CC BY
29
МЕТОДОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ГИГИЕНИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ
УДК 543.544:541.452-005
А.Н. Алексеенко, О.М. Журба, В.Б. Дорогова
СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ МЕТОДОВ ГАЗОХРОМАТОГРАФИЧЕСКОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ТИОДИГЛИКОЛЕВОЙ КИСЛОТЫ В МОЧЕ ДЛЯ ТЕСТ ЭКСПОЗИЦИИ ВИНИЛХЛОРИДА (ОБЗОР)
Ангарский филиал ВСНЦ экологии человека СО РАМН - НИИ медицины труда и экологии человека
(Ангарск)
На основе литературных данных рассмотрены достоинства и недостатки методик газохроматографического определения тиодигликолевой кислоты в моче с различными способами пробоподготовки, хроматографирования и детектирования.
Ключевые слова: винилхлорид, тиодигликолевая кислота, газо-жидкостная хроматография, моча
COMPARATIVE ANALYSIS OF МETHODS OF GAS CHROMATOGRAPHIC DETERMINATION OF THIODIGLYCOLIC ACID IN URINE FOR TEST ESPOSURE
OF VINYL CHLORIDE
A.N. Alexeyenko, O.M. Zhurba, V.B. Dorogova
Institute of Occupational Health & Human Ecology ESSC HE SB RAMS, Angarsk
Merits and demerits of procedures of gas chromatographic determination of thiodiglycolic acid, in urine with different methods of samples of preparation, chromatograph and detection are presented on basic of literary data. Key words: vinyl chloride, thiodiglycolic acid, gas liquid chromatography, urine
Одним из современных методов оценки воздействия вредных веществ на организм человека является тест экспозиция. Для этого необходимо не только контролировать содержание веществ в воздухе рабочей зоны, но и содержание самих веществ и их конечных метаболитов в биологических средах организма человека (кровь, моча) [1, 2]. Содержание вещества или продуктов его метаболизма в биологическом материале позволяет установить уровень, при котором наблюдается определенный биологический эффект.
Основным продуктом метаболизма винилх-лорида, который выводится с мочой, является тиодигликолевая (тиодиуксусная) кислота (ТДГК). Ученые разных стран четко установили, что при воздействии винилхлорида на организм следует экскреция в мочу ТДГК, которая у животных составляет 50 % от всех метаболитов [5]. На наличие ТДГК в моче лиц, повергшихся воздействию винилхлорида в производственных условиях, указывают данные, полученные немецкими учеными [5, 6]. Они первые идентифицировали ТДГК в моче методом газовой хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием и потом разработали методику количественного определения ТДГК в моче этим же методом. Отечественных
работ, посвященных разработке методов определения тиодигликолевой кислоты в моче, нет.
МЕТОДИКА
Тиодигликолевая кислота проявляет высокую полярность из-за наличия в ней двух карбоксильных групп и очень низкое давление паров. Из физико-химических свойств известна только температура плавления, которая составляет 127 °С, данные по давлению паров и температуре кипения отсутствуют. ТДГК экстрагируется органическими растворителями из водных растворов с большой трудностью и легко абсорбируется в стационарной фазе для газовой хроматографии. Поэтому для количественного определения тиодигликолевой кислоты многими зарубежными авторами использован метод реакционной газовой хроматографии, основанный на переводе ТДГК в более летучие соединения.
Методика определения ТДГК в моче, предложенная немецкими учеными (G. Muller, K. Norpoth, R. Wickramasinghe), основана на обезвоживании проб мочи, растворении сухого остатка в метаноле, метилировании диазометаном [7]. Она очень сложна и длительна по времени выполнения и также включает приготовление катионного обменника,
заполненного ионообменной смолой DOWEX — 50WX, которая обрабатывается попеременно 2N №ОН и 2N НС1, водой и метанолом. Обезвоживание проб характеризуется добавлением в мочу 2N НС1, выдерживанием проб мочи в пробирках с винтовыми колпачками с тефлоновым покрытием в течение ночи в эксикаторе в вакууме. Метилирование ТДГК диазометаном осуществляется для перевода кислоты в ее диметиловый эфир — более летучее соединение. На рисунке 1 приведена схема реакции образования диметилового эфира ТДГК. После метилирования, раствор продукта дериватизации в метаноле еще отстаивается 15 мин, затем идет смешивание метанольного раствора с ионообменной смолой в ионообменнике, повторное отстаивание.
Далее идет газохроматографический анализ отстоявшегося экстракта. Разделение компонентов смеси осуществляется на капиллярной или насадочной колонке в потоке гелия. Условия газохроматографического разделения для насадочной и капиллярной колонки приведены в таблице 1.
Как видно из данной таблицы, ввод пробы в капиллярную колонку идет без деления потока (с задержкой сброса) и разделение компонентов на капиллярной колонке осуществляется в режиме температурного программирования. Эти приемы применяются в капиллярной газовой хроматографии, когда идет определение низких концентраций в пробе. При этом авторы в статье не указывают, с какой скоростью идет температурное программирование. Разделение компонентов на насадочной колонке, заполненной неподвижной фазой средней полярности, идет в изотермическом режиме. Используя разделение компонентов на насадочной
колонке и на капиллярной, авторы установили, что значения, полученные с помощью более точной капиллярной газовой хроматографии, оказались очень близкими к значениям, полученным на на-садочных колонках [4]. Следует отметить, что время удерживания вещества на капиллярной колонке в шесть раз превышает время удерживания на на-садочной колонке. Отсюда следует, что анализ целесообразнее проводить на насадочных колонках.
Идентификация хроматографического пика диметилового эфира ТДГК осуществлялась масс-селективным детектированием (т/е = 146). Предел обнаружения ТДГК в данной методике составляет 50 нг/мл.
Польские ученые Drammski и В. Tшjanows-
ка) предложили проводить определение тиодигли-колевой кислоты методом газовой хроматографии с пламенно-ионизационным детектированием [4]. Методика анализа включает в себя использование о-фталевой кислоты в качестве внутреннего стандарта, 3-кратную экстракцию этилацетатом в количестве 10 мл, упаривание растворителя досуха и де-риватизацию ТДГК №триметилсилилдиэтиламином в пиридине (1 : 1) в силильное производное. На рисунке 2 приведена реакция образования силильного производного ТДГК.
Разделение компонентов осуществляется на насадочной колонке, заполненной неподвижной фазой средней полярности, в режиме температурного программирования, это в свою очередь позволяет отделить пик органического растворителя (этилацетат) от пика определяемого компонента (табл. 2). В этой статье авторы не указали конечную температуру в режиме температурного программирования. Предел обнаружения ТДГК составляет
Н2С-
S
о
-с"
чон
сн2^
н2с-
Н2С-
о +
с
-2^
S
Н2С-
о
//
с
\
о—с н 3
с
о
оН сн^2 о—сн3
ТДГК диазометан диметиловый эфир ТДГК
Рис. 1. Схема реакции метилирования ТДГК диазометаном.
Таблица 1
Условия газохроматографического разделения для методики с масс-спектрометрическим детектированием
Условия Для насадочной колонки Для капиллярной колонки
Колонка Стеклянная, 1,8 м х 3 мм; 3 % OV-1 на хромосорбеЛМ DMCS 60/80 Стеклянная, 20 м х 0,2 мм, 10 % WG-11
Температурный режим Изотермический, 130 °С Программирование, 70 °С в течение 5 мин, затем до 150 °С
Режим инжекции 1 мкл прямой ввод, 200 °С 1 мкл без деления потока (задержка сброса - 2 мин), 200 °С
Газ-носитель Гелий, скорость потока через колонку 30 мл/мин Гелий, давление 25 psi; скорость потока через колонку 0,5 мл/мин
Режим детектора Интерфейсная и сепараторная линия, 200 °С
Время удерживания 2 мин 12 мин
/
Н2С— —C
‘1 ччс
S
Н2С— —с' \ OH
OH
ТДГК
+
CH3 CH3
I 3 I 3 H2^n/CH2
I
Si
I ^СНз CH3
НзС
N-триметилсилилдиэтиламин
CH3 / 3 O—Si—CH3 \ 3 -a CH3
XO
/O
-< /CH3
O Si—CH3
\ 3 CH3
силильное производное ТДГК
H2C
.2|
S
Н2С
+ 2
Н2С,
CH3 CH3
I 3 I 3
CH2
■ N
I
н
диэтиламин
Рис. 2. Схема реакции силилирования ТДГК.
Таблица 2
Условия газохроматографического разделения для методики с пламенно-ионизационным детектированием
2
Условия Параметры
Колонка стеклянная, 2 м х 2 мм; 3% 0^1 на Varaport 30/100/120 меш.
Температурный режим программирование, 125 °С в течение 4 мин, подъём со скоростью 24 °С/мин
Режим инжекции прямой ввод 1-2 мкл, 210 °С
Газ-носитель азот, скорость потока через колонку 40 мл/мин
Режим детектора 250 °С, скорость потока водорода 30 мл/мин, воздуха - 300 мл/мин
Время удерживания 4 мин
Таблица 3
Условия газохроматографического разделения для методики с пламенно-фотометрическим детектированием
Условия Параметры
Колонка Стеклянная, 2 м х 4 мм; 5 % ПЭГ-20 М на хромосорбе W-AW-DMCS 80/100 меш.
Температурный режим Изотермический, 180 °С
Режим инжекции Прямой ввод 2-5 мкл, 201 °С
Газ-носитель Азот, скорость потока через колонку - 50 мл/мин
Режим детектора 201 °С, скорость потока водорода - 60 мл/мин, воздуха - 70 мл/мин
Время удерживания 5 мин
10 мкг/мл, что значительно ниже, чем в методике, предложенной немецкими учеными. К недостаткам данной методики можно отнести то, что силилиро-вание ТДГК ведут в пиридине — веществе дурно пахнущем, 2 класса опасности.
Китайские ученые (Chen Z.Y., Gu X.R., Cui. M.Z., Zhu X.X.) предложили простую и селективную газохроматографическую методику определения ТДГК в моче с пламенно-фотометрическим детектированием [3]. Методика основана на обезвоживании проб, растворении сухого остатка в смеси метанол : эфир (2 : 1) и дериватизации ТДГК диазометаном. Обезвоживание проб в данной методике основано на упаривании пробы мочи, подкисленной соляной кислотой, до сухого остатка в фарфоровом тигле на паровой бане, что значительно ниже по времени по сравнению с приемом обезвоживания, предложенным немецкими учеными [4].
Разделение компонентов осуществляется на насадочной колонке, заполненной полярной фазой,
в изотермическом режиме в потоке азота. Время удерживания составляет 5 мин (табл. 3). Авторы также указывают, что предел обнаружения ТДГК по данной методике составляет менее 1 нг, в то же время в статье градуировочный график построен в диапазоне концентраций 2 — 10 мкг/мл, а хроматограмма приведена для 8 нг ТДГК в моче.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
На основании анализа существующих способов детектирования наиболее простым в исполнении, селективным и более чувствительным является использование пламенно-фотометрического детектирования. Указанный детектор является весьма эффективным для определения серосодержащих органических соединений, а поскольку ТДГК в составе своей молекулы содержит серу, то представляется целесообразным использование пламенно-фотометрического детектора. Масс-спектрометрическое детектирование целесообразнее использовать при
анализе смесей неизвестного состава. Следует отметить, что пламенно-ионизационное детектирование, по своей чувствительности оказалось недостаточным для определения ТДГК при концентрациях винилхлорида в воздухе рабочей зоны ниже 30 мг/ м3. Таким образом, данный способ не позволяет определить наличие метаболита в моче.
Из всех описанных способов пробоподготовки лучше всего использовать сначала экстракцию органическим растворителем и дериватизацию диазометаном или метанолом в присутствии концентрированной серной кислоты.
При хроматографировании лучше всего применять разделение смеси на насадочной колонке в изотермическом режиме, если пик органического растворителя не оказывает мешающее влияние на пик определяемого компонента, а если оказывает влияние, то лучше использовать разделение смеси на капиллярной колонке в режиме температурного программирования и использовать ввод пробы в капиллярную колонку в режиме «splitless».
ЛИТЕРАТУРА
1. Ревич Б.А. Биомониторинг токсичных веществ в организме человека // Гиг. и сан. — 2004. — № 6. - С. 26-31.
2. Токсикометрия химических веществ, загрязняющих окружающую среду / под ред. А.А. Каспарова. — М. : Центр международных проектов ГЖНТ, 1986. - 428 с.
3. Chen Z.Y., Gu X.R., Cui M.Z., Zhu X.X. Sensitive flame-photometric-detector analysis of thiodi-glycolic acid in urine as a biological monitor of vinyl chloride // Int. Arch. Occup. Environ. Health. — 1983. — Vol. 82. — P. 281 —284.
4. Draminski W., Trojanowska В. Chromatographic determination of thiodiglycolic acid — a metabolite of vinyl chloride // Archives of Toxicology. — 1981. — Vol. 48. — P. 289 — 292.
5. Muller G., Norpoth K. Bestimmung zweier urinmetabolite des vinylchlorids // Naturwissenschaf-ten. — 1975. — Vol. 62. — S. 541.
6. Muller G., Norpoth K., Eckhard R. Identification of two urine metabolites of vinyl chloride by GC-MS investigations // International Archives of Occupational and Environmental Health. — 1976. — Vol. 38. — P. 69 — 75.
7. Muller G., Norpoth K., Wickramasinghe R.H. An analytical method using GC-MS for the quantitative determination of urinary thiodiglycolic acid // Int. Arch. Occup. Environ. Health. — 1979. — Vol. 44. — P. 185—191.
Сведения об авторах
Дорогова Варвара Борисовна - д.б.н., профессор, зав. лабораторией физико-химических методов исследования Ангарского филиала ВСНЦ ЭЧ СО РАМН (665827, г Ангарск, 12-а микрорайон, д. 3; факс: 8 (3955) 55-40-87, тел.: 8 (3955) 55-40-88; е-mail: [email protected])
Алексеенко Антон Николаевич - младший научный сотрудник лаборатории физико-химических методов исследования Ангарского филиала ВСНЦ ЭЧ СО РАМН (665827, г Ангарск, 12-а микрорайон, д. 3; факс: 8 (3955) 55-40-87, тел.: 8 (3955) 55-40-88; e-mail: [email protected]).
Журба Ольга Михайловна - к.б.н., научный сотрудник лаборатории физико-химических методов исследования Ангарского филиала ВСНЦ ЭЧ СО РАМН (665827, г. Ангарск, 12-а микрорайон, д. 3; факс: 8 (3955) 55-40-87, тел.: 8 (3955) 55-40-88; е-mail: [email protected])
