Функциональная активность hейтрофилов и процессы формирования ими сетей внеклеточной ДНК при встрече с опухолевыми клетками карциномы молочной железы Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

ДРУГИЕ РАЗДЕЛЫ МЕДИЦИНЫ

УДК 616.091.8

© И.И. Долгушин, А.Б. Семенова, Ю.С. Шишкова, Е.Л. Казачков, А.Ю. Шаманова, А.В. Важенин, 2014

И.И. Долгушин1, А.Б. Семенова2, Ю.С. Шишкова1, Е.Л. Казачков1, А.Ю. Шаманова2, А.В. Важенин2 ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ АКТИВНОСТЬ ^ЙТРОФИЛОВ И ПРОЦЕССЫ ФОРМИРОВАНИЯ ИМИ СЕТЕЙ ВНЕКЛЕТОЧНОЙ ДНК ПРИ ВСТРЕЧЕ С ОПУХОЛЕВЫМИ КЛЕТКАМИ КАРЦИНОМЫ МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ 'ГБОУ ВПО «Южно-уральский государственный медицинский университет» Минздрава России, г. Челябинск 2ГБУЗ «Челябинский областной клинический онкологический диспансер»

г. Челябинск

Нейтрофильные гранулоциты, являясь постоянными элементами в составе микроокружения опухолей, играют неоднозначную роль в онкогенезе. В ответ на микробные и немикробные стимулы нейтрофилы активно формируют во внеклеточном пространстве сетеподобные структуры, состоящие из нуклеиновых кислот и ферментов, - нейтрофильные внеклеточные ловушки. Нами было замечено, что в ткани опухоли карциномы молочной железы рядом с опухолевыми клетками диффузно и скоплениями распределяется внеклеточная ДНК. Было показано, что нейтрофилы при встрече с опухолевыми клетками активируются и начинают формировать внеклеточные сети ДНК вокруг них.

Ключевые слова: карцинома молочной железы, нейтрофилы, нейтрофильные внеклеточные сети ДНК.

I.I. Dolgushin, A.B. Semenova, Yu.S. Shishkova, E.L. Kazachkov, A.Yu. Shamanova, A.V. Vazhenin FUNCTIONAL ACTIVITY OF NEUTROPHILS AND PROCESSES OF FORMATION OF EXTRACELLULAR DNA NETWORKS AFTER THEIR CONTACT WITH TUMOR CELLS OF BREAST CARCINOMA

Neutrophil granulocytes, being a permanent structure in the structure of «microenvironment» of tumors play an ambiguous role in oncogenes. In response to microbial and non-microbial incentives neutrophils actively form in the extracellular space networklike structure consisting of nucleic acids and enzymes - neutrophil extracellular traps. It was noticed, that in the tumor tissue of breast carcinoma extracellular DNA is distributed diffuse and in clusters near the tumor cells.

It has been shown that neutrophils when meeting tumor cells become activated and begin to form neutrophil extracellular traps (NETs) around them.

Key words: breast carcinoma, neutrophils, neutrophil extracellular 1raps.

Нейтрофильные гранулоциты являются ры, состоящие из нуклеиновых кислот и фер-постоянной структурой в «палитре микро- ментов, - нейтрофильные внеклеточные ло-окружения» опухолей и играют неоднознач- вушки (Neutrophil Extracellular Traps, NETs), ную роль в онкогенезе. Нейтрофилы являются способные задерживать и убивать микроорга-непременными участниками процесса форми- низмы [6]. В последние годы исследователи рования и развития опухоли. Нейтрофилы - стали высказывать осторожные предположе-это секреторные клетки, способные выделять ния о роли внеклеточных сетей, формирую-биологически активные продукты, с помощью щихся в результате активации нейтрофилов, в которых они могут осуществлять внеклеточ- воздействии микроокружения на опухолевые ный киллинг, а также, вступая в медиаторные клетки [7], и более смелые, обозначая внекле-контакты с гуморальными системами и клет- точные сети термином «ловушки», что ками крови, соединительной ткани, оказывать нейтрофильные внеклеточные ловушки захва-регуляторное действие [3,4]. По данным лите- тывают циркулирующие опухолевые клетки и ратуры, нейтрофилы обладают не только про- способствуют метастазированию [8]. тивоопухолевыми, но и проопухолевыми В эксперименте нами было показано,

свойствами, усиливая ангиогенез и метастази- что индукция нейтрофилов периферической рование. Ключевую роль в регрессии опухо- крови in vitro взвесью перевиваемых клеточ-лей отводят активным формам кислорода, ак- ных линий опухолевых клеток HEp-2, RD тивным формам азота и цитокинам, продуци- приводит к активации нейтрофилов с формируемым нейтрофилами [5]. Показано, что в рованием внеклеточных сетей, состоящих из ответ на микробные и немикробные стимулы нитей дезоксирибонуклеиновой кислоты и нейтрофилы активно формируют во внекле- бактерицидных гранул [2]. точном пространстве сетеподобные структу-

Исследуя микропрепараты и мазки-отпечатки карцином молочной железы, мы обнаружили, что в ткани опухоли рядом с опухолевыми клетками диффузно и скоплениями распределяется внеклеточная ДНК в виде сетей, предположительно выброшенная вместе с компонентами гранул в ответ на взаимодействие с опухолевыми клетками [9]. Мы высказали предположение, что нельзя исключить неспецифический характер механизма формирования внеклеточных сетей ДНК в ответ на воздействие опухолевых клеток в эксперименте перевиваемых клеточных линий опухолевых клеток HEp-2, RD, равно как и на частицы латекса и микроорганизмы и совершенно иные или по крайней мере не столь однозначные процессы, происходящие с нейтрофилами и опухолью in vivo. Мы предположили, что нейтрофилы формируют внеклеточные сети ДНК при непосредственной встрече с опухолевыми клетками либо в тканях после миграции их из системы гемомик-роциркуляции, либо непосредственно внутри сосудов микроциркуляторного русла.

Цель исследования - уточнение понимания процессов формирования нейтрофила-ми внеклеточных сетей ДНК в ткани опухоли.

Материал и методы

Взятие материала периферической крови для анализа производилось одноразовыми инструментами (иглами) в пробирки одноразового использования в 8.00 часов утра в день проведения операции. В связи с тем, что в течение одного дня мы могли забрать материал опухоли у четырех пациенток, эксперимент проводился в течение 5 дней. Кровь 20 здоровых доноров забиралась ежедневно. Для получения нейтрофилов использовали 15,0 мл гепаринизированной (10-15 ЕД/мл гепарина) периферической венозной крови. Нейтрофилы выделяли из лейкоцитарной взвеси на двойном градиенте плотности стерильных растворов фиколла-урографина (Pharmacia, Швеция; Шеринг, Германия). Плотность верхнего слоя градиента составляет 1,075-1,077 г/мл, нижнего - 1,093-1,095 г/мл. Каждый градиент используют в объеме 1,5 мл. Через 40 минут центрифугирования при 1500 оборотах в минуту на границе между градиентами образуется кольцо гранулоцитов с чистотой 98100%, мононуклеары составляют около 2% или отсутствуют. Кольцо нейтрофилов аккуратно собирали, переносили в стерильные центрифужные пробирки, отмывали от градиента стерильным физиологическим раствором хлорида натрия путём центрифугирования при 1500 оборотах в минуту дважды по 5 минут,

доводя до концентрации 5*10б клеток/мл и используя для оценки функционального статуса нейтрофилов или получения супернатантов.

Забор ткани опухоли молочных желез у 20 пациенток осуществляли стерильным скальпелем в контейнер одноразового использования в течение 10 мин после радикальной мастэктомии по Маддену или Пэйти. Диагноз был гистологически верифицирован: инвазив-ная карцинома молочной железы неспецифического типа. Молочная железа рассекалась в проекции опухоли и забирался фрагмент с периферии узлового образования с окружающей тканью 0,5смЧ0,5смЧ0,2см. Затем ткань опухоли в гомогенизаторе механически измельчалась до получения гомогенной мелкодисперсной массы. Для механического разрушения соединительной ткани и высвобождения опухолевых клеток к взвеси гомогенизированной ткани опухоли добавляли трипсин в концентрации 0,25%, в соотношении 1:5. Полученную смесь инкубировали в термостате при 37° С в течение 30 мин, центрифугировали при 1500 оборотах в минуту в течение 20 мин. Образовавшуюся надосадочную жидкость сливали, осадок отмывали и доводили разведением стерильным физиологическим раствором хлорида натрия до концентрации 0,5*10б клеток/мл, используя для контроля унифицированный метод подсчета клеток в камере Горяева. При проведении эксперимента для оценки жизнеспособности опухолевых клеток после проведенных процедур к 0,2 мл суспензии ткани опухоли добавляли 0,02 мл 1% раствора трипанового синего. Полученный материал помещали в камеру Горяева и исследовали в световом микроскопе. Подсчет производили на 100 клетках. Живыми прозрачными (трипанонегативные клетки) оставалось более 80% клеток, мертвыми - менее 20% клеток, которые окрашивались в фиолетовый цвет (трипанопозитивные клетки). Далее полученные взвеси опухолевых клеток каждого пациента группы исследования смешивали в соотношении 1:10 с фракциями нейтрофилов 20 здоровых доноров. Полученные взвеси инкубировали в термостате при 37°С в течение 60 мин. Затем из полученных взвесей изготавливались мазки на предметных стеклах и окрашивались по Романовскому-Гимзе с микроскопией в световом микроскопе с дифференцированием форм лейкоцитов и подсчетом внеклеточной ДНК. Подсчет вели на 300 структурах (нейтрофилы сегменто-ядерные, нейтрофилы юные, сети ДНК сво-боднолежащие, сети ДНК в непосредственном контакте с опухолевыми клетками).

Таблица 2

(п = 20)

Таблица 3

Для определения функциональной активности нейтрофилов проводили изучение лизосомальной активности, исследуя интенсивность люминесценции лизосом нейтрофилов, прижизненно окрашенных акридиновым оранжевым. 0,1 мл взвеси нейтрофилов с опухолевыми клетками смешивали с 0,05 мл раствора акридинового оранжевого в концентрации 2 мкг/мл. После 30-минутной инкубации при 37оС клетки помещали на предметное стекло, накрывали покровным стеклом и под иммерсией исследовали в потоке сине-фиолетового света люминесцентного микроскопа "Люмам". Определяли лизосомальную активность - число нейтрофилов, имеющих лизосомальные гранулы (в %), а также подсчитывали индекс суммарной люминесценции лизосом (ИСЛЛ), выраженный в условных единицах, использовали формулу:

ИСЛЛ=АЧ 1+ВЧ3+СЧ10+БЧ0, где А, В, С, Б - количество клеток с заполнением цитоплазмы лизосомальными гранулами на "+", "++", "+++" или с их отсутствием соответственно.

Для определения активности внутриклеточного кислородзависимого метаболизма

проводили постановку НСТ-теста в модификации А.Н. Маянского и М.К. Виксмана (1979). Учитывали интенсивность спонтанной НСТ-восстанавливающей активности и индуцированной. При учете реакции определяют процент НСТ-позитивных клеток и интенсивность реакции по формуле:

интенсивность НСТ = (АЧ3+ВЧ2+СЧ 1)/100, где А, В, С - число клеток, соответственно, с отложением диформазана, превышающих размеры ядра, занимающих более 1/3 площади цитоплазмы и менее 1/3 площади соответственно [1].

Результаты и их обсуждение Было показано, что нейтрофилы при встрече с опухолевыми клетками активируются и через 60 мин инкубации выбрасывают во внеклеточное пространство сетеподобные структуры, состоящие из нуклеиновых кислот и ферментов (нейтрофильные внеклеточные сети ДНК), которые оплетают опухолевые клетки, в то время как в контрольных образцах нейтрофилы сохраняли структуру и жизнеспособность и не формировали внеклеточных сетей ДНК (табл. 1).

Таблица 1

Виды нейтрофилов Суспензия опухоли пациента + нейтрофилы периферической крови (п = 20) Нейтрофилы периферической крови (п = 20)

Нейтрофилы, юные формы 3,98±0,526 (р>0,05) 4,22±0,06 (р<0,05)

Нетрофилы зрелые, сегментоядерные формы 278,75±2,006 (р<0,05) 294,13±2,001 (р<0,05)

Внеклеточные сети 15,1±0,31 (р<0,05) 1,4±0,011 (р<0,05)

Показатели лизосомальной активности нейтрофилов при встрече с опухолевыми клетками

Объект

Показатели лизосомальной активности

активность лизосом, % (п = 20)

индекс люминесценции лизосом, усл. ед.

Суспензия опухоли пациента + нейтрофилы периферической крови

98,64±1,02 р<0,05

384,08±6,54 р<0,05

Нейтрофилы периферической крови

93,79±1,29

303,81±13,20

Показатели кислородзависимого метаболизма нейтрофилов при встрече с опухолевыми клетками

Спонтанный НСТ-тест Нейтрофилы периферической крови, активность, % (п = 20) Индуцированный НСТ-тест Суспензия опухоли пациента + нейтрофилы периферической крови, активность,% (п = 20)

31,46 ±3,61 (р=0,001) 69,22±4,87 (р=0,001)

Активация нейтрофилов подтвердилась определением показателей лизосомальной активности и показателя кислородзависимого метаболизма. Количество лизосом в цитоплазме нейтрофилов, отражающее их функциональную активность и способность к реагированию на внешние воздействия, увеличивалось по сравнению с контрольными пробами (табл. 2). Значительно, почти в два раза, увеличиваются и показатели НСТ-теста в

опытных образцах (индуцированный НСТ-тест), не изменяясь в контрольных (табл. 3).

Выводы

Нейтрофилы при встрече с опухолевыми клетками активируются и начинают формировать внеклеточные сети ДНК вокруг них. Активация нейтрофилов подтверждалась показателями лизосомальной активности и показателя кислородзависимого метаболизма.

Сведения об авторах статьи: Долгушин Илья Ильич - д.м.н., профессор, ректор ГБОУ ВПО ЮУГМУ Минздрава России. Адрес: 454092, г. Челябинск, ул. Воровского, 64.

Семенова Анна Борисовна - к.м.н., зав. лабораторно-диагностической службой ГБУЗ ЧОКОД. Адрес: 454082, г. Челябинск, ул. Блюхера, 42. E-mail: [email protected].

Шишкова Юлия Сергеевна - д.м.н., профессор кафедры микробиологии, вирусологии, иммунологии и клинической лабораторной диагностики ГБОУ ВПО ЮУГМУ Минздрава России. Адрес: 454092, г. Челябинск, ул. Воровского, 64. Казачков Евгений Леонидович - д.м.н., профессор, зав. кафедрой патологической анатомии с секционным курсом ГБОУ ВПО ЮУГМУ Минздрава России. Адрес: 454092, г. Челябинск, ул. Воровского, 64.

Шаманова Анна Юрьевна - врач-патологоанатом ГБУЗ ЧОКОД. Адрес: 454082, г. Челябинск, ул. Блюхера, 42. Важенин Андрей Владимирович - д.м.н., профессор, член-корр. РАН, главный врач ГБУЗ ЧОКОД. Адрес: 454082, г. Челябинск, ул. Блюхера, 42.

ЛИТЕРАТУРА

1. Долгушин, И.И. Нейтрофильные внеклеточные ловушки и методы оценки функционального статуса нейтрофилов / И.И. Долгушин, Ю.С. Андреева, А.Ю. Савочкина - М.: Издательство РАМН, 2009. - 208 с.

2. Нейтрофильные экстрацеллюлярные сети ДНК сдерживают рост опухолевых клеток / И.И. Долгушин [и др.] // Российский иммунологический журнал. - 2013. - Т. 7, №2-3. - С.130.

3. Маянский, Д.Н. Фагоцитарные реакции в патологии / Д.Н. Маянский, А.А. Цырендоржиев, Д.Д. Зубахина // Первый Российский конгресс по патофизиологии. - М., 1996. - 269 с.

4. Пигаревский, В.Е. Гипотеза о резорбтивной клеточной резистентности как особой форме антимикробной защиты организма / В.Е.Пигаревский, // Арх. патологии. - 1992. - Т. 54, № 8. - С. 40-45.

5. Сафронова В.Г. Неоднозначность роли нейтрофила в генезе опухоли / В.Г. Сафронова, В.Н. Мальцева // Цитология. - 2009. - Т. 51, № 6 -С.469-474.

6. Brinkmann V. Neutrophil extracelllulartraps kill bacteria / Brinkmann V. [et al.] // Sciense. - 2004. - Vol. 303. - P. 1532-1535.

7. A proposed role for neutrophil extracellular traps in cancer immunoediting / S. Berger-Achituv, [et al.]// Frontiers in immunology. -2013. - Vol.4. - P. 48.

8. Neutrophil extracellular traps sequester circulating tumor cells and promote metastasis / J. Cools-Lartigue [et al.]// J Clin Invest. - 2013. - Vol. 123(8). - P. 3446-3458.

9. Neutrophil extracellular DNA networks restrain growth of tumor cells, Internationaler Medizinischer Kongress «Moderne Aspekte der Prophylaxe,behandlung und rehabilitation» / I.I. Dolgushin [et al.] //Euromedica Hannover. - 2013. - P.62-63.

УДК 57.089.32:577.121.7:618.177-089.888.11 © И.Р. Исхаков, Р.С. Исхакова, Р.Р. Фархутдинов, 2014

И.Р. Исхаков, Р.С. Исхакова, Р.Р. Фархутдинов ОЦЕНКА СОСТОЯНИЯ СВОБОДНОРАДИКАЛЬНОГО ОКИСЛЕНИЯ НА ЭТАПАХ РАННЕГО ЭМБРИОГЕНЕЗА

ГБОУ ВПО «Башкирский государственный медицинский университет» Минздрава России, г. Уфа

Около 15% супружеских пар во всем мире имеют проблемы с естественным наступлением беременности. Исследование причин бесплодия показывает, что на долю только мужского фактора приходится около 20% случаев, только женского - 39%, и мужского, и женского - 26%, а в 15% случаев нет каких-либо явных причин. В последнее время уделяют большое внимание роли свободных радикалов в репродуктивной функции. Свободные радикалы отличаются высокой химической активностью. Наиболее часто встречаются активные формы кислорода и радикалы, образующиеся при перекисном окислении липидов. Роль свободных радикалов при оплодотворении и развитии эмбриона малоизучена.

Ключевые слова: экстракорпоральное оплодотворение, дробление, бластоциста, культуральная среда.

I.R. Iskhakov, R.S. Iskhakova, R.R. Farkhutdinov FREE RADICAL PEROXIDATION DURING EARLY EMBRIOGENESIS

About 15% of couples around the world have problems with the natural onset of pregnancy. Research into the causes of infertility shows that the share of male factor only accounts for about 20% of cases, only female - 39%, and male and female 26%, and in 15% of cases there are no obvious reasons. In recent years, a great attention has been paid to the role of free radicals in the reproductive function. Free radicals are highly reactive. The most frequently occurring reactive oxygen radicals are formed during lipid peroxidation. The role of free radicals in fertilization and embryo development has not been widely studied.

Key words: in vitro fertilization, cleavage, blastocyst, culture medium.

В настоящее время одним из актуальных вопросов репродуктологии и эмбриологии является отбор лучшего по качеству эмбриона, обладающего наибольшей способностью к имплантации. При этом основная задача - повышение частоты наступления беременности [2].

Несмотря на большое число методик, разработанных для селекции эмбрионов, на практике применяется только отбор по морфологическим критериям. Система оценки

качества морфологических признаков, впервые предложенная Гарднером и Скулкрафтом более 10 лет назад, широко применяется при отборе бластоцист для переноса в полость матки [4]. Основной недостаток при этом заключается в том, что качество эмбриона оценивается только по внешним признакам.

Одним из перспективных направлений для отбора лучшего эмбриона может стать изучение метаболизма при его культивировании. Суммарное проявление изменения обме-