CC BY
25
Б1ОЛОГ1Я
УДК 571.27
12Довгий Р. С., 1Ск'шка Л. М.
ФУНКЦЮНАЛЬНИЙ СТАН АЛЬВЕОЛЯРНИХ МАКРОФАГ1В ТА НЕЙТРОФ1Л1В К1СТКОВОГО МОЗКУ МИШЕЙ Р1ЗНОГО В1КУ
1Навчально-науковий центр «1нститут бюлогГГ» при КиГвському нацiональному унiверситетi iM. Тараса Шевченка (м. КиГв) 2Державна установа «1нститут геронтологи iM. Д.Ф. Чеботарьова НАМН УкраГни» (м. КиГв)
roman_dovhyi@univ.kiev.ua
Стаття е фрагментом НДР «Механiзми регуляци метаболiчних процесiв в органiзмi за умов розви-тку патологiчних стаыв», № державно! реестрацiI 16БФ036-01.
Вступ. Старiння розглядаеться як комплексний процес, при якому порушуеться функцiонування уЫх систем органiзму [20]. Ефективнiсть роботи iмунноI системи також знижуеться з вком. Це су-проводжуеться пщвищенням частоти виникнення злоякiсних новоутворень та Ыфекцмних захворю-вань рiзноI етюлоги, зростае ризик розвитку ауто-iмунних хвороб [7]. Останнiм часом особлива увага у до^дженнях вiкових змш iмунноI системи нада-еться кл^инам вродженого (неспецифiчного) iму-нiтету, серед яких важливу роль в розвитку вкових порушень вiдiграють фагоцити. Старшня супрово-джуеться порушеннями у функцюнуваны фагоцитiв [18].
Однак, данi стосовно вкових особливостей функцюнального стану фагоци^в рiзних популяцiй i рiзноI локалiзацiI у лiтературi нечисленнi i носять суперечливий характер. Зокрема, вщсутня едина думка щодо вiкових змiн ендоцитарно! активностi та оксидативного метаболiзму - ключових функцiй фагоцитiв, залучених у протипухлинну резистент-нiсть та антишфекцмний захист органiзму [18,32]. Бiльшiсть авторiв констатують зниження метабо-лiчноI активной фагоцитiв з вiком. Однак, резуль-тати деяких дослiдницьких груп вказують на те, що при старты пщвищуеться стiйкiсть органiзму до окремих шфекцмних агентiв завдяки перебудовi метаболiзму фагоцитiв [27].
Виключне значення для пщтримання iмунного гомеостазу, у тому чи^ й з вiком, мають тканиннi фагоцити [13]. Вiдомо, що фагоцити рiзних тканин вiдрiзняються за походженням. Бiльшiсть тканин-них макрофапв мають ембрiональне походження i в нормi не потребують трансмiграцiI моноци^в з кiсткового мозку в тканини для пщтримання свое! юлькост [9]. В окремих тканинах пул макрофапв пщтримуеться за рахунок постмного надходжен-ня i диференцiювання циркулюючих моноци^в [5,21]. Крiм того, дендритнi кгнтини та нейтрофiли, якi також е резидентними фагоцитами багатьох тканин, мають юстковомозкове походження [8].
Linehan et al. (2014) виявили порушення фагоцитозу макрофапв ембрюнального походження мишей з вiком. При цьому у макрофапв, що диференцю валися з моноци^в кiсткового мозку автори не спо-стерiгали таких порушень [19]. Ц данi свiдчать про те, що онтогенез фагоцитуючих клiтин може вщ-гравати важливу роль у розвитку '¡хых вiкових змiн.
Мета дослгдження: порiвняти оксидативний метаболiзм та фагоцитарну активнють тканинних макрофагiв ембрюнального походження (альвео-лярних макрофагiв [14]) та нейтроф^в кiсткового мозку.
Об'ект i методи дослгдження. У дослщах ви-користовували молодих (2-3 мiс.) та старих (18-23 мiс.) мишей-сам^в лiнiI C57/B6 з вiварiю ДУ Институт геронтологiI iм. Д.Ф. Чеботарьова НАМН Укра!-ни». Тварин утримували в умовах втьного доступу до води та корму.
Експерименти виконан з дотриманням вимог бвропейсько! конвенци про захист хребетних тварин, що використовуються для дослщних та iнших наукових цiлей, (Страсбург, 1986) та Закону Укра1-ни «Про захист тварин вщ жорстокого поводження» (2006).
Нейтрофiли видiляли з юсткового мозку центри-фугуванням у градieнтi щiльностi перколу. Стегно та гомшку видiляли з дотриманням правил асептики, стерилiзували у 70% етиловому спирт^ i промивали 3 рази у DPBS (Sigma, США). Обережно вiдрiзали епiфiзи, кiстковомозкову порожнину промивали 5 мл HBSS (Thermo Fisher Scientific, США) i фтьтру-вали через нейлоновий фтьтр (70 мкм). Лейкоци-ти нашаровували на 62% розчин перколу (Sigma, США) у стввщношены 1:1. Центрифугували при 1200 g протягом 30 хвилин. Пiсля центрифугуван-ня, нейтрофiли збирали з-пiд шару 62% перколу, i вiдмивали DPBS [22]. Отриман клiтини ресуспен-дували, пщраховували в камерi Ньюбауера, 1x106 кл™н на одну пробу використовували для оцшки продукцiI РФК та фагоцитарно! активной.
Для отримання альвеолярних макрофапв стерильно видтяли леген en bloc (разом з трахеею), залишки кровi вiдмивали охолодженим Ca++/Mg++-free PBS (Ca++/Mg++-free phosphate buffer solution). Леген тричi промивали 1 мл DPBS з 1 мМ ЕДТА за
допомогою iнсулiнового шприца. Отриманий брон-хоальвеолярний лаваж центрифугували при 400 g протягом 10 хвилин. Супернатант видаляли, альве-олярнi макрофаги вщмивали DPBS, ресуспендува-ли, пiдраховували в камерi Ньюбауера. 2x105 клiтин на одну пробу використовували для оцшки продук-L^iT РФК та фагоцитарно! активност [11].
Внтурiшньоклiтинну продукцiю реактивних форм кисню (РФК) оцiнювали методом проточно! цитометри [34]. У пробiрки для проточно! цитометри додавали клiтини у потрiбному об'емг В контрольну пробiрку до суспензи клiтин додавали 30 мкл DPBS. В дослщы пробiрки вносили 4,2 мкл робочого розчину дихлорофлюоресцеТну (Sigma, США) та 25,8 мкл DPBS, перемшували. Пробiрки iнкубували упродовж 30 хвилин при 37C, пiсля чого кл^ини центрифугували при 250 g протягом 5 хв. i вщмивали центрифугуванням у 2 мл охолодженого DPBS з додаванням 0,02% EDTA. Зразки фiксували в 400 мкл DPBS-EDTA з 0,04% параформальдегщу, аналiз проводили на проточному цитофлюориме-трi (FACSAria Cell Sorter, BD Biosciences, США) по каналу флуоресценци FL1. Оцшювали вiдсоток кл^ тин, як продукували РФК, а також середню штен-сивнiсть флуоресценци (MFI) на юлькють клiтин, що вiдображаe рiвень внутрiшньоклiтинноT продукци РФК.
Фагоцитарну активнiсть альвеолярних макро-фагiв та нейтрофiлiв також оцшювали методом проточно! цитометри [6]. У пробiрки для проточно! цитометри додавали кл^ини у потрiбному об'емг В контрольну пробiрку до суспензи кл™н додавали 30 мкл DPBS. В дослщы пробiрки вносили 10 мкл суспензи мiченого флюоресце!н-5-iзотiоцiанатом Staphylococcus aureus Cowan (200 млн/мл) та 20 мкл DPBS, перемшували. Пробiрки Ыкубували упродовж 30 хвилин при 37C, пiсля чого клiтини центрифугували при 250 g протягом 5 хв. i вщмивали центрифугуванням у 2 мл охолодженого DPBS з додаванням 0,02% EDTA. Зразки фксували в 400 мкл DPBS-EDTA з 0,04% параформальдегщу, ана-лiз проводили на проточному цитофлюориметрi по каналу флуоресценци FL1. Результати представляли як вщсоток фагоцитуючих кгитин (фагоцитарне число) i фагоцитарний шдекс (Ф1), котрий визнача-ли за формулою:
[Gmean / P ] - [Gmean / P ],
L pos pos J L neg' negJ!
де Ppos - вщсоток позитивних (флюоресцiюючих) клiтин у дослщнм пробi, Gmeanpos - середня флюо-ресценцiя позитивних клiтин у дослщнм пробi, Pneg - вщсоток позитивних кттин у пробi негативного контролю, Gmeanneg - середня флюоресцен^я негативного контролю.
Статистичний аналiз результатiв проводили за допомогою притерт Стьюдента. Данi представ-ленi як середы значення (M) та стандартна помил-ка середнього (SE).
Результати дослщження та 'Гх обговорення. Фагоцитоз е важливим iмунобiологiчним процесом, який бере участь у виконанн рiзноманiтних функцiй
оргаызму [12]. Ендоцитарна активнють резидент-них фагоцитiв тканин необхщна для !х реконструк-L^iT i для пiдтримання гомеостазу [25]. Фагоцитоз вщграе також ключову роль у протимiкробному за-хистi, оскiльки вш потрiбен як для безпосереднього знищення мiкроорганiзмiв професiйними фагоцитами, так i для iнiцiацiT адаптивно! iмунно! вщпови дi за рахунок презентаци ендоцитованих антигенiв дендритними клiтинами [17].
За результатами наших до^джень спостер^ галося достовiрне зниження фагоцитарного числа альвеолярних макрофапв у старих мишей (p=0,019) (рис. 1А). Разом з тим, цей показник статистично вiрогiдно не в^^знявся у кiстковомозкових ней-трофiлiв, отриманих вiд тварин рiзного вiку (рис. 1Б). Також не спостер^алося достовiрноT рiзницi фагоцитарного шдексу як альвеолярних макрофа-гiв, так i нейтрофiлiв вiд мишей рiзного вiку (рис. 2). Wong et al. (2017) виявили у старих мишей ^е! ж лiнiT достовiрно нижчий вiдсоток альвеолярних макрофагiв, що фагоцитували апоптизован ней-трофiли та мiченi часточки, порiвняно з молодими тваринами [33]. Ц данi пщтверджують результати
наших експериментiв. Крiм того, у вищенаведено-му дослiдженнi також виявлено зниження експреси скавенджер рецептора CD204 у альвеолярних ма-
крофапв з вком. Вщомо, що цей рецептор здатен розтзнавати бактерiальнi лканди [15], i порушен-ня його експреси при старты може бути причиною зниження фагоцитарного числа альвеолярних макрофапв старих тварин у нашому експериментг Рис. 1. Фагоцитарне число альвеолярних макрофапв (А) та нейтроф^в (Б), отриманих вщ мишей рiзного вту. Мф — альвеолярш макрофаги, Нф — нейтрофiли. *р=0,019. Рис. 2. Фагоцитарний iндекс альвеолярних макрофагiв (А) та нейтрофiлiв (Б), отриманих вщ мишей рiзного вту. Мф — альвеолярнi макрофаги, Нф — нейтрофiли.
МР! — середня штенсившсть флуоресценцГГ.
Синтез РФК е невiд'eмним компонентом проти-мiкробного захисту фагоци^в. Показано, що окрiм
безпосереднього токсичного впливу на микробы кттини, РФК здатнi мобiлiзувати шин протимкроб-нi механiзми завдяки 1хый дИ в якостi вторинних ме-сенджерiв клiтинного сигналiнгу [2,35]. РФК задiянi в активацiI мiграцiI фагоци^в, регуляцiI 1х дифе-ренцiювання i фагоцитарно! активностi. Посилення синтезу РФК може супроводжуватися загибеллю фагоцитiв завдяки апоптогеный дИ реактивних кис-невих метаболтв [29].
Оксидативний метаболiзм фагоци^в обох до-слiджених нами популяцм змiнювався з вiком. Вiдсоток кжтин, що продукували РФК, достовiрно зменшувався у популяцiI альвеолярних макрофа-пв, отриманих вiд старих мишей (р=0,025) (рис. 3А). Також спостерiгалася тенден^я до зниження цього показника у нейтроф^в, отриманих вiд старих тварин (р=0,056) (рис. 3Б). На рiвнi тенденцi,i зареестровано незначне посилення синтезу вну-трiшньоклiтинних РФК альвеолярними макрофагами старих тварин. Натомють, не виявлено вкових змiн рiвня продукцiI РФК нейтрофiлами (рис. 4).
Дан стосовно вiкових змiн продукци РФК альвеолярними макрофагами мишей у лiтературi вщ-сутнi. Однак, Тава1 е1 а1. (2013) виявлено зниження вщсотку альвеолярних мононуклеарних фагоци^в, що продукують РФК, у старих щурiв [30]. Це дозво-ляе зробити припущення, що виявленi нами вiковi змiни тканинних фагоцитiв легень не е видоспеци-фiчними.
Як видно з отриманих нами результа^в, функ-цiональний стан нейтрофiлiв, отриманих з юстко-вого мозку, практично не вiдрiзняеться у молодих i старих тварин. Бiльшiсть даних, представлених у науковм лiтературi стосовно вкових змшах ней-трофiлiв, отриманi з використанням циркулюючих клiтин молодих та старих донорiв. Переважно цi ре-зультати вказують на порушення фагоцитозу ней-трофiлiв кровi людини при старты [4,32]. Разом з тим, показано вщсутнють порушень фагоцитарно! функци циркулюючих нейтрофiлiв мишей з вком [1,23]. Вiковi аспекти оксидативного метаболiзму нейтрофiлiв також дослiдженi, головним чином, з використанням циркулюючих кжтин. Результати цих до^джень доволi суперечливi. Окремi авто-ри вказують на збтьшення з вiком продукцiI РФК нейтрофтами периферично! кровi людини [16,31]. У нашому попередньому експериментi також було виявлено посилення продукци РФК полiморфно-ядерними фагоцитами селезшки старих мишей [1]. Деяк дослiдницькi групи наводять докази вщ-сутностi змiн [26], або нав^ь зниження утворення РФК циркулюючими нейтрофтами людини при старты [10]. Вщомо, що фенотип та морфолопя циркулюючих нейтроф^в змiнюються протягом !х-нього нетривалого життя, iз прозапальним зсувом метаболiзму внаслiдок «старшня» цих клiтин [3]. Нейтрофiли юсткового мозку е новим предметом активних до^джень у зв'язку з виявленням феномену !х медулярного депонування i клiренсу цих клiтин медулярними макрофагами [24,28]. Автори виявленого феномену висловлюють припущення,
що у юстковому мозку в умовах гомеостазу можуть накопичуватися як щойно диференцмоваы молодi, так i старiючi нейтрофти. Якi з них переважають поки що не встановлено. Це дозволяе висловити припущення, що вщсутнють статистично вiрогiдних вщмшностей у до^джених метаболiчних показни-ках кiстковомозкових нейтрофiлiв у тварин рiзного вiку в наших експериментах може зумовлюватися переважанням вщпрацьованих кжтин, якi шдля-гають кжренсу, незалежно вiд вiку тварин. Однак, висловлене припущення потребуе додаткових до-^джень.
■ - ■ ■
Рис. 3. Вщсоток альвеолярних макрофапв (А) та нейтрофiлiв (Б), отриманих вiд тварин рiзного вiку, що продукували реактивнi форми кисню (РФК). Мф — альвеолярнi макрофаги, Нф — нейтрофiли. *р=0,025.
Рис. 4. Продукцiя реактивних форм кисню альвеолярними макрофагами (А) та нейтрофтами (Б), отриманими вщ мишей рiзного вiку. Мф — альвеолярнi макрофаги, Нф — нейтрофти.
МР! — середня iнтенсивнiсть флуоресценцп.
Висновки. Зареестровано виразнi вiковi змiни у популяцiI альвеолярних макрофагiв, як проявля-лися зниженням вiдсотку кгнтин, що фагоцитува-ли мiчений стафтокок, та клiтин, що продукували РФК. Нейтрофти юсткового мозку старих мишей по до^джених метаболiчних показниках практично не вiдрiзнялися вiд вщповщних клiтин, отриманих вiд молодих тварин. Це вказуе на важливу роль тканинного мкрооточення старого оргаызму у роз-витку вiкових порушень фагоци^в.
Перспективи подальших дослiджень. Меха-нiзми розвитку порушень фагоцитiв при старЫы дослiдженi недостатньо. Iдентифiкацiя причинних факторiв, вiдповiдальних за розвиток цих порушень, е запорукою успшно! розробки етютропних терапевтичних пiдходiв для лкування захворювань у людей похилого вку.
81
.iTepaTypa
1. Dovgiy R.S. Funktsional'niy stan ta metabolichna polyarizatsiya makrofagiv selezinki starikh imunizovanikh mishey / R.S. Dovgiy, D.V. Shitikov, I.M. Pishel' [ta in.] // Probl. star. i dolgoletiya. - 2015. - № 24 (2). - S. 144-152.
2. Abais J.M. Redox regulation of NLRP3 inflammasomes: ROS as trigger or effector? / J.M. Abais, M. Xia, Y Zhang [et al.] // Antioxid. Redox Signal. - 2015. - Vol. 22 (13). - P. 1111-1129.
3. Adrover J.M. Aging: A temporal dimension for neutrophils / J.M. Adrover, J.A. Nicolas-Avila, A. Hidalgo // Trends Immunol. -2016. - Vol. 37 (5). - P. 334-345.
4. Alonso-Fernandez P. Neutrophils of centenarians show function levels similar to those of young adults / P. Alonso-Fernandez, M. Puerto, I. Mate [et al.] // J. Am. Geriatr. Soc. - 2008. - Vol. 56 (12). - P. 2244-2251.
5. Bain C.C. The monocyte-macrophage axis in the intestine / C.C. Bain, A.M. Mowat // Cell. Immunol. - 2014. - Vol. 291 (1-2). -P. 41-48.
6. Cantinieaux B. Staphylococcus aureus phagocytosis. A new cytofluorometric method using FITC and paraformaldehyde /
B. Cantinieaux, C. Hariga, P. Courtoy [et al.] // J. Immunol. Methods. - 1989. - Vol. 121 (2). - P. 203-208.
7. Castelo-Branco C. The immune system and aging: a review / C. Castelo-Branco, I. Soveral // Gynecol. Endocrinol. - 2014. -Vol. 30 (1). - P. 16-22.
8. De Kleer I. Ontogeny of myeloid cells / I. De Kleer, F. Willems, B. Lambrecht, S. Goriely // Front. Immunol. - 2014. - Vol. 5. - P. 423.
9. Epelman S. Origin and functions of tissue macrophages / S. Epelman // Immunity. - 2014. - Vol. 41 (1). - P. 21-35.
10. Fulop T. Signal transduction and functional changes in neutrophils with aging / T. Fulop, A. Larbi, N. Douziech [et al.] // Aging Cell. - 2004. - Vol. 3 (4). - P. 217-226.
11. Goncalves R. The isolation and characterization of murine macrophages / R. Goncalves, D.M. Mosser // Curr. Protoc. Immunol. - 2015. - Vol. 111.
12. Gordon S. Phagocytosis: an immunobiologic process / S. Gordon // Immunity. - 2016. - Vol. 44 (3). - P. 463-475.
13. Gordon S. Tissue macrophages: heterogeneity and functions / S. Gordon, A. Pluddemann // BMC Biology. - 2017. - Vol. 15. -P. 53.
14. Guilliams M. Alveolar macrophages develop from fetal monocytes that differentiate into long-lived cells in the first week of life via GM-CSF / M. Guilliams, I. De Kleer, S. Henri [et al.] // J. Exp. Med. - 2013. - Vol. 210 (10). - P. 1977-1992.
15. Kelley J.L. Scavenger receptor-A (CD204): a two-edged sword in health and disease / J.L. Kelley, T.R. Ozment, C. Li [et al.] // Crit. Rev. Immunol. - 2014. - Vol. 34 (3). - P. 241-261.
16. Kovalenko E.I. ROS production, intracellular HSP70 levels and their relationship in human neutrophils: effects of age / E.I. Kovalenko, A.A. Boyko, V.F. Semenkov [et al.] // Oncotarget. - 2014. - Vol. 5 (23). - P. 11800-11812.
17. Lim J.J. Diversity and Versatility of Phagocytosis: Roles in Innate Immunity, Tissue Remodeling, and Homeostasis / J.J. Lim, S. Grinstein, Z. Roth // Front. Cell. Infect. Microbiol. - 2017. - Vol. 7. - P. 191.
18. Linehan E. Ageing and the immune system: focus on macrophages / E. Linehan, D.C. Fitzgerald // Eur J Microbiol Immunol (Bp). - 2015. - Vol. 5 (1). - P. 14-24.
19. Linehan E. Aging impairs peritoneal but not bone marrow-derived macrophage phagocytosis / E. Linehan, Y Dombrowski, R. Snoddy [et al.] // Aging Cell. - 2014. - Vol. 13 (4). - P. 699-708.
20. Lopez-Otin C. The hallmarks of aging / C. Lopez-Otin, M.A. Blasco, L. Partridge [et al.] // Cell. - 2013. - Vol. 153 (6). -P. 1194-1217.
21. Malissen B. The origins and functions of dendritic cells and macrophages in the skin / B. Malissen, S. Tamoutounour, S. Henri // Nat. Rev. Immunol. - 2014. - Vol. 14 (6). - P. 417-428.
22. Mocsai A. G-protein-coupled receptor signaling in Syk-deficient neutrophils and mast cells / A. Mocsai, H. Zhang, Z. Jakus [et al.] // Blood. - 2003. - Vol. 101 (10). - P. 4155-4163.
23. Murciano C. Influence of aging on murine neutrophil and macrophage function against Candida albicans / C. Murciano, A. Yanez, J.E. O'Connor [et al.] // FEMS Immunol. Med. Microbiol. - 2008. - Vol. 53 (2). - P. 214-221.
24. Rankin S.M. The bone marrow: a site of neutrophil clearance / S.M. Rankin // J. Leukoc. Biol. - 2010. - Vol. 88 (2). - P. 241251.
25. Röszer T. Understanding the mysterious M2 macrophage through activation markers and effector mechanisms / T. Röszer // Mediators Inflamm. - 2015. - Vol. 2015. - P. 816-460.
26. Sauce D. Reduced oxidative burst by primed neutrophils in the elderly individuals is associated with increased levels of the CD16bright/CD62Ldim immunosuppressive subset / D. Sauce, Y Dong, L. Campillo-Gimenez [et al.] // J. Gerontol. A Biol. Sci. Med. Sci. - 2017. - Vol. 72 (2). - P. 163-172.
27. Smallwood H.S. Aging enhances the production of reactive oxygen species and bactericidal activity in peritoneal macrophages by upregulating classical activation pathways / H.S. Smallwood, D. Lopez-Ferrer, T.C. Squier // Biochemistry. - 2011. - Vol. 50 (45). - P. 9911-9922.
28. Strydom N. Regulation of circulating neutrophil numbers under homeostasis and in disease / S.M. Rankin, N. Strydom // J. Innate Immun. - 2013. - Vol. 5 (4). - P. 304-314.
29. Tan H.Y The reactive oxygen species in macrophage polarization: reflecting its dual role in progression and treatment of human diseases / H.Y Tan, N. Wang, S. Li [et al.] // Oxid. Med. Cell Longev. - 2016. - Vol. 2016. - 16 p.
30. Tasat D.R. Age-dependent change in reactive oxygen species and nitric oxide generation by rat alveolar macrophages / D.R. Tasat, R. Mancuso, S. O'Connor, B. Molinari // Aging Cell. - 2003. - Vol. 2. - P. 159-164.
31. Verschoor C.P. Circulating TNF and mitochondrial DNA are major determinants of neutrophil phenotype in the advanced-age, frail elderly / C.P. Verschoor, D. Loukov, A. Naidoo [et al.] // Mol. Immunol. - 2015. - Vol. 65 (1). - P. 148-156.
32. Wessels I. Immunosenescence of polymorphonuclear neutrophils / I. Wessels, J. Jansen, L. Rink, P. Uciechowski // ScientificWorldJournal. - 2010. - Vol. 10. - P. 145-160.
33. Wong C.K. Aging impairs alveolar macrophage phagocytosis and increases influenza-induced mortality in mice / C.K. Wong,
C.A. Smith, K. Sakamoto [et al.] // J. Immunol. - 2017. - Vol. 199 (3). - P. 1060-1068.
34. Woo J.M. Curcumin protects retinal pigment epithelial cells against oxidative stress via induction of heme oxygenase-1 expression and reduction of reactive oxygen / J.M. Woo, D.-Y Shin, S.J. Lee [et al.] // Mol. Vis. - 2012. - Vol. 18. - P. 901-908.
35. Zhang J. ROS and ROS-mediated cellular signaling / J. Zhang, X. Wang, V. Vikash [et al.] // Oxid. Med. Cell Longev. - 2016. - Vol. 2016. - 18 р.
УДК 571.27
ФУНКЦЮНАЛЬНИЙ СТАН АЛЬВЕОЛЯРНИХ МАКРОФАПВ ТА НЕЙТРОФ1Л1В К1СТКОВОГО МОЗКУ МИШЕЙ Р1ЗНОГО В1КУ
Довгий Р. С., Сювка Л. М.
Резюме. Фагоцити вщграють ключову роль у тканинному гомеостазi i вродженому iмунному захис-т оргаызму. Змши фагоцитуючих кл™н з вком до^джеы недостатньо. В лiтературi наявн суперечливi данi стосовно змш фагоцитозу та продукцiT реактивних форм кисню при старшнг Метою нашо! роботи було порiвняти вiковi змши оксидативного метаболiзму та фагоцитарно! активной тканинних макрофагiв ембрiонального походження та нейтрофЫв кiсткового мозку. Виявлено достовiрне зниження фагоцитарного числа та вщсотку клiтин, що продукували реактивы форми кисню, у альвеолярних макрофапв старих мишей. Статистично вiрогiднi вщмшност мiж до^дженими метаболiчними характеристиками нейтрофг лiв кiсткового мозку старих i молодих тварин були вiдсутнi. Це вказуе на важливу роль тканинного мкро-оточення старого органiзму в розвитку вiкових порушень фагоцитуючих кл™н.
Ключовi слова: старiння, альвеолярнi макрофаги, нейтрофти, фагоцитоз, реактивнi форми кисню.
УДК 571.27
ФУНКЦИОНАЛЬНОЕ СОСТОЯНИЕ АЛЬВЕОЛЯРНЫХ МАКРОФАГОВ И НЕЙТРОФИЛОВ КОСТНОГО МОЗГА МЫШЕЙ РАЗНОГО ВОЗРАСТА
Довгий Р. С., Скивка Л. М.
Резюме. Фагоциты играют ключевую роль в тканевом гомеостазе и врожденной иммунной защите организма. Изменения фагоцитирующих клеток с возрастом исследованы недостаточно. В литературе имеются противоречивые данные относительно изменений фагоцитоза и продукции реактивных форм кислорода при старении. Целью нашей работы было сравнить возрастные изменения оксидативного метаболизма и фагоцитарной активности тканевых макрофагов эмбрионального происхождения и нейтро-филов костного мозга. Обнаружено достоверное снижение фагоцитарного числа и процента клеток, продуцирующих реактивные формы кислорода, у альвеолярных макрофагов старых мышей. Статистически достоверные отличия между исследованными метаболическими характеристиками нейтрофилов костного мозга старых и молодых животных отсутствовали. Это указывает на важную роль тканевого микроокружения старого организма в развитии возрастных нарушений фагоцитирующих клеток.
Ключевые слова: старение, альвеолярные макрофаги, нейтрофилы, фагоцитоз, реактивные формы кислорода.
UDC 571.27
FUNCTIONAL STATE OF ALVEOLAR MACROPHAGES AND BONE MARROW NEUTROPHILS FROM MICE OF DIFFERENT AGES
Dovhyi R. S., Skivka L. M.
Abstract. Phagocytes play crucial role in tissue homeostasis and innate immune defence of the organism. Immune system functioning is deteriorated with aging. Phagocytosis and reactive oxygen species production are poorly studied processes with contradictory results being obtained in different experiments. Moreover, some studies suggest that resistance to certain infectious agents increase with age.
It is known that distinct phagocytes differ in their ontogenetic origin. Furthermore, Linehan et al (2014) showed age-related decline in peritoneal macrophage phagocytosis, while such defect was absent in bone marrow-derived macrophages. Thus, the aim of the research was to compare age-related changes in oxidative metabolism and phagocytic activity of tissue macrophages of embryonic origin and bone marrow neutrophils.
Young (2-3 mo) and aged (18-23 mo) male C57/B6 mice were used in the experiment. Neutrophils were obtained by percoll gradient centrifugation of bone marrow-derived cells. Alveolar macrophages were collected by bronchoalveolar lavage of the lungs. Cells were used to measure intracellular reactive oxygen species (ROS) production and phagocytic activity by flow cytometry. Percent of phagocytic cells, phagocytic index, percent of ROS producing cells and mean fluorescence intensity (MFI) per amount of ROS producing cells were analyzed. Statistical significance of the data was determined using Student's t-test.
There was statistically significant decrease in the percentage of alveolar macrophages obtained from aged mice, which phagocytized FITC-labeled Staphylococcus aureus (p=0,019). In neutrophils, however, there was no change in proportion of phagocytizing cells with aging. Percentage of alveolar macrophages producing ROS was significantly lowered in aged mice (p=0,025). Also, there was a tendency towards the decrease of ROS producing neutrophils with aging (p=0,056). There was slight trend toward increase of ROS production per cell in alveolar macrophages obtained from old mice, while in neutrophils there was no statistical difference in this parameter
between cells from young and old animals Phagocytic index was unchanged in both alveolar macrophages and neutrophils obtained from old mice as compared to corresponding cells from young animals.
Our data on age-related changes of alveolar macrophages is corroborated by previous findings of different authors. Percent of ROS producing alveolar macrophages was decreased in aged rats. Wong et al. (2017) found the significantly lower percent of alveolar macrophages which phagocytized apoptotic neutrophils and fluorophore labeled beads. Also, they found out that CD204 expression was down-regulated with aging, which can explain our results, due to the ability of CD204 to recognize bacterial ligands.
As can be seen from our results, functional state of bone marrow neutrophils from aged mice was almost unaffected. Unimpaired phagocytosis in murine neutrophils from old animals was also shown in previous publications. There are controversial results regarding changes in ROS generation by neutrophils, with studies showing increased, unchanged and decreased production with aging. However, most of these studies were performed on neutrophils obtained from the blood of elderly. It was shown that phenotype and morphology of neutrophils change during their short life, with a shift toward more proinflammatory activation due to cell «aging». Bone marrow derived neutrophils must contain a larger proportion of «young» cells as compared to neutrophils from blood and tissues. Thus, different «age» of neutrophils used in experiments may be an important factor determining differences in the results of our experiment in comparison to aforementioned studies. However, this issue requires further study.
In conclusion, there were more pronounced age-related changes in tissue macrophages as compared to neutrophils. It points out that tissue microenvironment of an old organism plays important role in the development of age-related impairment of phagocytes.
Keywords: aging, alveolar macrophages, neutrophils, phagocytosis, reactive oxygen species.
Рецензент - проф. Блаш С. М.
Стаття надшшла 11.08.2017 року
