION OF THIODIGLYCOLIC ACID CONTENTS IN URINE OF POLYVINYL CHLORIDE PRODUCTION WORKERS
O.M. Zhurba, A.N. Alexeenko Institute of Occupational Health & Human Ecology ESSC HE SB RAMS, Angarsk
The method, of determination of the thiodiglycolic acid. (TDGA) in urine using gas-liquid, chromatography on the capillary column HP-5 with the flame ionization detection was developed, and. certified. Optimal conditions for chromatography were chosen: the conditions for preparing the samples with use of chemical derivatization by methanol followed, by the liquid. — liquid, microextraction were optimized; the metrological studies were performed. We used gas chromatograph AGILENT 7890A with flame-ionization detector (FID) equipped, with autosampler AGILENT 7693 which allows to regulate the depth of chromatographis springe needle immersion into the vial. The control of the chromatograph and the autosampler functions as well as the collection, and. processing of the chromatograms are realized, by the software programme GC ChemStation. Following reagents and. materials were used, to prepare the samples and. model solutions: thiodiglycolic acid. (TDGA) (98 % Aldrich), dimethyl ether of TDGA, ethyl acetate (extra pure), methanol (e.p.), sulfuric acid, (chemically pure), natrium, sulfate (chemically pure), distilled, water, urine samples free of TDGA. Preparation, of the sample includes derivatization. with methanol in the presence of sulfuric acid, as well as the liquid-liquid, microextraction of the TDGA dimethyl ether with ethyl acetate and. centrifuging. The identification, of TDGA dimethyl ether on the chromatogram, was realized, with use of absolute time of retaining that was controlled by the comparison, and. imposing of received, chromatograms with two chromatograms of model TDGA mixtures in the urine of different concentrations as well as with the chromatogram, of model mixture of TDGA dimethyl ether in ethyl acetate. The calibration, curve was received, with use of five model TDGA solutions in water. The range of the concentrations determined, in the urine was 0,4-90 ig/cm3, the interalaboratory precision S was 0,065 and. the accuracy (P = 0.95) was 15 %. The thiodiglycolic acid, contents was studied in the employees of the main departments of the polyvinyl chloride production. It was found that content of this metabolite may depend, on the duration and. the dose of exposure. The highest concentrations of TDGA in the urine are typical for the departments of production, of vinyl chloride from 1,2-dichloroethane.
Key words: vinyl chloride, industry of polyvinyl chloride, thiodiglycolic acid in urine, gas-liquid chromatography
Крупным производителем поливинилхлорида (ПВХ) в России является ОАО «Саянскхимпласт», который обеспечивает до 40 % общего объёма его выработки, и входит в число 200 крупнейших компаний страны. Винилхлорид является одним из основных хлорорганических соединений в воздухе рабочей зоны производства ПВХ и характеризуется преобладанием поражения нервной системы и паренхиматозных органов, гемодинамическими расстройствами, канцерогенезом [1, 2, 3].
Наиболее распространённая характеристика производственной среды, как правило, даётся путём измерения концентраций веществ в воздухе рабочей зоны. Однако определение химических соединений в воздухе рабочей зоне показывает их концентрации только в конкретное время и на конкретном месте. Более точная информация получается при постоянной регистрации концентраций в воздухе или при использовании индивидуальной дозиметрии. Однако эти методы не дают исчерпывающего представления о количестве токсического вещества, абсорбированного в организм экспонированных лиц, особенно в тех случаях, когда существует возможность поступления вещества другими путями (кожный, оральный). Указанный недостаток можно корректировать применением экспозиционных тестов, а именно определением содержания метаболитов токсичных веществ в биологических матрицах (в моче) человека [4].
Одним из конечных метаболитов винилхлорида в процессе его биотрансформации в организме является тиодигликолевая кислота (ТДГК). Доказано, что именно ТДГК является биомаркёром воздействия винилхлорида, так как данный токсикант вызывает экскрецию тиодигликолевой кислоты в мочу, которая у животных составляет 50 % от всех метаболитов [5].
Одним из перспективных методов определения метаболитов токсичных органических соединений является газожидкостная хроматография (ГЖХ), которая применяется в качестве базового метода в большинстве лабораторий, специализирующихся в области аналитической токсикологии. Газохроматографическое определение ТДГК, содержащей в своей молекуле две карбоксильные группы с активными атомами водорода, требует обязательной дериватизации, т.е. получения её летучих производных. Отечественные работы по определению ТДГК в моче отсутствуют. Зарубежные методики определения ТДГК в моче обладают следующими недостатками: использование в качестве дери-ватизирующего реагента очень канцерогенного и взрывоопасного диазометана; низкие степени извлечения в процессе пробоподготовки, что в свою очередь сказывается на чувствительности определения ТДГК, большие расходы особо чистых органических растворителей [6, 7, 8, 9].
Цель работы заключалась в разработке новой газохроматографической методики определения ТДГК в моче с пламенно-ионизационным детектированием. В ходе исследования решены следующие задачи: выбраны оптимальные условия
хроматографирования; оптимизированы условия пробоподготовки путём использования химической дериватизации метанолом с последующей жидкостно-жидкостной микроэкстракцией; проведены метрологические исследования; изучены содержания тиодигликолевой кислоты в моче у работников производства поливинилхлорида.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В работе использовали газовый хроматограф Agilent 7890A с пламенно-ионизационным детектором (ПИД), снабжённым автодозатором Agilent 7693, позволяющим регулировать глубину погружения иглы хроматографического шприца в виалу. Управление работой хроматографа и автодозатора, а также сбор и обработка хроматограмм осуществляется программой GC ChemStation. Для приготовления модельных растворов и подготовки проб применяли следующие реактивы и материалы: тиодигликолевая кислота (98 %, Aldrich), диме-тиловый эфир ТДГК, этилацетат (о.с.ч.), метанол (о.с.ч.), серная кислота (х.ч.), сульфат натрия (х.ч.), вода дистиллированная, образцы мочи, которые не содержат ТДГК.
В стеклянную виалу объемом 1,5 см3 помещали
0,1 см3 образца, 0,02 см3 концентрированной серной кислоты, 0,1 см3 метанола. Закрыв пластмассовой завинчивающейся крышкой с септой, выдерживали в термостате при 80 °С. По истечении 15 мин виалу вынимали из термостата, охлаждали до комнатной температуры, добавляли 0,5 см3 этилацетата и 0,9 см3 водного раствора сульфата натрия. Затем проводили встряхивание на мульти-вортексе в течение 5 мин с последующим центрифугированием при 3000 об./мин в течение 5 мин. После разделения фаз виалу помещали в автодозатор, который отбирал 2 мкл верхнего слоя из органической фазы и вводил в испаритель газового хроматографа. Перенос образца с испарителя в колонку осуществляли в режиме «splitless», а хроматографирование — в режиме температурного программирования (табл. 1). Идентификацию на хроматограмме диметилового эфира ТДГК проводили по абсолютному времени удерживания, которое в свою очередь контролировали сравнением и наложением полученных хроматограмм с двумя хроматограммами модельных смесей ТДГК в моче разной концентрации, а также с хроматограммой модельной смеси диметилового эфира ТДГК в этилацетате. Получение градуировочной характеристики проводили по пяти модельным растворам ТДГК в воде в диапазоне 0,4 — 90,0 мкг/см3.
Результаты исследований представлены в виде медианы (Ме), верхнего и нижнего квартилей (Q25 — Q75), нормальность распределения признаков определяли с помощью теста Шапиро — Уилка с использованием пакета прикладных программ «Statistica 5.5».
Исследования выполнены с информированного согласия обследуемых лиц и соответствуют этическим нормам Хельсинской декларации, требованиям приказа МЗ РФ № 266 от 19.06.2003 г.
Таблица 1
Условия газохроматографического анализа для определения ТДГК
Условия Значения
Колонка НР-5 30 м х 320 мкм, толщина фазы 0,25 мкм
Газ-носитель Азот, 2 см3/мин
Температурный режим термостата колонок Программирование, 80 °С с выдержкой 1 мин, подъём со скоростью 5 °С/мин до 130 °С
Кондиционирование колонки после анализа Температура термостата колонки 240 °С в течение 6 мин, объёмная скорость потока газа-носителя через колонку 4 см3/мин
Температура инъекционного порта 250 °С
Режим переноса образца в колонку Splitless 0,3 мин, 40 см3/мин
Режим пламенно-ионизационного детектора 300 °С, скорость потока водорода 30 см3/мин, воздуха - 250 см3/мин, поддува азота - 25 см3/мин
сигнал ПИД
Рис. 1. Хроматограммы смеси диметилового эфира ТДГК в этилацетате на двух капиллярных колонках.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Выбор оптимальных условий хроматографирования осуществляли на стандартной смеси диметилового эфира ТДГК в этилацетате на двух капиллярных колонках разной длины и полярности. Установлено, что именно в условиях градиента температуры и в режиме введения образца в колонку «splitless» достигаются оптимальные разделение компонентов смеси и чувствительность определения (рис. 1).
При сравнении хроматографических параметров, полученных на колонках НР-5 и DB-624, видно, что максимальные коэффициент удерживания,
эффективность, минимальные ширина пика на полувысоте и ВЭТТ достигаются на колонке DB-624 (табл. 2). Но при этом продолжительность анализа на колонке НР-5 в 1,6 раз меньше продолжительности анализа на колонке DB-624.
Высокая эффективность колонки DB-624 и большое время анализа объясняются её длиной и толщиной плёнки НЖФ, превышающими длину колонки НР-5 в 2 раза и толщину плёнки НЖФ в 7 раз, а также более высокой полярностью колонки DB-624 из-за наличия в НЖФ функциональных групп (СН2)3-С=Н Если сравнить хроматограммы, полученные на колонке DB-624, с хроматограмма-
Таблица 2
Основные хроматографические параметры диметилового эфира ТДГК
Параметр Значения на двух колонках
DB-624 HP-5
Время удерживания, мин 17,3 10
Полуширина пика, мин 0,04 0,05
Коэффициент удерживания 4,2 6,1
Эффективность колонки, т.т. на метр 17000 5600
ВЭТТ, мм 0,06 0,18
Асимметрия 1 1
88
86
84
82
S?
ос 80 78 76 74
1
2 3 4 5
t, мин
Рис. 2. Зависимость степени экстракции (R) от времени (t).
10
ми, полученными на колонке HP-5, видна следующая картина: при программировании температуры происходит подъём базовой линии за счёт постепенного уноса жидкой фазы из колонки DB-624. Данный температурный режим на колонке DB-624 в дальнейшем будет приводить к ухудшению эффективности. Таким образом, газохроматографическое определение ТДГК в виде её более летучего производного (диметилового эфира) целесообразнее осуществлять на колонке HP-5.
Выбор оптимальных условий подготовки проб сводился к выбору различных факторов: соотношения объёмов пробы, метанола, серной кислоты; температуры и продолжительности дериватизации; органического экстрагента; соотношения объёмов водной и органической фазы; продолжительности экстракции. Для совмещения стадий пробоподготовки — дериватизации и экстракции в одной ёмкости с минимальным расходом органических растворителей решили использовать хроматографическую виалу на 1,5 см3, снабжённую закручивающейся крышкой с септой. С учётом объёма виалы эмпирически выбраны объёмы водной фазы и органической фазы (экстрагента), которые составляют 1 и 0,5 мл соответственно. В качестве экстрагента выбран этилацетат, который очень хорошо экстрагирует эфиры. Соотношение объёмов пробы, метанола и серной кислоты (0,1 : 0,1 : 0,02) вызвано тем, чтобы этерификация метанолом в присутствии катализатора серной кислоты протекала количе-
ственно и необратимо. Для экспериментальной оценки степени экстракции проводили анализ образца мочи (0,1 см3), в которую вводили добавку 12,6 мкг деривата — диметилового эфира, 0,02 см3 серной кислоты, 0,5 см3 этилацетата, 0,9 см3 водного раствора сульфата натрия (0,18 г/см3). Затем проводили встряхивание на мульти-вортексе при разной продолжительности (1—9 мин). В результате получена зависимость степени экстракции от времени встряхивания (рис. 2). Сходимость измерения степени экстракции характеризуется коэффициентом вариации 6 %. Как видно из зависимости, степень экстракции возрастает до максимального значения 87 % в течение 5 мин, а затем остаётся неизменной. Поэтому оптимальной продолжительностью экстракции является проведение встряхивания на мульти-вортексе в течение 5 мин.
Для выбора оптимальных условий времени и температуры реакции этерификации (дериватиза-ции), а именно времени и температуры исследована зависимость степени дериватизации от температуры и продолжительности реакции на модельном растворе ТДГК в моче с концентрацией 45 мкг/ см3. Этерификацию проводили при разных температурах (60 и 80 °С) и разной продолжительности нагревания (5 — 60 мин). По результатам расчётов построены зависимости степени дериватизации от времени при двух температурах (рис. 3).
^ мин
Рис. 3. Зависимости степени дериватизации ф) ТДГК от времени нагревания (^ при температурах 60 °С (1) и 80 °С (2).
Таблица 3
Метрологические характеристики
Определяемое вещество Диапазон концентраций, мкг/см3 ОСКО повторяемости Vr, % ОСКО внутрилабораторной прецизионности Vf^, % Показатель точности -границы относительной погрешности* 5л, %
ТДГК 0,5-2,0 4 6 14
0,4-1 9 6,5 15
Примечание: * - соответствует относительной расширенной неопределенности иотн при к = 2.
Таблица 4
Размах содержания тиодигликолевой кислоты в моче
Группы min-max, мкг/см3 Me (Q25-Q75)
Цех № 30 (п = 15) 0,4-5,0 0,98 (0,52-1,73)
Цех № 40 (п = 15) 0,24-2,7 0,6 (0,4-1,5)
Контрольная группа (п = 25) 0,4-3,08 0,6 (0,4-1,1)
Как показывают зависимости, с повышением температуры и времени нагревания степень дериватизации возрастает. Поэтому оптимальным условием дериватизации является проведение реакции этерификации ТДГК метанолом в присутствии серной кислоты при температуре 80 °С не менее 15 мин. Сходимость определения степени дериватизации характеризуется коэффициентом вариации 4 %.
Оценены метрологические характеристики методики: повторяемость и внутрилабораторная прецизионность, правильность, точность в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725 (табл. 3).
Оценивание проводили по экспериментальным данным газохроматографического анализа аттестованных смесей (АС) ТДГК в моче. По результатам метрологической оценки получено свидетельство об аттестации методики.
Содержание ТДГК определяли в пробах суточной мочи лиц, находящихся в условиях стационара в 2010 году. Данные лица (всего 39 человек) являются работниками основных цехах производства винилхлорида и смолы поливинилхлорида ОАО «Саянскхимпласт». Основные цеха производства поливинилхлорида — это цех по получению ви-
нилхлорида из 1,2-дихлорэтана (цех № 30, 15 человек) и цех по получению смолы поливинилхлорида из винилхлорида (цех № 40, 24 человека). Также были проанализированы пробы мочи лиц контрольной группы — здоровых людей, не работающих на химических производствах, 25 человек (табл. 4).
Наибольшие концентрации ТДГК в моче отмечены у работников цеха № 30, меньшие — у работников цеха № 40. Вероятно, это связано с более высокой дозой воздействия хлороргани-ческих соединений или длительности контакта. Также установлено, что содержание ТДГК в моче с увеличением времени отбора пробы уменьшается (рис. 4). Это говорит о том, что ТДГК постепенно выводится из организма.
Полученные результаты не противоречат литературным данным. Литературные данные о содержании тиодигликолевой кислоты в моче рабочих производства винилхлорида, в зависимости от содержания винилхлорида в воздухе рабочей зоны, приведены в работах [9, 10]. Концентрации ТДГК в моче составляют 1,0 — 2,0 мкг/см3 при содержании ВХ в производственной среде менее 5,0 мг/м3, при
Время отбора, сутки
Рис. 4. Зависимости содержания ТДГК в моче от времени отбора пробы в момент поступления в стационар клиники.
содержании ВХ на уровне 5,0 мг/м3 концентрация ТДГК составляет 2,5 мкг/см3, при концентрациях ВХ выше 5,0 мг/м3 концентрации ТДГК составляют 3,5 — 6,0 мкг/см3.
В результате апробации разработанной методики получены значения содержания тиодиглико-левой кислоты в моче у работников производства поливинилхлорида (ОАО «Саянскхимпласт»). Установлено, что содержание данного метаболита зависит от длительности и дозы воздействия. Наибольшие значения концентраций ТДГК в моче характерны для работников цеха по получению винилхлорида из 1,2-дихлорэтана.
ЛИТЕРАТУРА
1. Дорогова В.Б., Мещакова Н.М., Журба О.М. Оценка производств винилхлорида и поливинилхлорида как источников загрязнения воздушной среды рабочих помещений и их влияние на организм работающих (обзор литературы) // Бюл. ВСНЦ СО РАМН. - 2008. - № 1. - С. 83-88.
2. Лемешевская Е.П., Жукова Е.В. Вопросы гигиены труда в крупнотоннажном производстве поливинилхлорида // Мед. труда и пром. экология. - 1995. - № 6. - С. 17-20.
3. Антонюженко В.А. Винилхлоридная болезнь - углеводородный нейротоксикоз. - Горький: Волго-Вятское кн. изд-во, 1980. - 183 с.
4. Орлова О.И., Савельева Е.И., Радилов А.С., Бабаков В.Н. и др. Применение биомониторинга
для оценки характера и тяжести воздействия химического фактора // Медицина труда и промышленная экология. — 2010. — № 12. — С. 28-33.
5. The Environmental health criteria 215. Vinyl Chloride. — Geneva: International Programme on Chemical Safety, 1999. — 331 p.
6. Draminski W., Trojanowska B. Chromatographic determination of thiodiglycolic acid — a metabolite of vinyl chloride //Arch. Toxicol. — 1981. — Vol. 48. — P. 289-292.
7. Chen Z.Y., Gu X.R., Cui M.Z., Zhu X.X. Sensitive flame-photometric-detector analysis of thiodiglycolic acid in urine as a biological monitor of vinyl chloride // Int. Arch. Occup. Environ. Health. — 1983. — Vol. 82. — P. 281 —284.
8. Mtiller G., Norpoth K., Wickramasinghe R. H. An analytical method using GC-MS for the quantitative determination of urinary thiodiglycolic acid // Int. Arch. Occup. Environ. Health. — 1979. — Vol. 44. — P. 185—191.
9. Tsun-Jen C., Yu-fang H., Yee-Chung M. Urinary thiodiglycolic acid levels for vinyl chloride monomer exposed polyvinyl chloride workers // J. Occup. Environ. — Med. 2001. — Vol. 43, N 11. — P. 934 — 938.
10. Mtiller G., Norpoth K., Kusters E. Determination of thiodiglycolic acid in urine specimens of vinyl chloride exposed workers // Int. Arch. Occup. Environ. Health. — 1978. — Vol. 41. — P. 199 — 205.
Сведения об авторах
Журба Ольга Михайловна - кандидат биологических наук, и.о. заведующей лаборатории физико-химических методов исследования Ангарского филиала ФГБУ «ВСНЦ ЭЧ» СО РАМН - НИИ медицины труда и экологии человека (665827, Иркутская обл., г. Ангарск, а/я 1170; тел. 8 (3955) 55-40-88; e-mail: [email protected])
Алексеенко Антон Николаевич - младший научный сотрудник лаборатории физико-химических методов исследования Ангарского филиала ФГБУ «ВСНЦ ЭЧ» СО РАМН - НИИ медицины труда и экологии человека (тел.: 8 (3955) 55-40-88; e-mail: [email protected])
