CC BY
106
УДК 579.84:579.222.4:579.266.2
ГАЛОАЛКАЛОФИЛЬНЫЕ ДЕНИТРИФИКАТОРЫ 'HALOMONAS NITRITOFIL US' ИЗ СОДОВЫХ ОЗЕР БУРЯТИИ
© 2011 Е.А.Семёнова, Е.А.Гильванова, Н.Г.Усанов
Учреждение Российской академии наук Институт биологии Уфимского научного центра РАН
Поступила 27.05.2011
Выполнен целевой скрининг денитрифицирующих грамотрицательных бактерий, фенотипически близких к бактериям рода Halomonas. Выделенные штаммы отличаются от "классических" Halomonas диапазоном pH для роста (7,0 - 11,0) и скоростями денитрификации, в несколько раз превышающими известные значения, а также устойчивостью к нитриту натрия в высоких концентрациях и способностью восстанавливать нитрит даже при его очень низких стартовых концентрациях в щелочных средах. Филогенетический анализ гена 16S рРНК полученных изолятов выявил их принадлежность к аморфной III филогенетической группе ("ungrouped" Halomonas) с уровнем сходства 93-98%. Внутри этой группы выделенные галомонады образовывали 2 компактных кластера с высокими уровнями сходства 97-100% и сходными фенотипическими признаками. В каждом кластере предложены номинанты на новый вид 'Halomonas nitritophilus'.
Ключевые слова: Halomonas, денитрификация, нитрит.
Род НЫотопая [1] входит в группу грамотрицательных гамма-протеобактерий и, по данным N061, включает на настоящий момент порядка 50 видовых групп и более 750 штаммов, охарактеризованных как НаЬтопая ер. Типовым считается вид Н. elongata [2] относящийся к мезофильным и экстремально галофильным микроорганизмам, развивающимся на органо-минеральных средах с высокими концентрациями хлорида натрия. Интерес к изучению разнообразия галомонад проявляется как с точки зрения исследования особенностей функционирования природных экосистем, так и для решения прикладных задач. Отдельным и, на наш взгляд, перспективным направлением является выделение и исследование культур НаЬтопая, устойчивых к высоким концентрациям нитрит анионов и способных к полной денитрификации нитратов до газообразного азота. Возможными направлениями использования таких микроорганизмов являются очистка воды от концентрированных примесей нитритов и нитратов, аноксические процессы окисления органических поллютантов в воде [3] и др.
Впервые толерантность денитрифицирующих галомонад к очень высоким концентрациям нитрита натрия (до 10% масс.) была обнаружена сотрудниками лаборатории прикладной микробиологии ИБ УНЦ РАН в 2000 - 2003 гг. Тогда на основании изучения токсичности МаМ02 при различных значениях рН среды был сделан вывод, что скрининг нитриттолерантных бактерий следует проводить в ассоциациях алкалофильных и алкалотолерантных микроорганизмов. Нашей задачей стало выделение из природных источников культур галомонад, устойчивых к высоким концентрациям нитрита натрия, описание их культурально-морфологических, физиолого-биохимических и генетических признаков, а также идентификация и определение их филогенетической позиции.
Семёнова Екатерина Александровна, канд. биол. наук, e-mail: sea@anrb.ru; Гильванова Елена Альбертовна, канд. биол. наук, e-mail: gelena@anrb.ru; Усанов Николай Глебович, канд. биол наук.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
Объектами исследования служили галоалкало-фильные денитрифицирующие бактерии рода Halomonas из коллекции Института биологии УНЦ РАН, а также вновь выделенные из природных мест обитания изоляты (табл. 1). Исходным материалом для выделения нитритустойчивых бактерий, предположительно относящихся к роду Halo-monas, служили различные образцы природного материала, имеющие естественный уровень рН в интервале 8,4 - 10,1 и минерализации 5,5 - 330 г/л. Скрининг проводили методом накопительных культур в анаэробных условиях на селективных средах с последующим пассажированием для получения чистой культуры.
Селективная питательная среда, обозначенная GF, имела следующий состав, г/л: дрожжевой экстракт - 10, КН2Р04 - 4, Na2C03 - 2, NaCl - 10, NaN02 - 20; рН 9,2 - 9,4. Единственным акцептором электронов служил нитрит натрия. Дальнейшее исследование полученных культур проводили на аналогичных питательных средах при температуре 30 - 37°С. Аноксический рост культур изучали в специальных стеклянных пробирках с завинчивающимися крышками, заполненных до верха питательной средой. Аэробное культивирование проводили в конических колбах объемом 250 мл на воздушно-термостатируемых качалках типа УВМТ-12-250 при скорости перемешивания 150 -200 об/мин.
Морфологию, подвижность и размеры клеток исследовали с помощью фазовой оптической и сканирующей зондовой микроскопии на микроскопах Cari Zeiss (Германия) и Solver Pro-M (NT-MDT, г. Зеленоград, Россия).
Изучение физиолого-биохимических характеристик исследуемых микроорганизмов проводили, руководствуясь требованиями к описанию новых групп бактерий семейства Halomonadaceae [4], а также методами, описанными в руководствах: [5, 6,
7].
Для выявления спектра аэробно или анаэробно используемых субстратов их вносили в количестве 5 г/л в среду, содержавшую 20 г/л NaCl, 4 г/л КН2РО4 и 5 г/л бактериологического агара. В качестве индикатора кислотообразования в среду добавляли 0,1 г/л тимолового синего. Сахара в виде концентрированных водных растворов вносили в стерильную щелочную среду непосредственно перед засевом. Посев проводили уколом в центр агарового столбика. Для создания анаэробных условий поверхность среды покрывали слоем 2% агара.
Для получения pH зависимости нужные значения pH устанавливали подтитровкой среды 20% раствором Na2CC>3. Для определения потребности в хлориде натрия концентрированный раствор NaCl вносили в жидкую среду с оптимальным значением pH до получения необходимой концентрации от 0 до 25% соответственно. Температурную зависимость определяли при оптимальных значениях pH и минерализации среды. Для определения устойчивости к антибиотикам в агаризованную среду GF вводили соответствующие растворы до конечной концентрации: ампициллина - 20 мкг/мл, канами-цина - 10 мкг/мл, рифампицина - 150 мкг/мл, тетрациклина - 10 мкг/мл, налидиксовой кислоты - 15 мкг/мл, стрептомицина - 10 мкг/мл, хлорамфени-кола - 25 мкг/мл, спектомицина - 100 мкг/мл.
Выделение ДНК проводили методом фенольной экстракции [8]. Последовательности 16S рРНК генов (1463 - 1507 п.о.) были получены методом ПЦР, с использованием концевых праймеров 16SF27 и 16SR1512 и реакционной смеси, содержащей стандартные концентрации дНТФ и Taq-полимеразы (Fermentas, Литва) и ДНК-матрицу. Полимеразную реакцию проводили в амплифика-торе MasterCycler Personal (Eppendorf, Германия). Секвенирование гена 16S рРНК проводили на сек-венаторе Perkin-Elmer ABI PRISM1M 373 с использованием универсальных для большинства прокариот праймеров. Анализ полученных последовательностей штаммов IB-G4, IB-I6, IB-NN3-2c, IB-07-1, IB-Ar4, IB-559, IB-018 и IB-07-6 и построение филогенетических древ были выполнены с помощью программ BioEdit [9] и TREECON [10]. В филогенетический анализ были включены последовательности длиной не менее 1430 п.о., имевшие позиции с 38 по 1506, согласно нумерации E.coli [11].
Качественный и количественный анализ анионного состава культуральной жидкости проводили методом высокоэффективного капиллярного электрофореза (ВЭКЭФ) на приборе АКИ «Нанофор 01» (г. Санкт-Петербург, Россия), в кварцевом капилляре длиной / = 75 см, внутренний диаметр dBH = 70 мкм; при рабочем напряжении 11 кВ; детектирование - непрямое в ультрафиолетовой области с длиной волны X = 254 нм; буферный раствор -хроматный электролит (5 мМ оксида хрома (VI), 20 мМ диэтаноламина, 1,65 мМ N-ucth.i-N.N.N-триметиламмония бромида). Статистически досто-
верная чувствительность метода по нитрит аниону составляла 0,5 мг/л.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
С целью скрининга денитрифицирующих бактерий, предположительно относящихся к роду Halo-monas, развивающихся на минимальном субстрате и при этом проявляющих устойчивость к нитриту натрия, было обследовано 24 природных образца, включавших пробы чернозема (Челябинская и Кировская обл.), песка и литорального грунта с прибрежных зон Красного и Черного морей, ила со дна содовых и соленых озер (Республика Бурятия и Оренбургская обл.), почвы, отобранные в районах горячих источников (Республика Бурятия и Камчатка). Фактором селекции служил NaN02, вносимый в питательную среду в качестве акцептора электронов в концентрации 2% масс. Накопительные культуры инкубировали при 37°С, 48 ч. Пробы, демонстрировавшие активное образование газа (предположительно азота), высевали на щелочной питательный агар. Больше всего денитрификаторов было выделено из образцов придонного осадка содовых озер респ. Бурятии, и немногочисленная группа изолятов получена из соляного отвала одного из озер г. Соль-Илецка, из проб буровых растворов для скважин, из проб литорального грунта (Израиль), из проб прибрежной зоны и пустынной почвы штата Аризона (США) (табл.1). Всего были выделены 21 денитрифицирующий изолят. Полученные штаммы были объединены в коллекцию нитритрезистентных денитрифика-торов. Выделенные штаммы несколько различались формой, цветом и размером колоний, морфологией клеток. При анаэробном росте в жидкой среде некоторые из штаммов коллекции образовывали плотный слизистый осадок, который поднимался к поверхности среды образующимися в большом количестве пузырьками газа. Для детального изучения выбрали 5 изолятов, обобщающих основные морфотипы коллекции - штаммы IB-G4, IB-I6, IB-018, IB-07-1, IB-SL3 (табл. 1).
Вегетативные клетки практически всех изолятов представляли собой грамотрицательные, факультативно анаэробные, подвижные палочки размером (0,7^-1,0)х( 1,5-К2,5) мкм. Иногда можно было наблюдать образование цепочек от 2 до 4 сцепленных между собой клеток. Отличались только клетки штамма IB-018, они представляли собой кокки 0,7^-1,0 мкм в диаметре. Подвижность клеток остальных изолятов обеспечивалась за счет одного или двух боковых жгутиков, расположенных с одной стороны клетки. Жгутики были длинные, в несколько раз превосходящие размеры клеток, однако часто обламывались при приготовлении препаратов.
Основные физиолого-биохимические свойства пяти нитритрезистентных культур представлены в таблице 2.
Таблица 1. Источники грамотрицательиых иитритрезистентных изолятов, выделенных на селективной среде и их генотипическая характеристика_
Изоляты Место отбора Характеристика пробы рн Селективная среда Длина прочитанного участка гена 16S рРНК (пн) Номера депонированных последовательностей в EMBL
IB-G4 Бурятия, содовое озеро Придонный осадок 8.4 GF 1480 АМ490139
Ш-16 Израиль, г. Кармель Горная почва 9.2 GF 1507 AJ302088
Ш-Аг4 Штат Аризона, США Почва под пальмой 8.6 GF 1507 AJ309564
Ш-559 Западная Сибирь, скв. 559 Кирско -Коттынского месторождения Буровой раствор из нефтяной скважины, глубина 2700 м 8,7 GF 1505 AJ309560
Ш- NN3-2c Бурятия, содовое озеро Нухэ-Нур Бактериальные маты со дна 9,8 GF 1463 АМ490135
Ш-07-1 Бурятия, содовое озеро Оронгойское Иловый осадок 10,1 GF 1472 АМ490137
Ш-07- 6 Бурятия, содовое озеро Оронгойское Иловый осадок 10,1 GF 1466 АМ490138
Ш-018 Бурятия, содовое озеро Оронгойское Иловый осадок 10,1 GF 1477 АМ490136
Температурный интервал для роста большинства изолятов был определен от 6 до 48°С с оптимумом 36 - 40°С. Диапазон значений рН для роста большинства культур на среде без нитрита составлял 6,5 - 11,5 с оптимумом рН 9,0 - 9,5. В присутствии 1% масс. ЫаЫСЬ рост всех культур наблюдался только при рН 7,5 и выше. Исключение составлял штамм 1В-16, который проявлял способность к активному росту в присутствии нитрита натрия в диапазоне рН 7,0 - 11,5. Все культуры коллекции представляли собой факультативно анаэробные гетероорганотрофные галоалкалофильные грамотрицательные денитрифицирующие бактерии, проявляли положительную каталазную и ок-сидазную реакцию. Изоляты росли на средах, содержавших до 25% МаС1, с оптимумом 4 - 8%, что указывало на их принадлежность к умеренным га-лофилам. Как известно, развитие алкалофилов также сопряжено с зависимостью от ионов Ыа [12, 13]. Облигатная потребность большей части культур нашей коллекции в катионах Ыа для своего
роста стала еще одним общим физиологическим признаком. Минимальный уровень концентраций иона Na+ лежал в области значений 30 - 35 мМ по NaCl. Тем не менее, имелись исключения. Штамм IB-I6 обнаруживал рост на «безнатриевой» среде с фоновой концентрацией Na+ 1,5 - 1,7 мМ.
В качестве источников энергии микроорганизмы использовали различные органические субстраты, такие, как дрожжевой экстракт, некоторые органические кислоты, углеводы и полиспирты. Все бактерии не были способны гидролизовать крахмал и казеин. Три культуры гидролизовали желатин (IB-I6, IB-07-1, IB-018). Практически все гидролизовали эскулин в большей или меньшей степени, кроме штамма IB-018.
Для сравнительной оценки в таблице 2 представлены также некоторые биохимические и куль-туральные свойства классических видов рода На-lomonas (H. elongata, H. variabilis) и денитрифика-торов Н. desiderata, H. halodenitrificans, взятые из литературных источников [1, 14, 15].
Таблица 2. Сравнительная фенотипическая характеристика некоторых нитритрезистентных изолятов, классических видов рода Halomonas {H. elongata, H. variabilis) и денитрифицирующих галомонад, имеющих наиболее высокое сродство по гену 16S рРНК (К desiderata, H. halodenitrificans)
Характеристика IB-G4 Ш-16 Ш-07-1 IB-SL3 Ш-018 H. elongata1 Н. variabilis1 Н. desiderata1 H. halode nitrifîcans1
Форма клеток палочки палочки палочки палочки кокки палочки искрив л. палочки палочки короткие палочки
Размеры клеток, мкм 1 X 3 0,7 х 2 нд НД нд НД 0,8 х 3 0,6 х 2,6 0,5 х 1;2
Подвижность + + нд нд нд + + + -
Жгутикование + + нд нд нд + + + -
Пигментация прозрач. беж. бел. беж. бел. бел. беж. беж. беж.
Окраска по Граму - - - - - - - - -
Факультативный анаэроб + + + + + + - + +
Катал аза + + + + + НД нд + нд
Оксидаза + + + + + - + + +
Уреаза + + + + + + + - НД
Восстановление 1ГОз"" + + + + + + - + +
Восстановление М02" + + + + + - - + +
Нитратное дыхание + + + + + + - + +
Нитритное дыхание + + + + + - - + +
Концентрация МаЬЮ2, % 0,01-8 0,05-8 0,05-5 0,05-5 0,1-8 НД нд нд нд
Потребность в №+, М 0,051 0,001 0,034 нд 0,204 нд нд + нд
Концентрация №01, %, рН 9,4 (интервал/оптимум) 0,1-18/ 2-4 0-18/ 2-4 0-20/ 2-4 0,5-25/ 2-4 1-18/ 2-4 0-20/ 3-8 1-25/ 10 0-18/ 1-5 3-20/ 5-9
рН, интервал/оптимум 7,0-11,5/ 9,4 6,5-11,5/ 9,4 6,5-11,5/ 9,4 7,0-10,5/ 9,4 7,0-10,5/ 9,4 5-10 6-9 7-11/ 9,5 5-10
Температура, °С 6-48 6-50 6-40 6-40 6-40 4-45 15-37 10-48 5-37
Гидролиз крахмала - - - - - - - - -
Гидролиз желатины - + + - + + - - -
Гидролиз казеина - - - - - - + - -
Гидролиз эскулина + + +/- +/- - + + НД -
Фенил аланиндезаминаза - - - - - - - + НД
Образование сероводорода - - - - - - - нд -
Образование кислоты из:
Б-глюкозы + + + + + + - - -
Г-арабинозы - + + - - + - - -
лактозы - - - - - + - - -
маннита - + + + - + - - -
сахарозы + + + + + + - - -
Субстраты:
Дрожжевой экстракт + + + + + НД НД нд нд
Ацетат + + + + + + + + +
Цитрат + + + + + + + + +
Лактат - - +/- +/- +/- нд нд + нд
Глицерин + + + + + + + + +
Сорбит - - - - - + + - +
Маннит - + + + +/- + - + нд
Глюкоза + + + + + + + + +
Сахароза + + + + + + - + нд
Фруктоза + + + + +/- нд - + нд
Арабиноза - + + +/- +/- + - - нд
Устойчивость к антибиотикам:
ампициллин + + + + + нд нд нд нд
канамицин + + + + + нд нд нд нд
рифампицин + + + + + нд нд нд нд
тетрациклин + + + + + нд нд нд нд
налидиксовая кислота + + + + + нд нд нд нд
стрептомицин + +/- + - +/- нд нд нд нд
хлорамфеникол - - - - - нд нд нд нд
спектомицин - + +/- +/- - нд нд нд нд
Прим. НД - нет данных; + положительная реакция; - отрицательная реакция; +/- признак проявляется в слабой степени. 'По литературным данным [1, 14, 15]
Определение антибиотикоустойчивости некоторых штаммов коллекции выявило, что все культуры устойчивы к ампициллину (до 20 мкг/мл), кана-мицину (до 10 мкг/мл), рифампицину (до 150 мкг/мл), тетрациклину (до 10 мкг/мл) и налидиксо-
вой кислоте (до 15 мкг/мл). У всех штаммов проявляется чувсвительность к хлорамфениколу. А также практически все чувствительны к спектомицину и стрептомицину. Устойчивость к стрептомицину
обнаружена только у штаммов IB-G4 и IB-07-1, а к спектомицину только у IB-I6.
Учитывая совокупность культурально-морфологических и физиолого-биохимических признаков, все вновь выделенные бактерии предварительно были отнесены к роду Halomonas [1, 16].
По последним данным, одним из главных таксономических маркеров при идентификации бактерий рода Halomonas служит их способность к полной денитрификации [17]. Все наши бактерии полностью восстанавливали нитраты до газообразного азота, используя NO3" в качестве единственного акцептора электронов. Однако, более подробное изучение сложного процесса денитрификации позволило нам выявить не известные до этого особенности. Считается, что содержание NaNC^ в нейтральных средах (как и NaN03, из которого образуется нитрит) ограничено концентрацией 1,5-3 г/л [3, 18]. В отличие от известных денитрификаторов, полученные нами культуры галомонад обладали устойчивостью и способностью к восстановлению сравнительно высоких концентраций нитрита натрия. Максимум содержания NaNC^ в средах, на которых наблюдался рост наших изолятов, варьировал в пределах от 30 до 80 г/л (табл. 1), при оптимуме 10-15 г/л.
В процессе определения минимального порога концентрации нитрита, как единственного акцептора электронов, было обнаружено, что 13 изолятов способны к аноксическому росту и денитрифиции в щелочных условиях даже при низких концентрациях NaN02 (до 0,2 г/л). Все они восстанавливали это соединение до концентраций, не детектируемых методами ВЭКЭФ. Вместе с тем, также были определены 8 изолятов, не способных к росту при содержании нитрита в среде менее 0,2 - 1,0 г/л (табл. 2), но развивающихся при наличии более высоких концентраций этого окислителя. Наиболее требовательным к концентрации нитрита в среде оказался штамм IB-07-6, восстанавливающий NaNC^ лишь при его концентрациях в питательных средах выше 2,6 г/л.
Все эти данные вызывают множество вопросов и требуют детального исследования, которое будет произведено в дальнейшем.
Таксономическое положение нитритрезистент-ных культур было определено для 8 наиболее интересных штаммов - IB-G4, IB-I6, IB-NN3-2c, IB-07-1, IB-Ar4, IB-559, IB-018 и IB-07-6. Согласно полученным данным анализа секвенированных последовательностей гена 16S рРНК, все культуры входили в у-подгруппу протеобактерий и были близки к микроорганизмам рода Halomonas.
Филогенетические взаимоотношения нитритре-зистентных бактерий с другими галомонадами представлены в виде дерева на рисунке. Род Halomonas разделяют на условные филогенетические группы I и II, а также группу III ("ungrouped" Halomonas), которая включает разноудаленные виды с четкой дифференциацией фенотипических
признаков и в будущем вполне может быть разбита на несколько филогенетических групп или даже родов [14, 16]. Уровень сходства последовательностей наших штаммов с последовательностями 16S рРНК представителей филогенетической группы I составил 92,2 - 95,2%, для группы II - в пределах 91,5 - 95,1%, тогда как с ближайшими представителями "ungrouped" Halomonas этот показатель находился на уровне 92,5 - 98,4%. На основе полученных данных для сравнительного анализа гена 16S рРНК были выбраны представители ближайших видов Halomonas. В том числе были включены новые виды, входящие в III группу [19, 20, 21, 22]; а также ближайшие представители группы I, включающей типовой вид Н. elongata и др. [2, 23, 24], и группы II [25, 26, 27, 28, 29, 30, 31]. При подборе анализируемых последовательностей также учитывали результаты поиска гена 16S рРНК ближайших типовых штаммов, используя программу On-line Seqmatch v.3 [32].
Результаты проведенного нами филогенетического анализа согласуются с заключением Arahal et al. [14] и Lee et al. [34] о гетерогенности рода Halomonas, сделанном на основании результатов анализа последовательностей 16S и 23S рРНК [35]. Типовой вид рода Halomonas elongata формировал обособленный подкластер вместе с близкородственными видами Н. halmophila, Н. eurihalina, Н. salina, Н. halophila и Н. organivorans с достаточно высоким значением "bootstrap''-анализа 75%. Наиболее многочисленной группой видов Halomonas с высоким значением показателя достоверности кластеризации (98%), включавшей 9 видов, являлась вторая (II) филогенетическая группа среди бактерий рода Halomonas.
Филогенетический анализ позволил выявить на филограмме две группы, образуемые нашими культурами. Как и ожидалось, все восемь штаммов были локализованы внутри обширной аморфной группы III - "ungrouped Halomonas. Первая группа А, состоявшая из штаммов IB-559, IB-G4, IB-NN3-2с, IB-07-6 и IB-018, образовывала два когерентных кластера с достоверными показателями "bootstrap''-анализа 61 и 100%. Внешний кластер был объединен четырьмя штаммами не только очень высоким значением "bootstrap", но и достаточно высоким уровнем гомологии нуклеотидных последовательностей внутри этой группы 97,0 -99,8%. Вторая группа В, включавшая IB-Ar4, IB-I6 и IB-07-1, образовывала компактный кластер с высоким показателем "bootstrap" и уровнем сходства последовательностей внутри этой группы 98,5 -100%. Необходимо отметить, что ближайшим родственником для штаммов этой группы оказался Halomonas desiderata [15] - представитель так называемых "ungrouped Halomonas с уровнем сходства последовательностей 98 - 98,4% внутри этой группы. Несколько отстояла от внешнего кластера группы А культура IB-018. Она отличалась не только невысоким уровнем генетического родства
97 - 97,8%, но и на фенотипическом уровне, в частности, культура имела несхожий с другими мор-фотип колоний, форму клеток, вариабельную окраску по Граму и отличалась повышенной потребно-
стью в ионах натрия (более 0,2 М). С членами группы В эта культура имела еще меньшее сходство последовательностей - 96,3 - 97%.
Рис. Филогенетическое дерево нитритрезистентных бактерий рода Halomonas. Корень определен включением последовательности Zymobacter palmae [33] в качестве внешней группы. Масштаб соответствует 2 нуклеотид-ным заменам на каждые 100 нуклеотидов (эволюционным расстояниям). Цифрами показана статистическая достоверность порядка ветвления, определенная с помощью "bootstrap"-анализа 100 альтернативных деревьев; значения менее 50% не указаны.
Полные последовательности генов 16S рРНК нитритрезистентных культур были депонированы в базе данных EMBL (European Molecular Biology Laboratory)/GenBank под номерами представленными в Таблице 1. АМ490139, AJ302088, АМ490135, АМ490137, AJ309564, AJ309560, АМ490136, АМ490138.
Изученные нами штаммы значительно отличались на филогенетическом и фенотипическом уровнях как от типового вида Н. elongata [2] и близких к нему организмов Н. halmophila, Н. eurihalina [36, 37], так и от Н. muralis, Н. pantelleriensis, Н. halodenitrificans [38, 39], с которыми они имели наиболее высокий уровень сходства 16S рРНК 94,6-97,7%). Наиболее существенными характеристиками, дифференцирующими наши штаммы от указанных видов, являлись: диапазон рН, сдвинутый в щелочную область (7-11); более широкий температурный интервал (6 - 48°С),
но наиболее важным признаком была способность к полной денитрификации NO3" до газообразного азота в щелочных условиях, устойчивость к очень высоким концентрациям NO2" до 1,2 M (80 г/л), а иногда даже потребность в наличии некой минимальной концентрации нитрита натрия. Наиболее близкие к нашим изолятам физиолого-биохимические характеристики отмечены у денит-рификатора H. desiderata [15], имевшего наибольший процент генетического сходства со штаммами группы В. К сожалению, на сегодняшний день в литературе нет данных по изучению роста представителей рода Halomonas на средах, содержащих нитрит натрия более 0,01 - 0,02 М, в условиях денитрификации. С учетом всего вышесказанного становится очевидным, что любой из исследованных штаммов, может быть предложен в качестве нового вида, например, 4Halomonas nitritophilus\ и, в частности, культуры IB-G4, IB-I6 и IB-018.
Один из соавторов статьи, к.б.н., доцент Усанов
Николай Глебович, скоропостижно скончался при
подготовке статьи к публикации.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Mata J. A., Martinez-Canovas J., Quesada E. and Bejar V. A detailed phenotypic characterisation of the type strains of Halomonas species // Systematic and Applied Microbiology. 2002. V. 25. P. 360-375.
2. Vreeland R. H., Litchfield C. D., Martin E. L. and Elliot E. Halomonas elongata, a new genus and species of extremely salt-tolerant bacteria // International Journal of Systematic Bacteriolog. 1980. V. 30. P. 485-495.
3. Гшьванова E.A., Усанов Н.Г. Количественная оценка биоцидной активности химических соединений с помощью микробных ассоциаций почвы // Прикладная биохимия и микробиология. 2003. Т. 39. № 3. С. 329 - 334.
4. Arahal D. R., Vreeland R. Н., Litchfield С. D., Mormile M. R., TindallB. J., OrenA., Bejar V., Quesada E. and Ventosa A. Recommended minimal standards for describing new taxa of the family Halomonadaceae II International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 2007. V. 57. P. 2436-2446.
5. Определитель бактерий Берджи: Пер с англ. / под ред. Дж. Хоулта, Н. Крита, П. Снита, Дж. Стейли, С. Уилль-ямса. М.: Мир, 1997. 800 с.
6. Методы общей бактериологии: В 3-х томах. Пер. с англ./ под ред. Ф. Герхардта и др. М.: Мир, 1984.
7. Практикум по микробиологии / А.И. Нетрусов, М.А. Егорова, JI.M. Захарчук и др.; под ред. А.И. Нетрусова. М.: Издательский центр «Академия», 2005. 608 с.
8. Wilson К. Preparation of genomic DNA from bacteria // Current protocols in molecular biology. Chapter 2 / ed. by Frederick M., Ausubel et al. 2001.
9. Hall T. BioEdit Biological Sequence Alignment Editor Version 7.0.9. 2007
10 .Van de Peer Y. and De Wachter R. TREECON for Windows: a software package for the construction and drawing of evolutionary trees for the Microsoft Windows environment // Computer Applications in the Biosciences. 1994. V. 10. P. 569-570.
11. Brosius J., Palmer M. L., Kennedy P. J. and Noller H. F. Complete nucleotide sequence of a 16S ribosomal RNA gene from Escherichia coli II Proceed. National Academy of Sciences of the United States of America. 1978. V. 75. P. 4801-4805.
12. Деткова E.H. Осмоадаптация галоалкалофильных бактерий из содовых озер // Алкалофильные микробные сообщества. М.: Наука, 2007. С. 348-373.
13. Krulwich Т. A. and Guffanti A. A. The Na+ cycle of extreme alkalophiles: A secondary Na+/H+ antiporter and Na+/solute symporters // J. Bioenerg. Biomembranes. 1989. V. 21. P. 663-677.
14. Arahal D. R., Ludwig W., Schleifer К. H. and Ventosa A. Phylogeny of the family Halomonadaceae based on 23S and 16S rDNA sequence analyses // Internal J. Systematic and Evolutionary Microbiology. 2002. V. 52. P. 241-249.
15. Berendes F., Gottschalk G., Heine-Dobbernack E., Moore E. R. B. and TindallB. J. Halomonas desiderata sp. nov., a new alkaliphilic, halotolerant and denitrifying bacterium isolated from a municipal sewage works // Systematic and Applied Microbiology. 1996. V. 19. P. 158-167.
16. Bergey's Manual of Systematic Bacteriology 2nd ed. Springer US, 2005. 2816 p.
17. Gonzalez-Domenech С. M., Martinez-Checa F., Bejar V. and Quesada E. Denitrification as an important taxonomic marker within the genus Halomonas // Systematic and Applied Microbiology. 2010. V. 33. P. 85-93.
18. Chung J., Bae W„ Lee Y. W„ Ko G. B„ Lee S. U. and Park S. J. Investigation of the effect of free ammonia concentration upon leachate treatment by shortcut biological nitrogen removal process // J. Environmental Science and Health: Part A Toxic/Hazardous Substances and Environmental Engineering. 2004. V. 39. P. 1655-1665.
19. Gonzalez-Domenech C. M., Martinez-Checa F., Quesada E. and Bejar V. Halomonas cerina sp. nov., a moderately halo-philic, denitrifying, exopolysaccharide-producing bacterium // International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 2008. V. 58. P. 803-809.
20. Kim K. K, Jin L., Yang H. C. and Lee S. T. Halomonas gomseomensis sp. nov., Halomonas janggokensis sp. nov., Halomonas salaria sp. nov. and Halomonas denitrificans sp. nov., moderately halophilic bacteria isolated from saline water // Internal J. Systematic and Evolutionary Microbiology. 2007. V. 57. P. 675-681.
21. Romano I., Giordano A., Lama L., Nicolaus B. and Gamba-corta A. Halomonas campaniensis sp. nov., a haloalka-liphilic bacterium isolated from a mineral pool of Campania Region, Italy // Systematic and Applied Microbiology. 2005. V. 28. P. 610-618.
22. Wang Y. N., Cai H„ Yu S. L„ Wang Z. Y„ Liu J. and Wu X. L. Halomonas gudaonensis sp. nov., isolated from a saline soil contaminated by crude oil // Internal J. Systematic and Evolutionary Microbiology. 2007. V. 57. P. 911-915.
23. Baumann L., Bowditch R. D. and Baumann P. Description of Deleya gen. nov. created to accommodate the marine species Alcaligenes aestus, A. pacificus, A. cupidus, A. venustus and Pseudomonas marina II Internal J. Syst. Bacterid. 1983. V. 33. P. 793-802.
24. Quesada E., Ventosa A., Ruiz-Berraquero F. and Ramos-Cormenzana A. Deleya halophila, a new species of moderately halophilic bacteria // International Journal of Systematic Bacteriology. 1984. V. 34. P. 287-292.
25. Akagawa M. and Yamasato K. Synonymy oí Alcaligenes aquamarinus, Alcaligenes faecalis subsp. homari, and Deleya aesta\ Deleya aquamarina comb. nov. as the type species of the genus Deleya II Internal J. Systematic Bacteriology. 1989. V. 39. P. 462466.
26. Fendrich C. Halovibrio variabilis gen. Nov. sp. Nov., Pseudomonas halophilia sp. nov. and a new halopilic aerobic Coccoid Eubacterium from Great Salt Take Utah, USA // Syst Appl Microbiol. 1988. V. 11. P. 36-43.
27. Franzmann P. D., Burton H. R. and McMeekin T. A. Halomonas subglaciescola, a new species of halotolerant bacteria isolated from Antarctica // Internal J. Syst. Bacterid. 1987. V. 37. P. 27-34.
28. Hebert A. M. and Vreeland R. H. Phenotypic comparison of halotolerant bacteria: Halomonas halodurans sp. nov. nom. rev. comb. nov. //Internal J. Syst. Bacteriol. 1987. V. 37. P. 347-350.
29. James S. R., Dobson S. J., Franzmann P. D. and McMeekin T. A. Halomonas meridiana, a new species of extremely halotolerant bacteria isolated from antarctic saline lakes // Systematic and Applied Microbiology. 1990. V. 13. P. 270278.
30. Kaye J. Z., Márquez M. C., Ventosa A. and Baross J. A. Halomonas neptunio sp. nov., Halomonas sulfidaeris sp. nov., Halomonas axialensis sp. nov. and Halomonas hydro-thermalis sp. nov.: Halophilic bacteria isolated from deep-sea hydrothermal-vent environments // International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 2004. V. 54. P. 499-511.
31. Quillaguaman J., Hatti-Kaul R., Mattiasson B., Alvarez M. T. and Delgado O. Halomonas boliviensis sp. nov., an alkalitolerant, moderate halophile isolated from soil around a Bolivian hypersaline lake // Internal J. Systematic and Evolutionary Microbiology. 2004. V. 54. P. 721-725.
32. (http://rdp.cme.msu.edu/).
(NCMB 1971(Т)) // Internal J. Systematic Bacteriology. 1990. V. 40. P. 462-463.
33. Okamoto Т., Taguchi H, Nakamura K., Ikenaga H., Kurai-shi H. and Yamasato K. Zymobacter palmae gen. nov. sp. nov., a new ethanol-fermenting peritrichous bacterium isolated from palm sap // Archives of Microbiology. 1993. V. 160. P. 333-337.
34. Lee J. C., Jeon С. O., Lim J. M, Lee S. M, Lee J. M, Song S. M, Park D. J., Li W. J. and Kim C. J. Halomonas taeanensis sp. nov., a novel moderately halophilic bacterium isolated from a solar saltern in Korea // Internal J. Systematic and Evolutionary Microbiology. 2005. V. 55. P. 20272032.
35. Ананьина Л.Н., Плотникова Е.Г., Гавриш Е.Ю., Демаков В.А., Евтушенко JI.H. Salinicola socius gen. nov., sp. nov. - умеренно галофнльная бактерия из ассоциации микроорганизмов, утилизирующей нафталин // Микробиология. 2007. Т. 76. № 3. С. 369 - 376.
36. Dobson S. J., James S. R., Franzmann P. D. andMcMeekin T. A. Emended description of Halomonas halmophila
37. Quesada E., Valderrama M. J., Bejar V., Ventosa A., Gutierrez M. C., Ruiz-Berraquero F. and Ramos-Cormenzana A. Volcaniella eurihalina gen. nov. sp. nov., a moderately halophilic nonmotile gram-negative rod // Internal J. Systematic Bacteriology. 1990. V. 40. P. 261-267.
38. Dobson S. J. and Franzmann P. D. Unification of the genera Deleya (Baumann et al., 1983), Halomonas (Vreeland et al., 1980), and Halovibrio (Fendrich, 1988) and the species Paracoccus halodenitrificans (Robinson and Gibbons, 1952) into a single genus Halomonas and placement of the genus Zymobacter in the family Halomonadaceae // Internal J. Systematic Bacteriology. 1996. V. 46. P. 550-558.
39. Heyrman J., Balcean A., De Vos P. and Swings J. Halomonas muralis sp. nov., isolated from microbial biofilms colonizing the walls and murals of the Saint-Catherine chapel (Castle Herberstein, Austria) // Internal J. Systematic and Evolutionary Microbiology. 2002. V. 52. P. 2049-2054.
HALOALKALIPHILIC DENITRIFIERS 'HALOMONAS NITRITOFILUS' FROM SODA LAKES BURYATIYA
© 2011 E.A.Semenova, E.A.Gilvanova, N.G.Usanov
The directed screening of denitrifying gram-negative bacteria, phenotypically similar to bacteria of the genus Halomonas is carried out. Isolates differ from the "classical" Halomonas in pH range for growth (7.0 - 11.0) and rates of denitrification exceeding the known values is several times greater, and in resistance to high concentrations of sodium nitrite and ability to reduce very low starting concentrations of nitrite ion in alkaline conditions. Phylogenetic analysis of 16S rRNA gene obtained isolates identified them as belonging to an amorphous group III phylogenetic ("un-grouped" Halomonas) with the level of similarity of 93-98%. The isolates formed two compact clusters within this group with high levels of similarity of 97-100%) and similar phenotypic properties. Nominees for a new species of Halomonas nitritophilus' have been proposed in each cluster.
Key words: Halomonas, denitrification, nitrite.
Ekaterina Semenova, Candidate of Biology,
e-mail: sea@anrb.ru; Elena Gilvanova, Candidate of Biology,
e-mail: gelena@anrb.ru; Nikolay Usanov, Candidate of Biology.
