CC BY
134
РЕГУЛЯЦИЯ ИММУНИТЕТА
РЕГУЛЯЦИЯ ИММУНИТЕТА
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2012 УДК 612.018.2:577.175.632].112.91.083
И. И. Долгушин, Т. Г. Смирнова, А. Ю. Савочкина, Ю. С. Шишкова, В. Ф. Долгушина,
И. В. Курносенко
ВЛИЯНИЕ ПРОГЕСТЕРОНА НА ФАГОЦИТАРНУЮ, КИСЛОРОДЗАВИСИМУЮ
бактерицидную функции нейтрофилов и их способность образовывать внеклеточные ловушки
ГБОУ ВПО Челябинская государственная медицинская академия Минздравсоцразвития России (НИИ иммунологии ЧелГМА, 454092, г Челябинск, ул. Воровского, д. 64)
Изучено влияние прогестерона в концентрациях, соответствующих I, II и III триместрам беременности, на фагоцитарную, бактерицидную активность и формирование внеклеточных ловушек нейтрофилами чистой фракции in vitro. Установлено, что данный гормон существенно не влияет на фагоцитарную функцию нейтрофилов, во всех трех концентрациях снижает бактерицидность и в концентрации, соответствующей II триместру беременности, ведет к формированию внеклеточных ловушек нейтрофилами.
Ключевые слова: нейтрофил, нейтрофильные внеклеточные ловушки, прогестерон, фагоцитоз
I.I. Dolgushin, T.G. Smirnova, A.Y. Savochkina, Yu.S. Shishkova, V.F. Dolgushina, I.V Kurnosenko
EFFECT oF PRoGESTERoNE on THE PHAGoCYTIC, oXYGEN DEPENDENT BACTERICIDAL
neutrophil function and their ability to form extracellular traps
has been studied the effect of progesterone in concentrations corresponding to the first, second and third trimesters of pregnancy on the phagocytic, bactericidal activity and the formation of extracellular traps neutrophil pure fractions in vitro. It was determined that the hormone did not significantly affect the phagocytic function of neutrophils, in all three concentrations reduces the bactericidal activity and concentration corresponding to the second trimester, leading to the formation of extracellular traps neutrophil.
Key words: neutrophil, neutrophil extracellular traps (NETs), progesterone, phagocytosis
Возможность нормальной функции репродуктивной системы у здоровых женщин детородного периода обеспечивается наличием иммунологических барьеров и нормальным функционированием иммунорегуляторных механизмов [1]. Иммунная система женского репродуктивного тракта специфически регулируется половыми стероидными гормонами. В этой многочисленной группе ведущая роль с точки зрения контроля репродуктивной функции принадлежит эстрогенам, прогестерону и глюкокортикостероидам. Прогестерон является главным гормоном беременности и в I триместре синтезируется в яичниках, позднее эта функция переходит к плаценте; он играет важную роль в процессах имплантации, контролирует в течение беременности «спокойствие матки», участвует в подготовке грудных желез к лактации [4].
Прямое воздействие прогестерона на органы и ткани обеспечивается рецепторно-опосредованным путем. В настоящее время отчетливо идентифицируются различные рецепторы для прогестерона (PRA, PRB), вследствие чего прогестерон является регулятором функций костной, сердечно-сосудистой и нервной систем [8]. Также активно изучается прямое воздействие прогестерона и других стероидных гормонов на органы и ткани иммунной системы. Совсем недавно при изучении мононуклеарных клеток были обнаружены три гомологичных гена мембранного рецептора
Долгушин Илья Ильич - д-р мед. наук, проф., член-корр. РАМН, зав. каф. микробиологии, вирусологии, иммунологии и клинической лабораторной диагностики, ректор Челябинской гос. мед. академии, тел. 8(912)891-26-95, e-mail: obp74@rambler.ru
прогестерона: mPRa, mPRp и mPRy [10]. Для нейтрофилов таких данных пока нет, но на сегодняшний день получены результаты о влиянии прогестерона на хемотаксис нейтрофилов, образование свободных радикалов [7], апоптоз и другие функции [9]. Показано, что половые гормоны могут влиять на неспецифический иммунный ответ путем модуляции количества и функций нейтрофилов.
Клетки врожденного иммунитета играют важную роль во всех процессах, связанных с гестацией. В последнее время данной категории клеток уделяют особое внимание, поскольку именно с их функционированием реализуется программа защиты урогенитального тракта и плода от инфекционных агентов [3]. Нейтрофилы традиционно относят к фагоцитирующим клеткам, которые благодаря ряду уникальных свойств (высокая подвижность, наличие мощных бактерицидных и цитотоксических продуктов) рассматриваются как высокопрофессиональные «убийцы», составляющие своеобразный «отряд быстрого реагирования» в системе врожденной противоинфекционной защиты организма [2]. В 2004 г немецким и американскими учеными была открыта и идентифицирована новая функция нейтрофилов - формирование нейтрофильных внеклеточных ловушек (НВЛ - Neutrophil Extracellular Traps; NETs). НВЛ представляют собой сети внеклеточных волокон ДНК, которые связывают, обезвреживают и уничтожают патогенные микроорганизмы с помощью антимикробных белков. Ловушки связывают микроорганизмы, как грамположительные, так и грамотрица-тельные, предотвращают их распространение и обеспечивают высокую местную концентрацию антимикробных агентов [11].
В связи с вышесказанным целью данной работы стало изучение влияния прогестерона на функциональный статус нейтрофильных гранулоцитов.
- 243 -
ИММУНОЛОГИЯ № 5, 2012
Таблица 1
Влияние прогестерона на кислородзависимую бактерицидную функцию нейтрофилов периферической крови (M ± т) (п = 15)
НСТс НСТи
Группа актив- индекс, актив- индекс,
ность, % усл. ед. ность, % усл. ед.
1-я контроль 13,7 ± 1,2 0,17 ± 0,02 11,5 ± 2,9 0,14 ± 0,04
2-я прогесте- 8,4 ± 1,2 0,10 ± 0,02 7,2 ± 1,2 0,09 ± 0,02
рон (20 нг/мл) Р1-2 = 0,006 p1-2 = 0,006
3-я прогесте- 9,0 ± 1,2 0,11 ± 0,01 9,8 ± 1,1 0,10 ± 0,02
рон (50 нг/мл) p1-3 = 0,009 Л-3 = 0,01
4-я прогесте- 8,5 ± 1,3 0,11 ± 0,02 9,2 ± 0,9 0,10 ± 0,01
рон (100 нг/мл) Л-4 = 0,01 Рм = 0,037
Примечание. НСТс - спонтанный НСТ-тест, НСТи - индуцированный. Здесь и в табл. 3: p - статистически значимые различия показателей в сравниваемых группах.
Материалы и методы. Обследованы 15 условно здоровых небеременных женщин в возрасте 18-35 лет в первую фазу менструального цикла. У женщин был определен эндогенный уровень прогестерона методом иммуноферментного анализа для исключения из исследования тех, у кого показатели концентрации гормона выходили за пределы нормы. Чистую фракцию нейтрофилов выделяли из 15 мл гепаринизированной периферической венозной крови центрифугированием на двойном градиенте плотности фиколла-верографина с плотностью верхнего и нижнего градиентов 1,077 и 1,093 г/мл соответственно. После центрифугирования на границе между градиентами собирали кольцо нейтрофилов, дважды отмывали физиологическим раствором и доводили до концентрации 5 • 106 кл/л. Для изучения образования НВЛ полученные таким образом клетки инкубировали 30 мин при 37°C с прогестероном в физиологических концентрациях, соответствующих их уровню в периферической крови в I (20 нг/мл), II (50 нг/мл) и III (100 нг/мл) триместры беременности. Для контроля использовали взвесь нейтрофилов, инкубируемых в тех же условиях, без гормона. Окрашивали нейтрофильные ловушки рабочим раствором акридинового оранжевого. Учет проводили с помощью люминесцентного микроскопа и определяли процент клеток с сегментированным ядром, недифференцированным ядром и НВЛ [5]. Данная классификация условна и характеризует разную степень формирования НВЛ. Клетки с сегментированным ядром - это неизмененные клетки, у которых хорошо визуализируется сегментированное ядро. После активации нейтрофила происходит изменение структуры ядра и гранул (ядерная мембрана разрушается, гранулы растворяются, комТаблица 2
влияние прогестерона на фагоцитарную функцию нейтрофилов периферической крови (M ± т) (п = 15)
Фагоцитоз
Группа активность, % интенсивность, усл. ед. фагоцитарное число, усл. ед.
1-я контроль 44,3 ± 3,7 1,03 ± 0,2 2,1 ± 0,2
2-я прогестерон (20 нг/мл) 47,9 ± 4,4 1,17 ± 0,2 2,2 ± 0,3
3-я прогестерон (50 нг/мл) 50,3 ± 3,3 1,22 ± 0,2 2,3 ± 0,3
4-я прогестерон (100 нг/мл) 51,4 ± 4,0 1,11 ± 0,2 2,0 ± 0,2
поненты будущей ловушки распределяются по всему объему клетки) - клетка с недифференцированным ядром. Затем клетка сокращается и выбрасывает всокоактивную смесь наружу, формируя сеть - НВЛ (рис. 1).
Оценку внутриклеточного кислородзависимого метаболизма нейтрофилов периферической крови проводили с использованием теста с нитросиним тетразолием (НСТ) в модификации А. Н. Маянского и М. К. Виксмана (1979). Для учета спонтанной НСТ-восстанавливающей активности чистую фракцию нейтрофилов инкубировали 30 мин при 37°C с прогестероном в физиологических концентрациях, соответствующих их уровню в периферической крови в I, II и III триместры беременности с добавлением 0,2% раствора НСТ, а для определения индуцированной НСТ-восстанавливающей активности параллельно во взвесь клеток вносили раствор монодисперсного полистирольного латекса диаметром 1,7 мкм. В качестве контрольной группы использовали нейтрофилы, инкубируемые в тех же условиях, но без гормона. Далее готовили мазки, которые высушивали, фиксировали этанолом и окрашивали 0,1% раствором сафранина (рис. 2). Подсчитывали активность, индекс спонтанного и индуцированного НСТ-теста, а также активность, интенсивность и фагоцитарное число нейтрофилов.
Полученные результаты исследований были подвергнуты статистической обработке. Достоверность различий определяли при помощи непараметрического критерия Манна-Уитни.
Результаты и обсуждение. Изучая влияние прогестерона на внутриклеточный кислородзависимый метаболизм нейтрофилов периферической крови с использованием НСТ-теста (табл. 1), мы обнаружили, что прогестерон во всех трех используемых концентрациях приводит к значимому снижению активности и индекса спонтанного НСТ-теста, но не влияет на аналогичные показатели индуцированного НСТ-теста, т. е. интактные нейтрофилы отвечали на воздействие прогестерона снижением их бактерицидной функции, а при дополнительной стимуляции активированные нейтрофилы не изменяли своих свойств.
При оценке регулирующего действия прогестерона на фагоцитарную функцию нейтрофилов периферической крови (табл. 2), а именно на активность, интенсивность и фагоцитарное число, не выявили достоверных различий в исследуемых группах по сравнению с контролем.
В табл. 3 представлено исследование влияния прогестерона на способность нейтрофилов, выделенных из периферической крови, к образованию внеклеточных ловушек. Установили, что процент нейтрофилов с сегментированным ядром существенно снижается во всех группах при сравнении
Таблица 3
влияние прогестерона на способность нейтрофилов периферической крови к образованию ловушек (M ± т) (п = 15)
Морфологические формы нейтрофилов
Группа нейтрофилы с сегментированным ядром, % нейтрофилы с недифференцированным ядром, % НВЛ, %
1-я контроль 58,7 ± 4,6 27,8 ± 4,2 13,3 ± 1,9
2-я прогестерон (20 нг/мл) 37,7 ± 5,6 p1-2 = 0,009 42,0 ± 5,7 20,3 ± 4,2
3-я прогестерон (50 нг/мл) 31,9 ± 5,5 p1-3 = 0,003 41,0 ± 5,0 26,4 ± 4,3 p1-3 = 0,003
4-я прогестерон (100 нг/мл) 35,7 ± 4,0 Рм = 0,001 46,6 ± 3,0 Рм = 0,0007 17,7 ± 2,9
- 244 -
ИНФЕКЦИОННАЯ ИММУНОЛОГИЯ
с таковым в контроле. При этом концентрация прогестерона, соответствующая III триместру беременности, приводит к увеличению количества нейтрофилов с недифференцированным ядром, а концентрация прогестерона, соответствующая II триместру беременности, ведет к формированию внеклеточных ловушек нейтрофилами.
Таким образом, в результате проведенного исследования установлено, что прогестерон в концентрациях, соответствующих I, II и III триместрам беременности, приводит к снижению кислородзависимой бактерицидной функции неактивированных нейтрофилов и, напротив, к усилению формирования внеклеточных ловушек, максимальное значение которых регистрируется в группе, где концентрация прогестерона соответствует II триместру беременности. Скорее всего, полученные данные в эффектах действия прогестерона на нейтрофилы можно объяснить различием в рецепторном аппарате, обеспечивающем бактерицидную функцию и формирование НВЛ.
Американские ученые показали, что при оплодотворении происходит стимуляция миграции нейтрофилов на слизистые оболочки женского репродуктивного тракта, где происходит образование НВЛ в ответ не только на различные микроорганизмы, но и на сперматозоиды. Интересно, что в семенной плазме были обнаружены различные виды ДНКаз, которые разрушают структуру НВЛ и освобождают связанные ловушками сперматозоиды, восстанавливая их подвижность. Также ученые предполагают, что некоторые белки плазмы способны подавлять активацию нейтрофилов в отношении сперматозоидов, но не бактерий. В связи с этим недостаточность ДНКаз-ной активности семенной плазмы или активности ее некоторых белков может быть одной из причин бесплодия [6].
На сегодняшний день считается, что прогестерон проявляет иммуносупрессивные и противовоспалительные свойства [1], и при изучении влияния прогестерона на окислительную
бактерицидность нейтрофилов мы подтверждаем данный факт, но интересно, что при этом прогестерон увеличивает количество НВЛ. Возможно, именно НВЛ принадлежит роль обеспечения антимикробной резистентности репродуктивного тракта матери и защиты плода от инфекций.
ЛИТЕРАТУРА
1. Алешкин В. А. Иммунология репродукции. - Чита, 2004.
2. Долгушин И. И., Андреева Ю. С., Савочкина А. Ю. Нейтрофиль-ные ловушки и методы оценки функционального статуса нейтрофилов. - М., 2009.
3. Ширшев С. В. Иммунология материнско-фетальных взаимодействий. - Екатеринбург, 2009.
4. Шмагель К. В. Иммунитет беременной женщины. - М., 2003.
5. Долгушин И. И., Андреева Ю. С. Нейтрофильные внеклеточные ловушки: метод обнаружения и оценка эффективности улавливания бактерий // Микробиология. - 2009. - № 2. - С. 65-67.
6. Alghamdi A. S., FosterD. N. Seminal DNase frees spermatozoa entangled in neutrophil extracellular traps // Biol. Reprod. - 2005. -Vol. 73. - P. 1174-1181.
7. Bouman A., HeinemanM. J., FaasM. M. Sex hormones and the immune response in humans // Hum. Reprod. Update. - 2005. - Vol. 11.- P. 411-423.
8. McDonnell D. P. Molecular pharmacology of estrogen and progesterone receptors // Menopause. Biology and Pathology. - , 2000.
-P. 459-480.
9. Molloy E. J. Amanda J. Sex-specific alterations in neutrophil apoptosis: the role of estradiol and progesterone // Blood. - 2003. - Vol. 102.- P. 2653-2659.
10. Zena M., Ghirardelloa A. Hormones, immune response, and pregnancy in healthy women and SLE patients // Swiss. Med. Wkly. -2010. - Vol. 140, N 13-14. - P. 187-201.
11. Fuchs T. A. Novel cell death program leads to neutrophil extracellular traps // J. Cell Biol. - 2007. - Vol. 176. - P. 231-241.
Поступила 13.02.12
К ст. И. И. Долгушина и соавт.
Рис. 1. Нативный препарат обогащенной фракции моноцитов. Лю- Рис. 3. Активация моноцитов при температуре 50°С в мазке (окра-минесцентная микроскопия (окрашивание акридиновым оранже- шивание акридиновым оранжевым; ув. 1000).
вым; ув. 1000). --------------------------------------------------------------
1 - моноцит; 2 - лимфоцит.
К ст. И. И. Долгушина и соавт.
Рис. 1. Фиксированный мазок чистой фракции нейтрофилов, активированных прогестероном в концентрации 50 нг/мл. Люминесцентная микроскопия (окрашивание акридиновым оранжевым; ув. 1000).
Морфологические формы нейтрофилов: 1 - нейтрофил с сегментированным ядром; 2 - нейтрофил с недифференцированным ядром; 3 - нейтрофильная внеклеточная ловушка.
Рис. 2. Оценка внутриклеточного кислородзависимого метаболизма нейтрофилов периферической крови с помощью индуцированного НСТ-теста. Световая микроскопия (окрашивание 0,1% раствором сафранина; ув. 1000).
