CC BY
59
Известия ТИНРО
2004 Том 138
ТЕХНОЛОГИЯ ОБРАБОТКИ ГИДРОБИОНТОВ
УДК 577.1
А.С.Гришин, Т.А.Давлетшина, С.В.Леваньков, Л.В.Шульгина
ФРАКЦИОННЫЙ СОСТАВ БЕЛКОВ МЯГКИХ ТКАНЕЙ АНАДАРЫ И ЕГО ИЗМЕНЕНИЯ ПРИ ТЕРМООБРАБОТКЕ
Проведены исследования фракционного состава белков мышечной ткани анадары (Anadara broughtoni). Установлено, что соединительнотканные белки, составляющие 38-48 % общего количества белка, представлены коллагеном и коннектином в соотношении 60: 40. Присутствие коннектина, молекулярный вес которого составляет более 2000 кДа, обусловливает плотность и упругость мяса анадары. Установлено, что ткани анадары содержат два типа волокон — фазного и тонического типов, с преобладанием второго. Показано влияние разных способов температурной обработки мышечной ткани анадары на содержание, состав и соотношение субъединиц соединительнотканных белков. Изучены реологические характеристики (модуль сохранения, модуль потерь и комплексный модуль) ткани анадары при разных способах температурной обработки и хранения.
Grishin A.S., Davletshina T.A., Levan'kov S.V., Shulgina L.V. Fractional structure of proteins of anadara muscular tissue and its changes at heat processing // Izv. TINRO. — 2004. — Vol. 138. — P. 368-380.
Fractional structure of anadara (Anadara broughtoni) muscular tissue proteins is investigated.
Muscular tissue of the anadara has two types of fibres: phase and tonic ones, with the second prevalence. Red color of anadara muscular tissue is conditioned by a high content of muscular chromoprotein located in sarcoplasma and represented mainly by two proteins: 4.4 % of cytochrome (molecular weight about 12 kDa) and 6.8 % of mioglobin (about 18 kDa). Heavy myosin (MHC) and easy myosin (MEC) are presented in the muscular tissue of anadara with ratio approximately 70: 30. The rheological characteristics (storage module, loss module, complex module) of the an-adara muscular tissue are investigated under different methods of temperature processing and storage.
Proteins of connective tissue (38-48 % of total protein) are represented by collagen and connectin in ratio 60: 40. Presence of connectin with molecular weight > 2000 kDa is the reason of high density and elasticity of the anadara meat. The content of connectin in anadara muscular tissue is 17-19 % of total fibrill proteins. The connectin forms 3D net structure of delicate filaments in the muscular tissue of anadara. This protein includes a-connectin, P-connectin and nebulin. Redistribution of these fractions of connectin with nebulin share decreasing and a-connectin, P-connectin shares increasing produces more stable form of connectin. The loss of water in the process of boiling is a reason of inactivation of tissue ferments and P-connectin share increasing, and as a result, anadara muscular tissue becomes harder. Sterilization stimulates heat destruction of all proteins: the total content of the proteins of connective tissue decreases to 30 %, and the content of collagen — to 25 %. As to connectin: the content of a-connectin decreases, the content of nebulin decreases, but the content of P-connectin increases slightly because of disturbance of
3D net structure of connectin. So, dynamic viscosity of anadara muscular tissue rises in 10 times in compare with raw material after blanching and boiling and in 3 times — after sterilization. These results correlate well with sensory estimation of samples consistence.
В связи с изменением промысловой обстановки и сокращением объема вылова традиционных объектов морского промысла возрос интерес к малоизученным и нетрадиционным видам. Среди последних особое внимание привлекают двустворчатые моллюски, в частности анадара (Anadara broughtoni).
Особенности химического состава анадары, а именно: содержание в мягких тканях до 50 % соединительнотканных белков, наличие богатого комплекса минеральных компонентов, а также термостабильных биологически активных веществ — таурина и карнозина (Аюшин и др., 1997; Зюзьгина, Купина, 1999, 2001; Струппуль и др., 2000), — позволяют рассматривать данный объект как перспективный в технологии пищевой продукции и одновременно проблемный и сложный для промышленной переработки. В ТИНРО-центре разработана технология соленой продукции и пресервов из анадары (Зюзьгина, 2003), вопросы производства стерилизованной продукции из этого сырья до настоящего времени не рассматривались.
Мягкие ткани анадары, используемые нами в технологии консервов, включают в себя ногу и мантию с аддуктором, причём нога составляет более 60 % общей массы всех съедобных частей.
Высокое содержание в мягких тканях анадары соединительнотканных белков обусловливает плотность, упругость мяса, что требует применения различных технологических приемов для его размягчения. В технологии пресервов, например, для размягчения и получения приемлемой консистенции мяса анадары проводится обработка сырья ферментным препаратом "Крузэнзим", представляющим собой комплекс протеиназ (Купина и др., 2003).
Известно, что консистенция мягких тканей гидробионтов с высоким содержанием коллагена при продолжительном воздействии высокой температуры размягчается, мясо теряет упругость, становится более доступным для пережевывания. Показательным в этом плане примером является мышечная ткань куку-марии японской, содержание коллагена в которой достигает 65 % (Слуцкая, 1975).
Предварительные исследования технологических свойств анадары показали, что под влиянием высокой температуры (варка, бланширование и стерилизация) мясо ноги анадары становилось плотнее, недоступнее для пережевывания, повышалась его упругость и жёсткость. Этим мягкие ткани анадары значительно отличаются от тканей других объектов с высоким содержанием коллагена. Поэтому было выдвинуто предположение о специфичности состава соединительнотканных белков анадары, обусловливающей неадекватные технологические свойства мяса моллюска при обработке.
Целью настоящих исследований являлось определение фракционного состава, свойств и стабильности белков мягких тканей анадары при хранении и термообработке.
Для проведения исследований были использованы нога анадары-сырца, а также мясо после бланширования, варки и стерилизации.
Фракционирование фибриллярных белков измельчённого мяса анадары проводили по методу Маруямы (Maruyama et al., 1977а). Водорастворимые белки экстрагировали 5 мМ раствором ЭДТА (рН 7,0) при соотношении ткань: экстрагент 1: 5, при температуре 6-8 оС в течение 4 ч при периодическом перемешивании. Для экстракции миофибриллярных белков использовали четырехступенчатую экстракцию раствором Хассельбаха-Шнайдера (0,6 М NaCl, 0,1 M NaH2PO4, 10 mM Na4P2O7, 1 mM MgCl2, pH 6,4).
Молекулярный вес белков определяли методом гельфильтрации на колонках ХК 16/60 с фазой Sephacryl-400 и колонках ХК 16/60 с фазой Sepharose CL-6B при скорости потока соответственно 0,61 и 0,52 мл/мин. Сигналы регистрировали на детекторе UVM-1 при длине волны 280 нм (оборудование фирмы Amersham Biosciense (Швеция). Белки элюировали буферным раствором 50 мМ NaH2PO4, 0,05 М NaCl, pH 7,08 -7,11.
Состав белковых фракций и молекулярный вес субъединиц саркоплазмати-ческих, миофибриллярных белков и коллагена определяли методом диск-ДСН-электрофореза по Веберу-Осборн (Weber, Osborn, 1969). Концентрирование проводили в геле с содержанием акриламида 3 % при напряжении 230 В, силе тока 15 мА. Для разделения использовали гели с концентрацией акриламида 10 %, при напряжении 100-110 В, силе тока 4-5 мА. Толщина пластинок составляла 1,4-1,6 мм. Общее время анализа — 8 ч. Фракционирование субъединиц кон-нектина проводили в неразделенных гелях с концентрацией акриламида 2 % при напряжении 140 В, силе тока 5 мА. Толщина пластинок составляла 1,01,1 мм. Общее время анализа 4 ч.
Количественный состав белковых фракций определяли на денситометре LKB 2400 GelScan XL (LKB, Швеция).
Спектры возбуждения и эмиссии регистрировали на флюориметре Shimadzu 5000 (Shimadzu, Я пония).
Реологические характеристики мягких тканей анадары определяли на ре-олографе Rheolograph Sol-535 (Toyo Seki Ltd, Япония). Были определены модули сохранения (GO, упругости (G"), рассчитан комплексный модуль (G*) и показатель динамической вязкости (п). Параллельно проводили органолептичес-кую оценку мяса анадары. Исследования проводили в следующем порядке: образец мяса анадары пропускали через мясорубку; подготовленный фарш гомогенизировали 1 мин при скорости 7000 об/мин в гомогенизаторе AM-10 (Nihonseki Kaisha ltd, Япония) и снимали показания на приборе Rheolograph Sol-535 (Toyo Seki Ltd, Япония). Комплексный модуль G* считали по формуле
I--G'
G* = J(G')2 + (G")2, динамическую вязкость —-, где 3 — частота колебания
2п ■ 3
ножа в Гц.
АТФазную активность актомиозина определяли по методу Като (Kato et al., 1977).
Скорость суперпреципитации определяли по методу Секи (Seki, Narita, 1980).
Фосфокиназную (ЕС 2.7.3.2), глицеральдегид-фосфатдегидрогеназную (ЕС 1.2.1.12) и альдолазную (EC 4.1.2.13) активность соответствующих ферментов определяли методами Скоупса (Scopes, 1971) и Росалки (Rosalki, 1967), используя специальные наборы фирмы Sigma Diagnostics Inc. (St. Louis, США).
Определение содержания гликогена в тканях анадары проводили антроно-вым методом (Крылова, Лясковская, 1965).
Известно, что фракционный состав мягких тканей анадары зависит от размерно-массовых характеристик моллюсков, сезонных и биологических факторов (Дзюба, Масленникова, 1982; Зюзьгина, Купина, 2001). Фракция саркоплазмати-ческих белков составляет обычно 22,8-24,6 %, миофибриллярных — 32,8-39,6 и соединительнотканных — 38,5-48,8 %.
В то время как в мягких тканях моллюсков выделяют белые и желтые мышцы (Ушаков, 1978), особенностью мяса анадары является ее красный цвет. Подобная окраска мягких тканей обусловлена достаточно высоким содержанием мышечных хромопротеидов, локализованных в саркоплазме. Состав изолированных из измельченного мяса анадары саркоплазматических белков представлен на рис. 1 (а).
Q
a
я ft с -с f-o
0
1 f-o ч с
Ьй о
OJ 3-
s f-
c
о
4V 5►
ЮН
О
12
40 45 50 55 60 Время, мин A A A AAA AM
¥ 5 6 7 8 910
б
Рис. 1. Общий (а) и субъединичный (б) состав водорастворимых белков мышечной ткани анадары: а — фрагмент хроматограммы водорастворимых белков мышечной ткани анадары, б — диск-ДСН-электрофорез водорастворимых белков мышечной ткани анадары в полиакриламид-ном геле. Стрелками показано положение белков-маркеров (ICN Pharmaceutic^, США), в скобках указан молекулярный вес (кДа): 1 — каталаза (232); 2 — гаммаглобулин (160); 3 — димер бычьего сывороточного альбумина (132); 4 — бычий сывороточный альбумин (66); 5 — овальбумин (45); 6 — карбоангидраза (29); 7 — соевый ингибитор трипсина (20,1); 8 — миоглобин (17,8); 9 — а-латальбумин (14,5); 10 — цитохром С (12,4) Fig. 1. The total (a) and subunit (6) composition of water-soluble proteins of muscular tissue of anadara: a — the fragment of the chromatogram of water-soluble proteins of muscular tissue of anadara, б — the disk-SDS-electrophoresis water-soluble proteins of muscular tissue of anadara in polyacryllamide gel. The position of standard proteins (ICN Pharmaceuticle, USA) are shown by arrows, molecular weight of standard proteins are shon in brackets: 1 — catalase (232); 2 — human gamma globulin (160); 3 — bovine serum albumin dimer (132); 4 — bovine serum albumin (66); 5 — ovalbumin (45); 6 — carbonic anhydrase (29); 7 — trypsin soy inhibitor (20.1); 8 — myoglobin (17.8); 9 — a-lactalbumin (14.5); 10 — cytochrome С (12.4)
Группа хромопротеидов, проявляющаяся на хроматограмме в области локализации низкомолекулярных белков (12-45 кДа) и обеспечивающая специфическую для мышц анадары окраску, представлена в основном двумя белками с молекулярным весом около 12 и 18 кДа (рис. 1, б). Идентификация со свидетелями, характерные значения максимумов сигналов поглощения в видимой области спектра (545-548 нм), максимумов возбуждения в УФ-свете (229-232 и 280-281 нм) и эмиссии в видимой области спектра (614-617 нм при длине волны возбуждения 280 нм) позволили идентифицировать данные белки как миоглобин (18 кДа) и цитохром (12 кДа). Содержание их составляло соответственно 6,8 и 4,4 % общего количества фракции саркоплазматических белков.
Белок с молекулярным весом около 160 кДа (19,6 % от общего количества водорастворимых белков) представлял собой тетрамер, поскольку давал на элек-трофореграмме одну полосу с электрофоретической подвижностью, соответствующей весу около 38 кДа. В соответствующих условиях (Scopes, 1971) белок обнаруживал альдолазную активность. Белок с молекулярным весом 140 кДа (12,2 %) представлял собой тетрамер субъединицы с молекулярным весом около 34 кДа и был нами идентифицирован (Nakagawa et al., 1988) как глице-ральдегид-фосфатдегидрогеназа. Белок с молекулярным весом около 90 кДа (около 6 %) на электрофореграмме давал две полосы приблизительно с одинаковым содержанием компонентов, электрофоретическая подвижность которых соответствовала молекулярным весам около 40 и 43 кДа, и обнаруживал фосфо-киназную активность. Очевидно, димерный белок с молекулярным весом около 90 кДа быль представлен смесью изоформ фермента с разными молекулярными весами субъединиц.
Преобладание ферментов гликолитического цикла в группе основных ферментов ресинтеза АТФ согласуется с достаточно высоким содержанием гликогена в мышечных тканях анадары — до 4 % — и позволяет рассматривать мышцы ноги анадары как медленные мышцы преимущественно тонического типа. Предположение о преимущественно тоническом типе мышц ноги анадары подтвердилось при изучении состава и свойств миофибриллярных белков.
Необходимо отметить, что экстракция миозина из мышц ноги анадары происходила с большим трудом даже раствором Вебера, при этом в основном экстрагировались актин и парамиозин. Поэтому для экстракции миозина использовали раствор Хассельбаха-Шнайдера и многоступенчатую процедуру экстракции (рис. 2, а).
Достаточно трудную экстрагируемость миозина из тонических волокон связывают с наличием прочных связей этого белка с другими компонентами мио-фибрилл — парамиозином и коннектином (Szent-Gyorgyi et al., 1971).
Анализ белков, экстрагированных из мышц ноги анадары раствором Хас-сельбаха-Шнайдера, позволил выявить некоторые особенности их состава. Так, миозин представлен на электрофореграмме широкой полосой с молекулярным весом около 210 кДа (рис. 2, а; дорожка 1, MHC, тяжелые цепи миозина) и набором полос белков с высокой электрофоретической подвижностью, соответствующей молекулярным весам в интервале от 16,5 до 26,5 кДа (рис. 2, а; дорожка 1, полосы MLC 1-4, легкие цепи миозина). Многоступенчатая обработка миофибрилл ткани ноги анадары раствором Хассельбаха-Шнайдера (рис. 2, а; дорожка: образец, полученный объединением всех четырёх экстрактов) позволила получить ряд экстрактов с различным составом белков зоны MLC электро-фореграммы. Если после второй экстракции (рис. 2, а; дорожка 2) качественный состав белков этой зоны практически не отличался от полученного для объединенного экстракта, то экстракт, полученный после третьей обработки, содержал в основном только самые тяжелые компоненты зоны MLC (рис. 2, а; полосы 1 и 2, дорожка 3). При этом как второй, так и третий экстракты давали положительную реакцию при дефосфорилировании АТФ в присутствии ионов магния.
Анализ количественного состава субъединиц миозина позволил установить следующие соотношения тяжелых (МНС) и легких (МЬС 1-4) цепей миозина — 1,0: 0,71: 0,84: 0,3: 0,16. Разница в содержании МНС и МЬС-1 составляет величину, близкую к величине содержания МЬС-4 (соответственно 0,13 и 0,16). При этом различие долей МНС и МЬС-1 составляет величину, практически равную величине содержания МЬС-3 (соответственно 0,29 и 0,3). Таким образом, можно сделать вывод о присутствии в мышцах ноги анадары как минимум двух изо-форм миозина. Сигнал МНС при этом является общим, так как в условиях анализа различий в электрофоретической подвижности тяжелых цепей обоих миозинов не обнаруживалось. Легкие цепи одной формы миозина представлены полосами с электрофоретической подвижностью, соответствующей молекулярному весу 26,5 кДа (МЬС-1) и 24 кДа (МЬС-2). Соотношение цепей миозина при этом составляет 2: 2: 2. Легкие цепи другой изоформы представлены белками с молекулярным весом 24,0; 18,0 и 16,5 кДа (соответственно МЬС 2-4) с соотношением всех цепей 2: 1: 2: 1. Таким образом, соотношение изоформ миозина в мышцах ноги анадары составляет величину, близкую к 70: 30.
12 3 12 3
а б в г
Рис. 2. Фибриллярные белки мышечных тканей анадары: а — миофибриллярные белки после экстракции раствором Хассельбаха-Шнайдера. Диск-ДСН-электрофорез в полиакриламидном геле: 1 — объединенный экстракт мышц ноги анадары, 2 — второй экстракт, 3 — третий экстракт; соединительнотканные белки: б — диск-ДСН-электро-форез в 10 %-ном полиакриламидном геле, в — ДСН-электрофорез в 2 %-ном полиакриламидном геле, г — хроматограмма. Стрелками указано положение маркеров: 2000 — голубой декстран (молекулярный вес 2000 кДа); 480 — апоферритин (480 кДа). MHC — тяжелые миозиновые цепи; Pm — парамиозин; Ac — актин; Tm — тропомиозин; MLC — легкие цепи миозина; Con — коннектин; Col — коллаген; а-C — а-коннектин; P-C — Р-коннектин; Ne — небулин
Fig. 2. Fibrillar proteins of muscular tissue of anadara: a — myofibrillar proteins isolated with Hasselbach-Shnader's solution. Disk-SDS-electrophoresis in polyacrylamide gel: 1 — anadara muscular tissue, 2 — first extract of muscular tissue, 3 — third extract of muscular tissue; connective tissue proteins: б — disk-SDS-electrophoresis in 10 % poly-acrylamide gel, в — disk-SDS-electrophoresis in 2 % polyacrylamide gel, г — chromato-gram: 2000 — blue dextran; 480 — apoferritin, MHC — myosin heavy chains; Pm — paramyosin; Ac — actin; Tm — tropomyosin; MLC — myosin light chains; Con — connectin; Col — collagen; а-C — а-connectin; P-C — P-connectin; Ne — neubulin
Вероятно, данный факт указывает на то, что мышцы ноги анадары содержат два типа мышечных волокон — фазного и тонического типов — и являются
мышцами смешанного типа. Это проявляется и в некоторых свойствах актоми-озина, экстрагируемого раствором Хассельбаха-Шнайдера. Актомиозин мышц анадары суперпреципитирует в растворах с низкой ионной силой в присутствии АТФ со скоростью (tj/2) около 16 мин и имеет линейный характер зависимости оптической плотности при 400 нм от времени, а его Mg^-АТФазная активность составляет величину около 0,028 мкмРн/мг/мин. Описанные параметры характерны для мышц тонического типа. В то же время выдерживание мышц анадары в течение 20 мин в физиологическом растворе, нагретом до 37 °С, более чем вдвое снижает выход миозина при последующей экстракции, хотя эта температура является предпороговой для тонического миозина. Кроме этого, полная инактивация миозиновой АТФазы наблюдается только при температуре 55 оС и выше, что хорошо согласуется со свойствами миозина мышц фазного типа (Варина и др., 1976).
Тропомиозин мышечной ткани анадары в отличие от этого белка в фазных мышцах (Cummins, Perry, 1975) представлен одной уширенной полосой, что не позволяет четко выделить его а- и Р-субъединицы. Этот факт отмечался в свое время и для мышечных тканей других моллюсков (Подгорная и др., 1976), для которых установлен преимущественный тонический тип мышц. Однако средний молекулярный вес субъединиц тропомиозина мышц анадары соответствует промежуточному значению, характерному для фазных (около 40 кДа) и тонических (около 34) мышц и составляет около 36,5 кДа. Все вышеперечисленные факты (состав и свойства миофибриллярных белков) позволяют охарактеризовать мягкие ткани ноги анадары как мышцы, для которых характерны свойства как тонического, так и фазного типа.
Высокое содержание парамиозина в комплексе миофибриллярных белков в литературе связывают с присутствием значительного количества коннектина в белках стромы (Takahashi, Saito, 1979). Установленное нами по методу Мару-ямы (Maruyama et al., 1977а) содержание коннектина в мягких тканях ноги анадары составляет величину 17-19 % общего количества всех фибриллярных белков. Коннектин образует внутри мышечных волокон трехмерную сетчатую структуру из особо тонких филаментов, выполняя функцию своеобразного несущего ствола внутри фибриллы. Даже в мышцах с более низким содержанием стромы эта группа белков ответственна как минимум за 30 % эластичности ткани (Maruyama et al., 1976а). Известно, что содержание коннектина в скелетных мышцах составляет 8-12 %, а в сердечной — до 18 % общей массы всех миофибриллярных белков (Toyoda, Maruyama, 1978). Этот белок способствует сохранению продольной целостности структуры мышцы, обеспечивая пассивную упругость, и ответствен за все напряжения покоя, присущие мышечным волокнам (Grimm, Whittehorn, 1966). Высокая агрегационная способность субъединиц коннектина, их молекулярный вес и стабильность in vivo являются факторами, определяющими высокую эластичность, упругость и прочность мышечных волокон (Kimura et al., 1984).
Методом Маруямы (Maruyama et al., 1977b) нами были выделены основные соединительнотканные белки мышц ноги анадары — коллаген и коннек-тин — и охарактеризован их состав. Коллаген представлен набором полос с различной электрофоретической подвижностью. Структура коннектина более проста и представлена дублетной — титин (Maruyama et al., 1981) — и одиночной — небулин (Kimura, Maruyama, 1983; Trinic et al., 1984; Wang et al., 1984) — полосами (рис. 2, в, г). Небулин, благодаря своему расположению, обеспечивает решетчатую структуру коннектина (Wang, Ramirez-Mitchell, 1983). Из литературы известно, что в-коннектин — более стабильная форма коннектина, в особенности по отношению к гидролизующим ферментам (Maruyama et al., 1977с; Suzuki, Katunuma, 1981). При хранении в мышечной ткани а-коннектин переходит в в-коннектин, что позволило предположить, что в а-коннектине существует
специфическая расщепляемая область ^еЫ, Wа1апаЬе, 1984). Однако было установлено, что изменение соотношения компонентов коннектина может быть и результатом структурных перестроек изоформ коннектина без участия протео-литических агентов (Китапо, Seki, 1993).
Одним из критериев оценки технологичности объекта являются реологические показатели. Поэтому в дальнейшем нами были проведены параллельные исследования по определению влияния разных способов обработки на реологические свойства и фракционный состав соединительнотканных белков ана-дары. Для этого были определены модули сохранения (б'), упругости (С) рассчитан комплексный модуль (б*) и показатель динамической вязкости п. Динамическая вязкость (п) мягких тканей анадары-сырца составляет 29-31 Па-с, модуль сохранения (б') имеет значения 0,88-1,06-103 Па, модуль потерь (С" — 0,55-0,57-103 Па. Величина комплексного модуля (б*) составляет 1,04-1,2-103 Па. Полученные значения динамических показателей представлены на рис. 3.
2,4
„- 1,9
(Э
3
1,4
0,9
0,4
] 3
} ) 2
/ ( / > 1
! с ..............с 4.................(.: ь
••>......1;ч
К ;
"ТС Г "Ь ;
Г 'У,
if \ / :
у ;
/ \ 1
\ к :.) :
(Ti...... , ..............f y :
.........i......... ......... ;
3 4
Образцы
а
10 9 8 7 6 5 4 3 2 1
8
Образцы б
10
Рис. 3. Изменения реологических характеристик мышечных тканей анадары при хранении (а) и обработке (б). Описание образцов приведено в тексте: 1 — G', 2 — G", 3 — G*
Fig. 3. Changes of rheological characteristics of muscular tissue of anadara at storage (a) and processing (б). The description of samples is resulted in the text: 1 — G' 2 — G", 3 — G*
В результате проведённых исследований установлено, что мягкие ткани анадары-сырца (рис. 3, а, образец 1) сохраняли стабильные значения реологических показателей при хранении в живом виде в створках в течение 5 сут при температуре от плюс 4 до плюс 8 °С (образец 2) или в подмороженном виде при температуре от минус 2 до минус 6 оС (образец 3). Незначительное увеличение показателей (рис. 3, а) наблюдалось при хранении сырца при температуре от 0 до 2 оС (образец 4) и для образца, хранившегося в замороженном виде в течение 2 мес при температуре минус 18 оС (образец 5). Фракционный состав соединительнотканных белков мяса анадары претерпел изменения.
Анализ методом электрофореза показал, что состав соединительнотканных белков был подвержен значительным изменениям как в количественном содержании и соотношении белков стромы, так и в соотношении субъединиц коннектина. Соотношение коллаген/коннектин изменялось от 60/40 (при содержании белков стромы 38-40 % общего белка) до 40/60 (30-33 %). Во всех экспериментах изменение содержания коннектина в строме сопровождалось изменением соотношения его субъединиц.
На рис. 4 показано, что все изменения в мышечной ткани ноги анадары под действием температуры проявлялись в увеличении доли в-коннектина за счет
снижения содержания а-коннектина и небулина. При этом доля а-коннектина уменьшалась значительно и при хранении образца в подмороженном виде (рис. 4). Хранение при более высокой температуре приводило практически к полному исчезновению полосы а-коннектина на электрофореграмме (рис. 4, в), как и при
Рис. 4. Состав компонентов коннектина образцов: а — анадара-сырец, свежая мышца ноги, б — мышца ноги, хранившаяся 2 сут при температуре 0 оС, в — мышца ноги, хранившаяся 1 сут при температуре 10 оС, г — мышца ноги, обработанная 3 мин при температуре 100 оС
Fig. 4. Composition of connectin components of muscular tissue of anadara: а — fresh anadara, fresh muscular tissue, б — the tissue of 2 days storage at temperature 0 оС, в — the tissue of 1 day storage at temperature 10 оС, г — the tissue after processing for 3 min at temperature 100 оС
Относительное содержание небулина также уменьшалось, но не столь значительно. Как мы уже отмечали, причиной таких изменений исследователи считают гидролиз а-коннектина протеолитическими ферментами (Suzuki, Katunuma, 1981) (рис. 4, б, в) или конверсию а-коннектина в в-коннектин в результате структурных перестроек (рис. 4, г) белка (Maruyama et al., 1977с). Независимо от причин изменение соотношения субъединиц коннектина сопровождалось дезинтеграцией коннектиновых филаментов, что, возможно, и является причиной тендеризации мышц на ранней постмортальной стадии.
С учетом выявленных изменений мышечной ткани были проведены эксперименты по установлению влияния разных способов обработки мяса ноги ана-дары на её органолептические, реологические показатели, а также на содержание и состав соединительнотканных белков. В полученных модельных образцах по остатку от трехкратной экстракции 0,1N NaOH при комнатной температуре или 6М мочевиной с добавкой 1 мМ дитио-треитола при 100 оС определяли содержание соединительнотканных белков.
При технологической обработке основные реологические характеристики изменялись значительно более существенно, чем при хранении (см. рис. 3, б). Так, для образцов после бланширования в створках текучим острым паром (образец 6) или в кипящей воде в течение 1 мин (образец 7) наблюдали значительное увеличение реологических характеристик.
При этом увеличение комплексного модуля происходило главным образом за счет модуля потерь. Образцы имели значительно более высокие показатели динамической вязкости по сравнению с сырцом и характеризовались жесткостью, твердостью, высокой эластичностью. При термообработке мяса анадары при температуре 115 оС (образец 8) получали образцы с аналогичными значениями комплексного модуля, однако его величина в основном определялась высокими значениями модуля сохранения. Аналогичная ситуация наблюдалась как для предварительно бланшированных образцов мяса (образец 9), так и небланширован-ных (образец 10).
температурной обработке (рис. 4, г).
в
Соотношение коллагена и коннектина определяли по остатку от экстракции коллагена 1N уксусной кислотой в течение 20 ч при 4-6 оС. Количественный состав коннектиновой фракции устанавливали методом электрофореза ДСН-растворимой фракции коннектина.
Для сравнительной оценки влияния других способов обработки на реологические свойства мягких тканей анадары были выбраны следующие группы образцов. Группа (А) включала образцы: мышечную ткань анадары-сырца (A—I); ткань моллюска, хранившегося в живом виде 5 сут (A—II) и 24 ч (A—III) при температуре 4-6 оС, а также 24 ч при температуре минус 12 оС (A—IV). Вторую группу (Б) составляли образцы мышечной ткани: бланшированная в воде при 90 оС (Б—V) и острым паром в створках (Б—VI).
Варку мышечной ткани осуществляли в воде при температуре 95-98 оС (B—VII), стерилизацию — при 115 оС без предварительного бланширования (Г— VIII) и после бланширования (Г—IX).
Представленные на рис. 5 результаты классифицировали по четырем группам (1-4), различающимся по реологическим и органолептическим показателям. Содержание соединительнотканных белков (рис. 5, б) в образцах данных групп хорошо коррелирует с реологическими и органолептическими характеристиками. Образцы группы 4, характеризующиеся минимальным содержанием белков стромы, имеют минимальное соотношение коллаген/кон-нектин (рис. 5, в).
Динамическая вязкость, Па с
400
300
200
IV V VI VII VIII IX
Органолептическая характеристика образцов:
□ □ □
консистенция мягкая, эластичная, сочная мягкость, сочность, эластичность выражены умеренно
жесткая, упругая
a -C
а- кон нектин
4 Ne
□ коллаген
□ коннектин
р- С - р- коннектин
небулин
Phc. 5. XapaKTepHCTHKH o6pa3upB aHa^apw (a), co^ep^aHHe (6) h cocTaB (b) coe^H-
HHTe^bHOTKaHHwx 6e^KOB
Fig. 5. Characteristics of anadara samples (a), content (6) and the composition (b) of proteins of connective tissue
Анализ результатов проведенных исследований позволил высказать предположение, что неадекватное отношение соединительнотканных белков мышечной ткани анадары к температурному воздействию различных уровней обусловливает реологические и органолептические свойства объекта (бланширование и варка, независимо от их продолжительности, приводили к уплотнению мышечной ткани, увеличению жесткости и упругости, стерилизация — к ее размягчению).
Данные, приведенные на рис. 5, показывают, что при повышении температуры происходит снижение количества соединительнотканных белков в мышечной ткани анадары, причем заметное снижение их количества отмечалось при температуре стерилизации. Как видно, это обусловлено термодеструкцией коллагена, который закономерно гидролизуется под действием высокой температуры. Его доля по отношению к общему содержанию белков мышечной ткани снижается: после бланширования незначительно, после варки — на 10-12 %, после стерилизации — на 23-25 %.
По-нашему мнению, в данном случае коллаген не является единственным ведущим фактором, характеризующим технологичность свойств мышечной ткани анадары. Поэтому нами рассмотрены изменения фракции коннектина в соединительнотканных белках под действием температуры различных уровней.
При бланшировании происходит перераспределение форм коннектина — незначительно снижается доля небулина, а-коннектин уменьшается в два раза и увеличивается доля ß-коннектина. Известно, что ß-коннектин является наиболее стабильной структурой и отличается высокой жесткостью (Maruyama et al., 1976b). Это, вероятно, обусловливает повышение жесткости и упругости мяса анадары после бланширования. Уплотнению мышечной ткани, по всей видимости, способствует значительная потеря воды (до 18-20 %), структурная организация (пространственная конфигурация) ß-коннектина, а также сохранение достаточного количества небулина, обеспечивающего решётчатую структуру коннектина.
Процесс варки приводит к еще большему увеличению доли ß-коннектина в результате значительного снижения а-коннектина, поэтому мышечная ткань практически не изменяет своих реологических и органолептических свойств, даже при увеличении продолжительности варки до 120 мин и более. Этому способствуют сохранение решётчатой структуры коннектина, потеря воды и инактивация тканевых ферментов.
При стерилизации отмечается уменьшение содержание коллагена на 2325 % и небулина, ответственного за решетчатую структуру коннектина, что сказывается на реологических и органолептических показателях мяса анадары, консистенция которого размягчается, становится менее упругой и плотной. Степень размягчения мяса анадары зависит от продолжительности температуры стерилизации.
Таким образом, основное влияние на консистенцию мышечной ткани анада-ры при термической обработке оказывают белки соединительной ткани: их общее содержание в объекте, соотношение коллагена и коннектина, соотношение субъединиц коннектина.
Установлено, что наиболее приемлемыми органолептическими (размягченной консистенцией) и реологическими показателями характеризуются образцы мышечной ткани анадары после стерилизации, которые отличаются минимальным содержанием соединительнотканных белков за счет снижения количества коллагена и небулина.
Литература
Аюшин Н.Б., Петрова И.Ю., Эпштейн Л.М. Таурин и карнозин в тканях тихоокеанских моллюсков // Вопр. питания. — 1997. — № 6. — С. 6-8.
Барина А.А., Железная Л.А., Готберг М.И. О стабильности различных уровней структуры сократительных систем // Биофизика и биохимия мышечного сокращения. — М.: Наука, 1976. — С. 112-118.
Дзюба С.М., Масленникова Л.А. Репродуктивный цикл двустворчатого моллюска Anadara broughtoni в южной части залива Петра Великого Японского моря // Биол. моря. — 1982. — № 3. — С. 34-40.
Зюзьгина А.А. Технология солёной продукции из анадары // Тез. докл. Всерос. конф. молодых учёных "Комплексные исследования и переработка морских и пресноводных гидробионтов". — Владивосток: ТИНРО-центр, 2003. — С. 130-132.
Зюзьгина А.А., Купина Н.М. Содержание макро- и микроэлементов в мягких тканях моллюска Anadara broughtoni // Изв. ТИНРО. — 1999. — Т. 125. — С. 14-16.
Зюзьгина А.А., Купина Н.М. Характеристика двустворчатого моллюска Anadara broughtoni как сырье для производства пищевых продуктов // Хранение и переработка сельхозсырья. — 2001. — № 1. — С. 40-42.
Крылова Н.Н., Лясковская Ю.Н. Физико-химические методы исследования продуктов животного происхождения. — М.: Пищепромиздат, 1965.
Купина Н.М., Зюзьгина А.А., Герасимова Н.А. и др. Применение современных биохимических методов в технологии пищевых продуктов из моллюсков // Тез. докл. Междунар. конф. "Рациональное природопользование и управление морскими биоресурсами: экосистемный подход". — Владивосток: ТИНРО-центр, 2003. — С. 245-246.
Подгорная О.И., Шелудько Н.С., Хайтлина С.Ю., Гармаковский А.Д. Сравнительное исследование тропомиозинов кролика и приморского гребешка // Биофизика и биохимия мышечного сокращения. — М.: Наука, 1976. — С. 151-154.
Слуцкая Т.Н. Исследования по химии и технологии трепанга и кукумарии: Авто-реф. дис. ... канд. техн. наук. — Владивосток, 1975. — 24 с.
Струппуль Н.Э., Лукьянова О.Н., Приходько Ю.Б., Алехина О.Г. Содержание селена в двустворчатых моллюсках залива Восток Японского моря // Пищевые биотехнологии: проблемы и перспективы в 21 веке. — Владивосток: ДВГАЭУ, 2000. — С. 321-323.
Ушаков Б.Б. О номенклатурах скелетных мышц и одиночных мышечных волокон // Биофизические и биохимические методы исследования мышечных белков. — Л.: Наука, 1978. — С. 6-14.
Cummins P., Perry S.V. Chemical and immunochemical characteristics of tropomyosin from striated and sooth muscle // Biochem. J. — 1975. — Vol. 141. — P. 43-49.
Grimm A.F., Whittehorn W.V. Characteristics of resting tension of myocardium and localization of its elements // Am. J. Physiol. — 1966. — Vol. 210. — P. 1362-1368.
Kato N., Uchiiyama H., Tsukamoto S., Arai K. A biochemical study on fish myofibrillar ATPase // Nipp. Suisan Gakk. — 1977. — Vol. 43. — P. 857-867.
Kimura S., Maruyama K. Preparation of native connectin from chikken breast muscle // J. Biochem. — 1983. — Vol. 94. — P. 2083-2085.
Kimura S., Maruyama K., Huang Yi. Interactions of muscle connectin with myosin, actin and actomyosin at low ionic strength // J. Biochem. — 1984. — Vol. 96. — P. 499-506.
Kumano Y., Seki N. Changes in a-connectin content during storage of iced, frozen and thrawed fish muscle // Nipp. Suisan Gakk. — 1993. — Vol. 59(3). — P. 559-564.
Maruyama K., Mabuchi I., Matsubara S., Ohashi K. An elastic protein from the cortical layer of sea urchin egg // Biochim. et biophys. acta. — 1976a. — Vol. 446. — P. 312-324.
Maruyama K., Natori R., Nonomura Y. New elastic protein from muscle // Nature. — 1976b. — Vol. 262. — P. 58-60.
Maruyama K., Matsubara S., Natori R. et al. Connectin, elastic protein. Charac-terizatin and function // J. Biochem. — 1977a. — Vol. 82. — P. 317-337.
Maruyama K., Marakami F., Ohashi K. Connectin, an elastic protein o muscle // J. Biochem. — 1977b. — Vol. 82. — P. 339-345.
Maruyama K., Kimura S., Kuroda M., Handa Sh. Connectin, an elastic protein of muscle // J. Biochem. — 1977c. — Vol. 82. — P. 347-350.
Maruyama K., Kimura S., Ohachi K., Kuwano Y. Connectin, an elastic protein of muscle. Identification of "titin" with connectin // J. Biochem. — 1981. — Vol. 89. — P. 701-709.
Nakagawa T., Watabe S., Hashimoto K. Identification of three major components in fish sarcoplasmic proteins // Nipp. Suisan Gakk. — 1988. — Vol. 54. — P. 999-1004.
Rosalki S.M. Improved procedure for creatine phosphokinase determination // J. Lab. Clin. Med. — 1967. — Vol. 69. — P. 696-704.
Scopes R.K. Purification of glycolitic enzymes by using affinity-elution chromatography // Biochem. J. — 1971. — Vol. 161, № 2. — P. 253-263.
Seki N., Narita N. Changes in ATPase activities and other properties of carp myofibrillar proteins during ice-storage // Nipp. Suisan Gakk. — 1980. — Vol. 46. — P. 207-213.
Seki N., Watanabe T. Connectin content and its post-mortem changes in fish muscle // J. Biochem. — 1984. — Vol. 95. — P. 1161-1167.
Suzuki K., Katunuma N. Connectin, an elastic protein o muscle. Effects of pro-teolitic enzymes in situ // J. Biochem. — 1981. — Vol. 89. — P. 711-715.
Szent-Gyorgyi A.G., Cohen G., Kendick-Jones J. Paramyosin and the filaments of molluscan "catch" muscle. Native filaments: isolation and characterization // J. Mol. Biol. — 1971. — Vol. 57. — P. 291-323.
Takahashi K., Saito H. Post-mortem changes in skeletal muscle connectin // J. Biochem. — 1979. — Vol. 85. — P. 1539-1542.
Trinic J., Knight P., Whiting A. Purification and properties of native titin // J. Mol. Biol. — 1984. — Vol. 180. — P. 331-356.
Toyoda N., Maruyama K. Fine structure of connectin nets in cardiac myofibrils // J. Biochem. — 1978. — Vol. 84. — P. 239-241.
Wang K., Ramirez-Mitchell R. A network transverse and longitudinal intermediate filamments is associated with sarcomeres of adult vertebrate skeletal muscle // J. Cell Biol. — 1983. — Vol. 96. — P. 562-570.
Wang K., Ramirez-Mitchell R., Palter D. Titin is an extraordinarily long, flexible and slender myofibrillar protein // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. — 1984. — Vol. 81. — P. 3685-3689.
Weber K., Osborn M. The reliability of molecular weight determinations by dodecyl sulfate — polyacrylamide gel electrophoresis // J. Biol. Chem. — 1969. — Vol. 224. — P. 4406-4412.
Поступила в редакцию 14.05.04 г.
