CC BY
10ФАРМАКОГНОЗИЯ И БОТАНИКА
О.А. Ёршик, Г.Н. Бузук
ФРАКЦИОНИРОВАНИЕ ПРОАНТОЦИАНИДИНОВЫХ КОМПЛЕКСОВ КОРНЕВИЩ С КОРНЯМИ САБЕЛЬНИКА БОЛОТНОГО COMARUM PALUSTRE L.
Витебский государственный медицинский университет
В статье разработаны методики фракционирования проантоцианидиновых комплексов корневищ с корнями сабельника болотного. Фракционирование проводили по двум методикам: на колонке с полиамидом и на колонке с сорбентом «Диасорб-100-С16». Каждая из полученных фракций была количественно охарактеризована и, на основании полученных данных, определена доминирующая группа комплексов проантоцианидинов. Хроматографическое исследование методами ТСХ и ВЭЖХ фракций, полученных на колонке с полиамидом, подтвердило содержание в каждой из хроматографических зон только одного вещества, что свидетельствует об эффективности разделения. По временам удерживания хроматографических зон, полученные вещества были найдены в цельных фракциях, полученных на полиамиде. Определена доминирующая группа проантоцианидинов корневищ с корнями сабельника болотного: олигомеры про-антоцианидинов со степенью полимеризации 2-8 (фракционирование на полиамиде), низкомолекулярные проанто-цианидины со степенью полимеризации меньше 5 (фракционирование на С16-силикагеле).
ВВЕДЕНИЕ
Олигомерные проантоцианидины -одни из самых интересных и важных для человека представителей растительных полифенольных соединений. Главное от-
личие проантоцианидинов от остальных полифенольных соединений в том, что они составляют основную (до 80%) часть потребляемых человеком биофлавоноидов. Кроме вина в список продуктов питания, богатых проантоцианидинами и мономерными катехинами, входят виноград, яблоки, бобы, пшеница, а также какао, кофе, чай всех видов [1]. Основную часть от этого количества составляют проантоциани-дины и их мономерные звенья - катехины и лейкоантоцианидины, так как только эти соединения флавоноидной природы способны образовывать полимерные структуры.
С точки зрения химического строения проантоцианидины представляют собой полимерные флаван-3-олы, которые имеют типичный С6-С3-С6-флавоноидный скелет (рис. 1).
Наиболее широко в пищевых продуктах растительного происхождения распространены проантоцианидины с расположением гидроксильных групп в положении 3',4'- в кольце В и продельфинидины с 3',4',5'-тригидрокси-замещением. Проанто-цианидины часто встречаются в растительных продуктах и напитках в смеси с продельфинидинами. Проантоцианидины существуют в виде растворимых в воде олигомеров, содержащих от двух до шести катехиновых единиц, а также в виде нерастворимых в воде полимеров со степенью полимеризации от 7 и выше, которые представляют собой основную (до 80%) часть проантоцианидиновых комплексов
[1]. Катехиновые единицы в проантоциа-нидинах в основном связаны через атомы углерода, находящиеся в 4-м, 8-м или 6-м положениях. Такие проантоцианидины относятся к типу В (димеры) и типу С (три-меры). У проантоцианидинов А типа мономерные единицы связаны двумя связями (одной С-С и одной С-О).
Целью данной работы является разработка методик фракционирования про-антоцианидиновых комплексов корневищ с корнями сабельника болотного, позволяющих количественно охарактеризовать каждую фракцию. По результатам прове-
денных методик фракционирования идентифицировать доминирующую группу
комплексов проантоцианидинов с определенной степенью полимеризации.
OH
Рис. 1. Пример проантоцианидина, выделенного из растения Sorghum (эпикатехин-[(4ß->8)-эпикатехин]l5-(4ß->8)-катехин). МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В качестве объекта исследования использовали корневища с корнями сабельника болотного, заготовленные в сентябре 2006 г. в местах естественного произрастания в окрестностях г. Витебска Республики Беларусь. До проведения анализов образцы хранились в бумажных пакетах при комнатной температуре.
Согласно литературным данным [2,
Поэтому фракционирование проантоциа-нидиновых комплексов корневищ с корнями сабельника болотного проводили по двум методикам: на колонке с полиамидом и на колонке с С1б-силикагелем.
Определение общего содержания фенольных соедиений во фракциях, в пересчете на галловую кислоту, проводили по фотометрической методике, основанной на их окислении реагентом Фолина-Чокальте, содержащим фосфоромолибдат и вольфрамат натрия [4].
Определение содержания проанто-цианидинов во фракциях проводили по модифицированной методике Porter, в основе которой лежит кислотное расщепление процианидинов до антоцианидинов в присутствии катализатора (ионов Fe3) [5].
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ
Методика фракционирования на сорбенте «Диасорб-ІОО-С^»
Около 0,5 г сырья (точная навеска), измельчённого до размера частиц, проходящих сквозь сито с диаметром 0,25 мм, экстрагировали 15 мл дистиллированной воды на кипящей водяной бане в течение 20 минут. Готовое извлечение охлаждали и центрифугировали со скоростью 1000 об/мин в течение 15 минут. Доводили рН извлечения до 7 титрованием 0,1 М раствором натрия гидроксида.
Фракционирование проводили на колонке, содержащей 500 мг С1б-силика-геля. Колонку предварительно кондиционировали 10 мл этилового спирта. После
этого через колонку с С1б-силикагелем пропускали 10 мл извлечения корневищ с корнями сабельника болотного и элюировали 10 мл дистиллированной воды для удаления водорастворимых полифенолов и объединяли с образцом, собранным после нанесения (фракция I). Объем полученной фракции I составил 20 мл. После этого колонку с С1б-силикагелем просушивали в токе азота. Последующие фракции получали следующим образом:
• фракция II+III (мономерные кате-хины (MR), низкомолекулярные проантоцианидины (НИПЦ) (n<5) и других небольшие фенольные молекулы)- элюированием 20 мл этилацетата;
• фракция IV (высокомолекулярные проантоцианидины ^MKU,) (n>5))-элюированием 20 мл метанола.
Фракцию II+III упаривали досуха в вакууме при температуре <25°С, растворяли в 5 мл дистиллированной воды и наносили на ту же колонку, предварительно промытую 20 мл дистиллированной воды. После этого колонку с С1б-силикагелем просушивали в токе азота. Для разделения мономерных катехинов (M^ и низкомолекулярных проантоцианидинов (HMŒU) (n<5) применяли последовательное элюирование: 20 мл диэтилового эфира - фракция II (мономерные катехины (MX) и 20 мл метанола - фракция III (низкомолекулярные проантоцианидины (Н^ПР,) (n<5))
[2].
Результаты количественного определения комплексов проантоцианидинов в пересчете на галловую кислоту представлены в таблице 1.
№ фракции фракция относительное содержание, %
I фенолокислоты (ФК) 33,38
II мономерные катехины (M^ 22,52
III низкомолекулярные проантоцианидины (HM^) (n<5) 27,82
IV высокомолекулярные проантоцианидины ^ПЦ) (n>5) 14,б9
Исходя из данных таблицы 1, суммарное значение фракций составило 98,41%, что приближается к теоретическо-му-100%. Среди фракций проантоциани-динов доминирующей является фракция III (табл. 1): низкомолекулярные проантоциа-нидины (ИЖИЦ) (n<5) 27,82%.
Методика фракционирования на полиамиде
Около 0,5 г сырья (точная навеска), измельчённого до размера частиц, проходящих сквозь сито с диаметром 0,25 мм, экстрагировали 20 мл 70% этилового спир-
та на кипящей водяной бане в течение 20 минут. Готовое извлечение охлаждали и центрифугировали со скоростью 1000 об/мин в течение 15 минут.
Фракционирование проводили на колонке, содержащей 500 мг полиамида. Колонку предварительно кондиционировали 10 мл дистиллированной воды, а затем 10 мл метанола. После этого через полиамид пропускали 10 мл спиртового извлечения корневищ с корнями сабельника болотного. Фракционирование проводили по следующей схеме (табл. 2).
Таблица 2 - Схема фракционирования проантоцианидинов корневищ _________________с корнями сабельника болотного_______________
№ фракции Элюат Элюирующий обьем
I 9б% этанол 4^10 мл
II 9б% этанол:ацетон:вода 80:1б:4 8^10 мл
III ацетон: вода 70:30 1x10 мл
Фракция I: пропускали 4 порции 96% этанола по 10 мл, первую порцию собирали, остальные три отбрасывали.
Фракция II: пропускали 8 порций элюирующей смеси по 10 мл, первую порцию собирали, остальные семь отбрасывали.
Фракция III: пропускали 10 мл элюирующей смеси и фракцию собирали
[3].
Каждую фракцию высушивали под вакуумом при 40°С и сухой остаток растворяли в 1 мл 9б% этанола.
Результаты количественного определения комплексов проантоцианидинов в пересчете на цианидин хлорид представлены в таблице 3.
Таблица 3 - Количественное содержание комплексов проантоцианидинов во фракциях
№ фракции фракция содержание, %
I флавоноиды 4,1
II олигомеры проантоцианидинов (n=2-8) б,0
III полимеры проантоцианидинов (n>8) 0,1
По результатам количественного определения (табл. 3.) доминирующей
группой являются олигомеры проантоциа-нидинов со степенью полимеризации 2-8 (фракция II): б,0%.
Далее нами проводилось хроматографическое исследование методами ТСХ и ВЭЖХ фракций, полученных на колонке с полиамидом.
Хроматографическое исследование методом ТСХ
№ линию старта пластинки «Сорб-фил ПТСХ-В» наносили с помощью градуированного капилляра по 2 мкл каждой фракции в виде полоски: длиной 5 мм и шириной 5 мм.
Хроматографическую пластинку помещали в камеру, которую предварительно насыщали в течение 2 часов смесью растворителей этилацетат: метанол: вода:
муравьиная кислота (8,5:0,3:0,35:0,4). Состав данной оптимальной хроматографической системы был нами установлен в ходе предварительных исследований.
Пластинку хроматографировали восходящим способом. Когда фронт растворителей пройдет около 10 см, пластинку вынимали из камеры, и сушили на воздухе до полного удаления растворителей.
Для обнаружения проантцианиди-нов хроматограмму опрыскивали 1 % раствором ванилина в этиловом спирте, затем погружали на 1-2 мин в 10% раствор серной в этиловом спирте и выдерживали в сушильном шкафу при температуре 100-105°С в течение 5 минут. Появление на хроматограмме зон, окрашенных в красный цвет, свидетельствует о содержании во фракциях проантоцианидинов. В таблице 4 приведены значения Rf полученных хроматографических пятен.
Таблица 4 - Значения Rf хроматографических пятен выделенных
Фракция Rf
I 71-77 40-49
II 50-5б
III 28-32
Согласно литературным данным [6], 70% водный раствор ацетона обладает высокой элюирующей способностью и позволяет практически полностью десорби-
ровать с полиамида сумму проантоциани динов. H рис. 2 представлены хроматограмма и денситограмма суммы проанто цианидинов, полученные путем элюирова
Рис. 2. Хроматограмма и денситограмма суммы проантоцианидинов корневищ с корнями сабельника болотного ( —старт)
Хроматографическое исследование методом ВЭЖХ
На линии старта пластинок «Сорб-фил ПТСХ-В» наносили с помощью градуированного капилляра по 10 мкл каждой фракции в виде полоски и хроматографировали в условиях, описанных выше. Высушенные на воздухе хроматограммы, делили на 2 части: первую часть проявляли, как описано выше, со второй части хроматограмм соскабливали сорбент на уровне проявленных пятен первой части пластинок и растворяли в 0,5 мл 96% этилового спирта. Исследования проводили на хроматографе Agilent HP 1100. В работе при-
меняли обращеннофазный метод: неподвижная фаза - колонка Zorbax SB-C 18 (4,6x250 мм), подвижная фаза - ацетонитрил-0,1 % фосфорная кислота в соотношении 10:90. Оптимальные условия хроматографирования были подобраны экспериментально. Анализ проводили при 20°С в изократическом режиме элюирования со скоростью подачи элюента 1 мл/мин. Для детектирования применяли УФ-детектор (Х=280 нм). По 20 мкл полученных извлечений вводят в хроматограф и анализируют в описанных выше условиях. В таблице 5 приведены значения времен удерживания (t) фракций проантоцианидинов.
Таблица 5 - Значения времен удерживания (t) фракций проантоцианидинов.
Фракция t, мин
I 12,9
10,8
II 11,3
III 8,6
Исходя из полученных данных, в каждой из хроматографических зон фракций, полученных на полиамиде, содержится только одно вещество, что свидетельствует об эффективности разделения.
По временам удерживания хроматографических зон, полученные вещества были найдены в цельных фракциях, полученных на полиамиде.
ВЫВОДЫ
Разработаны методики фракционирования комплексов проантоцианидинов корневищ с корнями сабельника болотного, не требующие применения сложного оборудования и позволяющие количественно охарактеризовать каждую фракцию.
Определена доминирующая группа проантоцианидинов корневищ с корнями сабельника болотного: олигомеры проан-тоцианидинов со степенью полимеризации 2-8 (фракционирование на полиамиде), низкомолекулярные проантоцианидины со степенью полимеризации меньше 5 (фракционирование на С16-силикагеле).
ЛИТЕРАТУРА
1. Спрыгин, В.Г. Природные олигомерные проантоцианидины - перспективные регуляторы метаболических нарушений /
B.Г. Спрыгин, Н.Ф. Кушнерова // Вестник ДВО РАН. - 2006. - №2. - С. 81-90.
2. Спрыгин, В.Г. Метод оценки и стандартизации олигомерных проантоциани-диновых комплексов, полученных из различных видов растительного сырья / В. Г. Спрыгин, Н.Ф. Кушнерова // Химикофармацевтический журнал. - 2002. - Т 36. - № 3. - С. 31-35.
3. Kathrin, Koll. Optimierung und Validierung dunnschichtchromatographischer
Verfahren in der Qualitatsanalytik von Phyto-pharmaka: dis. ... zur Erlangung des Doktorgrades / Kathrin Koll. -- Bonn. 2004. - 104 с.
4. Гнедков, П.А. О качестве сырья для
получения препарата Биосед / П. А. Гнедков, А.П. Гнедкова// Химико-
фармацевтический журнал. - 1975. - Т 9. -
C. 36-41.
5. Ёршик, О.А. Количественное определение проантоцианидинов в сабельнике болотном Comarum palustre L. / О.А. Ёршик, Г.Н. Бузук // Вестник Фармации. -2007. - № 4. - С. 10-17.
6. Miami University's centralized web server for personal web pages [Electronic resource] / Professor Ann E. Hagerman. - Tannin Chemistry. - Oxford, 2002. - mode of access: http://www.users.muohio.edu/hagermae/tanni n.pdf - Date of access: 1.10.2006.
SUMMARY O.A. Yorshyk, G.N. Buzuk FRACTIONING OF PROANTHOCYANIDINS COMPLEXES OF RHIZOMES WITH ROOTS OF COMARUM PALUSTRE L.
The article is devoted to the methods of fractioning of proantocyanidins complexes of rhizomes with roots of Comarum palustre, which do not require sophisticated equipment. The fractioning was conducted according to two methodics: on a stand - pipe with polyamid and on a stand - pipe with sorbent «Di-asorb - 100 - C16». Each of the obtained fractions was quantitatively assessed, and on the basis of the received data the dominating group of proantocyanidins complexes with a certain level of polymerization was defined. A chromatographic investigation by methods TLC (Thin Layer Chromatography) and HPLC (High Perfamance Liquid Chromatography) of fractions, received on a stand - pipe with polyamid, confirmed the presence in each chromatographie zone of just one substance, which confirms the effectiveness of fractioning. By times of keeping the chromatographie zones, the obtained substances vere discovered in whole fractions, obtained on polyamid. The dominating group of proantocyanidins in rhizomes with roots of Comarum palustre was defined as follows: «oligomeric proantocyanidins with the degree of polymerization 2-8 (fractioning through polyamide), low molecular proantocyanidins with the degree of polymerization less than 5 (fractioning through C16 - silicagel).
