CC BY
79
ВЕСТНИК ПЕРМСКОГО УНИВЕРСИТЕТА
2013 БИОЛОГИЯ Вып. 3
МИКРОБИОЛОГИЯ
УДК57.065, 579.262,631.472.74,582.6/.9,58.051
ФИЛОГЕНЕТИЧЕСКОЕ РАЗНООБРАЗИЕ БАКТЕРИЙ, ВЫДЕЛЕННЫХ ИЗ РИЗОСФЕРЫ МАРИ КРАСНОЙ (CHENOPODIUMRUBRUM L.), ПРОИЗРАСТАЮЩЕЙ В УСЛОВИЯХ ЗАСОЛЕНИЯ НА ТЕРРИТОРИИ СОЛЕРАЗРАБОТОК (г. СОЛИКАМСК, ПЕРМСКИЙ КРАЙ)
Е. С. Корсаковаa, А. А. Пьянковаa, А. В. Назаровab
a Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, 614081, Пермь, Голева,13; [email protected] b Пермский государственный национальный исследовательский университет, 614990, Пермь, ул. Букирева, 15; [email protected]; (342)2808431
В ризосфере мари красной (Chenopodium rubrum L.), произрастающей в районе промышленных солеразработок (г. Соликамск, Пермский край), выявлено большое разнообразие бактерий различных филогенетических групп. Значительный массив прокариот представлен гра-мотрицательными умеренно галофильными бактериями класса Gammaproteobacteria, а также грамположительными галотолерантными бактериями класса Actinobacteria. Кроме того, в образцах ризосферы обнаружены бактерии класса Bacilli филума Firmicutes и класса Flavobacteriia филума Bacteroidetes.
Ключевые слова: засоленные почвы; ризосфера; бактерии; филогенетическое разнообразие;
ген 16S рРНК.
Введение
Засоление почвы является очень важным экологическим фактором из-за его сильного воздействия на продуктивность растений, достаточно широкой распространенности и тенденции к расширению площади почв с увеличенной минерализацией, в том числе и вследствие антропогенного воздействия. Однако, несмотря на рост количества работ по изучению биоразнообразия бактерий засоленных почв и увеличивающийся интерес к галофиль-ным микроорганизмам в связи с их потенциальной важностью для биотехнологии, микробные сообщества данных почв остаются недостаточно изученными. Особенно слабо исследовано биоразнообразие бактерий ризосферы растений, произрастающих на засоленных почвах.
На территории Пермского края засоление почв носит техногенный характер и обусловлено, прежде всего, добычей солей на Верхнекамском месторождении. При промышленной добыче и переработке солей этого месторождения на поверхности складируются отходы производства в шламохрани-лищах и галитовых отвалах, содержание хлорида
натрия в которых составляет более 90% [Бабошко, Бачурин, 2009]. Растворение материала отвалов и вынос солей приводят к появлению зон засоления, а в понижениях, прилегающих к подножью, образуются озера с соленой водой (рассолосборники), в которых происходит осаждение солей [Шубин, 2005]. Таким образом, на территории солеразработок формируются местообитания для бактерий, устойчивых к высокой минерализации среды.
Целью настоящей работы было изучение бактериального сообщества ризосферы растений вида марь красная (Chenopodium rubrum L.), которые преобладали в травяном покрове на наиболее засоленных участках территории района промышленных разработок Верхнекамского месторождения солей в (г. Соликамск, Пермский край).
Материалы и методы исследования
В качестве материалов исследования были отобраны почвенные образцы с трех участков, расположенных в районе разработок Верхнекамского месторождения калийно-магниевых солей Пермского края в окрестностях г. Соликамска, Россия. Участки
© Корсакова Е. С., Пьянкова А. А., Назаров А. В., 2013
47
расположены в непосредственной близости от двух солеотвалов ОАО «Уралкалий» (г. Соликамск) и имеют засоленную почву. Образцы ризосферы растений мари красной (Chenopodium rubrum L.) отбирались с использованием стандартных методов [Методы почвенной ..1991].
Определение содержания катионов Na+ осуществляли из водной вытяжки, приготовленной согласно ГОСТу 26423-85, с последующей их детекцией на атомно-абсорбционном спектрофотометре АА-6300 (“Shimadzu”, Япония), сотрудниками группы физико-химических исследований ИЭГМ УрО РАН.
В работе использовали богатую среду Раймон-да/БСР (г/л): NH4NO3 - 2, MgSO4 x 7H2O - 0.2, KH2PO4 - 2, Na2HPO4 - 3, Na2TOs - 0.1, CaCl2 x 6H2O - 0.01 с добавлением 5 г/л триптона и 2.5 г/л дрожжевого экстракта [Raymond, 1964]. NaCl вносили в среду до конечной концентрации 50 г/л. Для получения агаризованных сред вносили агар («Sigma», США) 15 г/л. Микробиологический анализ ризосферы растений проводили общепринятыми методами посева почвенной суспензии на ага-ризованную среду с последующим подсчетом колоний микроорганизмов (колонии образующих единиц, КОЕ) и выделением бактерий из единичных колоний для идентификации [Методы почвенной ..., 1991].
Для выделения галофильных штаммов бактерий был использован метод накопительного культивирования на БСР с содержанием NaCl 150 г/л. Образцы ризосферы весом 1 г были помещены в 250 мл колбы с 100 мл БСР с содержанием NaCl 150 г/л. Инкубацию проводили в течение 2 недель на термокачалке (100 об/мин.) при температуре
282. Из накопительных культур путем высева на агаризованную БСР (концентрация соли составляла 150 г/л) выделяли чистые культуры микроорганизмов.
Амплификацию фрагмента гена 16S рРНК проводили с использованием бактериальных праймеров прямого 27F и обратного 1492R согласно описанной методике [Молекулярная генетика, 2007].
Филогенетический анализ полученных изолятов был основан на определении нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК с применением набора реактивов Big Dye Terminator Cycle Sequencing Kit на автоматическом секвенаторе Genetic Analyser 3500XL («Applied Biosystems», США) в Пермском государственном национальном исследовательском университете. Полученные нуклеотидные последовательности длиной около 800 пн были проанализированы с использованием программ CLUSTAL W, Sequence Scanner v1.0. Поиск гомологичных последовательностей проводили по базам данных GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) и EzTaxon (http : //www. eztaxon. org ).
Результаты и обсуждение
Методом прямого высева на агаризованную БСР с содержанием NaCl 50 г/л из образцов ризосферы, отобранных из района солеразработок ОАО «Уралкалий» (г. Соликамск), было выделено 14 морфотипов бактерий, отличающихся морфологическими признаками (табл. 1). Отмечено негативное влияние засоления почвы на численность бактерий в ризосфере. Так, общая численность бактерий в ризосферной зоне растений, произрастающих на почве с содержанием Na+ - 5.18 и 1.24 мг-экв/100 г общая численность бактерий была меньше, чем на почве с концентрацией Na+ - 0.56 мг-экв/100 г в 5,2 и 18,0 раз, соответственно.
Таблица 1
Штаммы бактерий, выделенные из ризосферы мари красной, произрастающей на территории « солеразработок ОАО «Уралкалий» (г. Соликамск)
№ площадки Место отбора растений і Штаммы, выделенные на БСР, 50 г/л NaCl Описание морфологии колоний (морфотип) о Ü
À M105-1 Бледно-желтая, круглая, гладкая, блестящая, профиль выпуклый, край ровный, структура однородная, 1 мм 2l 106
1 10 м от со- 0.56 M106-5 Красно-оранжевая, круглая, гладкая, блестящая, профиль плоский, край ровный, структура однородная, 3 мм 11107
леот-вала СКПРУ-2 M107-2 Желтая, круглая, гладкая, блестящая, профиль выпуклый, край ровный, структура однородная, 1 мм 11107
M107-4 Темно-белая, круглая, складчатая, матовая, профиль плоский, край ровный, структура мелкозернистая, 8 мм 51107
M115-1 Бело-розовая, круглая, гладкая, блестящая, профиль каплевидный, край ровный, структура однородная, 1 мм 21105
2 5 м от со- 5.18 M115-3N-a Бежевая, круглая, гладкая, блестящая, профиль выпуклый, край ровный, структура однородная, 5 мм 1.51106
СКПРУ-2 M116-2 Желтая, круглая, гладкая, блестящая, профиль плоский, край ровный, структура однородная, 1,5 мм 41106
M116-3 Бежевая, круглая, гладкая, блестящая, профиль плоский, край ровный, структура однородная, 6 мм 41106
Окончание табл. 1
№ площадки Место отбора растений и о н о и Ком Штаммы, выделенные на БСР, 50 г/л NaCl Описание морфологии колоний (морфотип) Численность бактерий, КОЕ/1 г почвы
M116-4 Светло-розовая, круглая, гладкая, блестящая, профиль плоский, край ровный, структура однородная, 3 мм 11106
M116-7 Светло-оранжевая, круглая, гладкая, блестящая, профиль плоский, край ровный, структура однородная, 1 мм 2l 106
M116-8 Светло-розовая, круглая, гладкая, блестящая, профиль плоский, край ровный, структура однородная, 2,5 мм 11106
10 м от M136-2 Темно-белая, круглая, гладкая, матовая, профиль выпуклый, край зубчатый, структура однородная, 2 мм 11106
3 со- леот-вала 1.24 M136-3 Светло-желтая, круглая, гладкая, матовая, профиль выпуклый, край зубчатый, структура однородная, 1,5 мм 11106
СКПРУ-1 M136-7 Темно-желтая, круглая, гладкая, блестящая, профиль выпуклый, край ровный, структура однородная, 1 мм 21106
Методом накопительного культивирования на БСР с содержанием соли 150 г/л был изолирован единственный штамм МН13И2-2 из образца ризосферы (№+1.24 мг-экв/100 г), отобранного на расстоянии 10 м от солеотвала СКПРУ-1. Данный штамм был представлен бесцветными блестящими прозрачными колониями округлой формы, размером 1-2 мм, с гладкой поверхностью, плоским профилем, ровным краем и однородной структурой.
У изолированных штаммов были определены нуклеотидные последовательности фрагмента гена 16S рРНК (табл. 2). Установлено, что исследуемые бактерии принадлежат классам Gammaproteo-bacteria филума Proteobacteria (рода Salinicola,
Анализ нуклеотидных последовательностей
Kushneria, Halomonas, Marinobacter, Idiomarina), Actinobacteria филума Actinobacteria (рода Isoptericola, Microbacterium, Salinibacterium), Bacilli филума Firmicutes (рода Bacillus, Planomicrobium) и Flavobacteriia филума Bacteroidetes (род Salegentibacter). При этом подавляющее
большинство типовых штаммов бактерий, к которым наиболее близки по нуклеотидным последовательностям фрагмента гена 16S рРНК выделенные штаммы, являются галотолерантными или гало-фильными бактериями. Исключение составляет Microbacterium phyllosphaerae DSM 13468T, обитающий на поверхности побегов злаковых растений [Behrendt, Ulrich, Schumann, 2001].
Таблица 2
генов 16S рРНК изолированных бактерий
Идентификация на основе анализа гена 16S рРНК
Штамм Типовой штамм № GenBank Сходство, % Количество нуклеотидов
M105-1 Salinicola salarius M27T AM229316 99.3 1346
M106-5 Kushneria marisflavi SW32T AF251143 98.6 1386
M107-2 Microbacterium phyllosphaerae DSM 13468T AJ277840 100 764
M107-4 Bacillus safensis FO-036bT AF234854 99.9 834
M115-1 Bacillus hwajinpoensis SW-72T AF541966 99.7 782
M115-3Na Halomonas titanicae BH1T FN433898 98.9 1405
M116-2 Microbacterium terricola KV-448T AB234025 98.8 1294
M116-3 Halomonas taeanensis BH539T AY671975 99.3 1377
M116-4 Planomicrobium flavidum ISL-41T FJ265708 99.1 736
M116-7 Salegentibacter salarius ISL-6T EF486353 99.1 789
M116-8 Marinobacter maritimus CK47T AJ704395 97.8 1343
M136-2 Isoptericola chiayiensis 06182M-1T FJ469988 99.1 1291
M136-3 Isoptericola halotolerans YIM 70177T AY789835 99.2 779
M136-7 Salinibacterium amurskyense KMM 3673T AF539697 99.8 863
MH13R2-2 Idiomarina loihiensis L2TRT AF288370 100 833
Заключение
В ризосфере растений, произрастающих на площадке № 1, доля выделенных бактерий, относящихся к классу Gammaproteobacteria, составляла 16.7% общей численности, на площадках 2 и 3 - 47.4 и 50.0%, соответственно. Для выделенных бактерий, принадлежащих к классу Actinobacteria, данный показатель составлял 13.9, 29.2 и 50.0%, соответственно. Бактерии класса Bacilli были выделены из ризосферы растений с площадок № 1 и 2, доля данных бактерий составляла 69.4 и 8.8%, соответственно. Из ризосферы растений участка № 2 были выделены бактерии, относящиеся к классу Flavobacteriia, доля от общей численности которых была 14.6%.
Известно, что в ризосфере растений гумидного климата доминируют бактерии рода Pseudomonas (класс Gammaproteobacteria), кроме того, для ризо-сферной зоны типичны бактерии родов Agrobacterium (класс Alphaproteobacteria),
Xanthomonas (класс Gammaproteobacteria) и Flavobacterium (класс Flavobacteriia) [Звягинцев, Добровольская, Лысак, 1993], при этом доля бацилл и актиномицетов невысока и составляет обычно около 1% [Юрчак, Утеуш, Омельченко, 1977; Калакуцкий, Шарая, 1990]. Высокая численность бактерий, принадлежащих к классам Actinobacteria и Bacilli, отмечена для ризосферы растений, произрастающих в пустынях, при этом доля данных бактерий возрастет в течение сухих периодов [Marasco et al., 2012; Kavamura et al., 2013].
Таким образом, установлено, что техногенное засоление почвы в окрестностях г. Соликамска оказывает сильное влияние на микробное сообщество ризосферной зоны растений вида марь красная (Chenopodium rubrum L.), приводящее к развитию галотолерантных и галофильных бактерий, а также в увеличении доли бактерий классов Actinobacteria и Bacilli в ризосферной зоне. Отмечено негативное влияние засоления почвы на численность бактерий в ризосфере.
Работа поддержана грантом РФФИ Урал № 1304-96048 «Изучение механизмов функционирования микробно-растительных систем в условиях засоления почвы».
Библиографический список
Бабошко А.Ю., Бачурин Б.А. Тяжелые металлы в
отходах калийной промышленности // Горный
информационно-аналитический бюллетень. 2009. № 5. С. 369-376.
ГОСТ 26423-85. Почвы. Методы определения удельной электрической проводимости, pH и плотного остатка водной вытяжки. М., 1985.
Звягинцев Д.Г., Добровольская Т.Г., Лысак Л.В. Растения как центры формирования бактериальных сообществ // Журнал общей биологии. 1993. Т. 54, № 2. С. 183-199.
Калакуцкий Л.В., Шарая Л.С. Актиномицеты и высшие растения // Успехи микробиологии.
1990. Т. 24. С. 26-65.
Методы почвенной микробиологии и биохимии: учеб. пособие / под ред. Д. Г. Звягинцева. М.,
1991. 304 с.
Молекулярная генетика: учеб.-метод. пособие / под ред. С.В. Боронниковой. Пермь, 2007. 150 с.
Шубин А.А. Решение экологических проблем на заключительной стадии функционирования горного предприятия // Горный информационно-аналитический бюллетень. 2005. № 11. С. 168-173.
Юрчак Л.Д., Утеуш Ю.А., Омельченко Т.В. Микрофлора и аллелопатические способности растений семейства крестоцветных // Взаимодействие растений и микроорганизмов в фитоценозах. Киев, 1977. C. 161-167.
Behrendt U., Ulrich A., Schumann P. Description of Microbacterium foliorum sp. nov. and Microbacterium phyllosphaerae sp. nov., isolated from the phyllosphere of grasses and the surface litter after mulching the sward, and reclassification of Aureobacterium resistens (Funke et al. 1998) as Microbacterium resistens comb. nov. // International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 2001. Vol. 51. P. 1267-1276.
Kavamura V. et al. Water Regime Influences Bulk Soil and Rhizosphere of Cereus jamacaru Bacterial Communities in the Brazilian Caatinga Biome // PLoS ONE. 2013. Vol. 9, № 8. P. 1-10.
Marasco R. et al. A Drought Resistance-Promoting Microbiome Is Selected by Root System under Desert Farming // PLoS ONE. 2012. Vol. 10, № 7. P. 1-14.
Raymond R.L. Microbial oxidation of n-paraffinic hydrocarbons // Develoments in Industrial Microbiology. 1961. Vol. 2, № 1. P. 23-32.
Поступила в редакцию 18.10.2013
Phylogenetic diversity of bacteria isolated from rhizosphere Chenopodium rubrum L., growing in saline conditions on the salt deposit area (Solikamsk, Perm region)
E. S. Korsakova, junior researcher A. A. Pyankova, technician
Institute of Ecology and Genetics of Microorganisms UrB RAS, 13, Goleva str., Perm, Russia, 614081, [email protected]
A. V. Nazarov, candidate of biology, senior researcher, associate professor Institute of Ecology and Genetics of Microorganisms UrB RAS, 13, Goleva str., Perm, Russia, 614081, [email protected]; (342)2808431 Perm State University. 15, Bukirev str., Perm, Russia, 614990
In the rhizosphere of plants Chenopodium rubrum L., growing in the area of industrial salt deposit (Solikamsk, Perm region) have identified a large variety of bacteria of different phylogenetic groups. A substantial body of prokaryotes represented by Gram-negative moderately halophilic bacteria class Gammaproteobacteria, as well as Gram-positive bacteria halotolerant class Actinobacteria. In addition, samples of rhizosphere bacteria detected class Bacilli class and phylum Firmicutes Flavobacteriia phylum Bacteroidetes.
Key words: saline soil; rhizosphere bacteria; phylogenetic diversity; 16S rRNA gene.
Корсакова Екатерина Сергеевна, младший научный сотрудник Пьянкова Анна Александровна, инженер
ФГБУН Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН
Назаров Алексей Владимирович, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник, доцент ФГБУН Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН
ФГБОУВПО «Пермский государственный национальный исследовательский университет»
