CC BY
24
крови (МКПК) человека (моноцитов, NK-клеток, В-клеток, Т-цитотоксических, Т-хелперных лимфоцитов) поглощать индуцированные микровезикулы, происходящие из ме-зенхимных стволовых клеток in vitro.
МКПК выделяли из периферической крови человека методом градиентного центрифугирования в Фиколле. МВ-ЦВ получали из мезенхимных стволовых клеток (МСК) жировой ткани человека путем обработки 10 мкг/мл цитохалазина В в течение 30 мин с последующим центрифугированием: 1) 100 g — 10 мин; 2) 300 g — 20 мин; 3) 2000 g — 25 мин. МВ-ЦВ МСК окрашивали мембранным красителем DiD 5 мкМ в течение 15 мин (37°C, 5% CO2) и дважды промывали полной средой. МКПК обрабатывали 10 мкг МВ-ЦВ в течение 24 ч и детектировали поглощающую способность с помощью моноклональных антител на проточном цитофлу-ориметре-сортере BD FACS Aria III.
Результаты иммуноокрашивания показали, что 99,5 ± 0,26% моноцитов (CD14+ клетки), 69,43 ± 9,52% В-клеток (CD3-CD20+); 35,6 ± 3,83% Т-цитотоксических лимфоцитов (CD3+CD8+); 29,6 ± 3,2% NK-клеток (CD3-CD56+) и 14,5 ± 4,42% Т-хелперных лимфоцитов (CD3+CD4+) — содержат DiD в своем составе, а значит слились с МВ-ЦВ МСК. Самый высокий процент слияния/поглощения наблюдали в популяции моноцитов и В-клеток (99% и 69% соответственно). Полученные результаты были подтверждены с помощью конфокальной микроскопии, где мы наблюдали мембранный компонент МВ-ЦВ (DiD+) как на клеточной поверхности, так и внутри МКПК.
Наши данные показывают, что моноциты и В-клетки преимущественно захватывают МВ-ЦВ МСК, в то время как NK-клетки, Т-цитотоксические лимфоциты и Т-хелперы проявляют меньшую способность захватывать индуцированные микровезикулы. Работа выполнена в рамках Программы стратегического академического лидерства Казанского федерального университета (ПРИ0РИТЕТ-2030) и за счет средств гранта Российского научного фонда № 21-75-10035.
АКТИВАЦИЯ СИГНАЛЬНОГО ПУТИ HEDGEHOG В ЭПИФИЗАРНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТКАХ УВЕЛИЧИВАЕТ РОСТ КОСТИ
А.Д. Куренкова1, D. Trompet2, 3, B. Zhou3, А.П. Усанова1, T.L. Chu3, A. Are4, M. Kasper4, А.С. Чагин1 2, 3
1 Институт регенеративной медицины, Первый МГМУ им. И.М. Сеченова (Сеченовский университет), Москва, Россия
2 Институт медицины, Гётеборгский университет, Гётеборг, Швеция
3 Кафедра физиологии и фармакологии, Каролинский институт, Стокгольм, Швеция
4 Кафедра клеточной и молекулярной биологии, Каролинский институт, Стокгольм, Швеция
e-mail: n_kurenkova@mail.ru
Ключевые слова: пластинка роста, стволовые клетки, Hedgehog.
Увеличение трубчатых костей в длину происходит благодаря наличию эпифизарных пластинок роста. Недавно в пластинках роста была описана популяция стволовых клеток [1, 2]. Чтобы определить роль этих стволовых клеток в регуляции роста костей, в данной работе мы генетически и фармакологически стимулировали пролиферацию
стволовых клеток через активацию сигнального пути Hedgehog (Hh) и смотрели приводит ли это к изменению длины кости.
Для того, чтобы специфически отметить и отслеживать стволовые клетки пластинки роста, мы использовали линию мышей PthrpCreER, скрещенную с репортерной линией R26R-tdTomato [2]. Десять последовательных в/б инъекций SAG (агонист Hh сигнального пути) 30дневным мышам приводили к увеличению количества делящихся tdTomato+ клеток через 8 дней: количество клонов, состоящих из двух и трёх клеток увеличивалось на 68,9%, с одновременным падением количества одиночных клеток на 29,6% а количество пролиферирующих Ki67+tdTomato+ стволовых клеток возрастало в 5 раз. Три внутрисуставные инъекции SAG оказывали аналогичный по направлению и силе эффект.
Чтобы проверить, что влияние активации Hh на про-лиферативную активность клеток опосредовано прямым воздействием на стволовые клетки, линию PthrpCreER;R26R-tdTomato скрестили с линией Patched 1Л/Л. Через 10 дней после активации Cre-рекомбиназы абляция Patchedi приводила к появлению в пластинке больших многоклеточных клонов tdTomato+ клеток, в то время как в контроле было больше одиночных клеток. Таким образом, и фармакологическая, и генетическая активация Hh сигнального пути приводит к увеличению пролиферации стволовых клеток пластинки роста.
Для того, чтобы проверить как фармакологическая активация Hh влияет на рост кости, SAG вводили 30-дневным крысам локально во вторичный центр окостенения над пластинкой роста в бедренной кости, поскольку при внутрисуставной инъекции активация Hh может вызывать остеоартрито-подобные изменения в суставном хряще. Для пролонгации действия и фиксации в кости SAG вводили вместе с агарозными бидсами. Эксперименты с использованием Gli1-LacZ мышей подтвердили, что высвобождение SAG происходит и через неделю после имплантации. Имплантация SAG крысам приводила к увеличению Ki67+ клеток в зоне покоя пластинки роста через 1 неделю, через 1 месяц наблюдали значимое увеличение длины бедренной кости на 3% (1 ,1 мм), через полгода разница составила 4% (1,4 мм).
Таким образом, мы показали, что активация сигнального пути Hh вызывает увеличение пролиферации стволовых клеток пластинки роста, что в дальнейшем ведёт к увеличению длины конечности. Данный принцип может быть использован для коррекции нарушений роста длинных костей.
Литература:
1. Newton, P. T., Li, L., Zhou, B. et al. Nature. 2019. V. 567(7747).
P. 234-238
2. Mizuhashi, K., Ono, W., Matsushita, Y., et al. Nature 2018. V.
563(7730). P. 254-258.
ФОРМИРОВАНИЕ ПАТТЕРНА ИЗ ГИДРОКСИАПАТИТА В МАТРИЦЕ БАКТЕРИАЛЬНОЙ ЦЕЛЛЮЛОЗЫ
М.А. Кутырев, Е.И. Шишацкая, Е.В. Скорб, С.А. Уласевич
Санкт-Петербургский университет информационных технологий, механики и оптики, Санкт-Петербург, Россия
e-mail: kutyrev@infochemistry.ru
Ключевые слова: бактериальная целлюлоза, гидроксиапа-тит, кольца Лизеганга, биосовместимость.
В области регенеративной медицины бактериальная целлюлоза, благодаря своей биосовместимости, биоразлагаемости и не токсичности, представляет большой интерес в качестве материала для имплан-тов, повязок для ран и ожогов, так как ее структура способна имитировать ткани организма [1]. Однако адгезия клеток на поверхности бактериальной целлюлозы затруднена, что ограничивает применение этого материала при разработке биомиметических импланта-тов. В связи с этим для улучшения клеточной адгезии и повышения механической прочности поверхность материала модифицировали фосфатами кальция, которые также влияют на упорядоченность волокон в структуре [2].
Существуют различные подходы по модификации бактериальной целлюлозы гидроксиаптатитом (ГА) такие как гидротермальный и золь-гель синтезы. Наиболее перспективным методом является химическое осаждение частиц ГА на поверхности бактериальной целлюлозы при погружении лиофилизирован-ных пленок биополимера в буферный раствор хлорида кальция (рН = 7,2), однако данный способ позволяет сформировать однородное покрытие из конгломератов фосфатов кальция на поверхности матрицы целлюлозы [3] в то время как в некоторых случаях для равномерного восстановления ран необходима различная скорость пролиферации клеток.
В связи с этим целью данной работы является разработка градиентных материалов на основе периодически упорядоченного паттерна ГА и бактериальной целлюлозы.
В данной работе формирование периодических структур ГА получали по аналогии их образования в агаровой матрице [4]. Ксерогель и гидрогель бактериальной целлюлозы предварительно выдерживали в растворе фосфатного буфера (рН = 7,4) для насыщения матрицы биополимера фосфат-ионами, затем на поверхность целлюлозной матрицы капали раствор хлорида кальция, который при его диффузии внутрь 30-структуры целлюлозного материала формировал периодически упорядоченные осадки в виде колец Лизеганга. Периодически упорядоченные осадки прокрашивали ализариновым красным для визуализации диффузии ионов кальция внутрь гидрогеля. Фосфаты кальция детектировались рентгенофазовым анализом. Биосовместимость полученных структур исследовали с помощью клеточной линии С2С12 и клеток HeLa. Установлено, что на целлюлозе с 30-паттернами ГА наблюдалась более высокая пролиферация клеток по сравнению с контрольными образцами.
Таким образом, разработан новый способ модификации бактериальной целлюлозы упорядоченными паттернами ГА, позволяющий формировать участки с повышенной клеточной плотностью.
Литература:
1. Klemm D., Ahrem H., Kramer F. et al. in book: Bacterial Cellulose: a sophisticated multifunctional material, 1st ed. CRC Press, 2012. P. 176.
2. Bayir E., Bilgi E. et al. Cellulose. 2019. V. 26. P. 9803-9817.
3. Athukorala S.S., Liyanage C.J. et al. Soft Materials. 2022. V. 2. P. 183-192.
4. Ulasevich S.A., Eltantawy M.M., Skorb E.V. et al. Adv. Nano-Biomed Res. 2021. V. 1. № 5. Art. № 2000048/
ИЗМЕНЕНИЕ СТРУКТУРЫ И ФУНКЦИИ ЦИТОХРОМА С ПРИ ВЗАИМОДЕЙСТВИИ С КАРДИОЛИПИНОМ: СТРУКТУРА БЕЛКА, ЕГО ПЕРОКСИДАЗНАЯ АКТИВНОСТЬ И СВОБОДНО РАДИКАЛЬНЫЕ ПРОЦЕССЫ
И.Н. Левченко1, Г.К. Владимиров2, И.В. Володяев3
1 Российский Национальный Исследовательский Медицинский Университет им. Н.И. Пирогова, Москва, Россия
2 Первый Московский Государственный Медицинский Университет им. И.М. Сеченова, Москва, Россия
3 Биологический факультет, МГУ
им. М.В. Ломоносова, Москва, Россия
e-mail: irnlevchenko@yandex.ru
Ключевые слова: цитохром С, кардиолипин, пероксидазная активность, кумарины, триггер апоптоза, перекисное окисление липидов, активированная хемилюминесценция, комплекс цитохрома С.
Цитохром С в клетке, в водной среде или в неполярном окружении может находиться как в свободном состоянии, так и в комплексе с кардиолипином. В последнем случае он частично денатурирован, характеризуется специфической конформацией, обладает пероксидазной активностью и является важным компонентом проапоп-тотических сигнальных путей [1, 2, 4]. Различия между нативным цитохромом С и комплексом цитохром С-кардиолипин регистрируются по спектрам поглощения и флуоресценции, а также по выраженной пероксидаз-ной активности последнего и хемилюминесценции, сопровождающей запускаемые им свободно-радикальных процессы.
Хемилюминесценция, сопровождающая рекомбинацию липидных радикалов, генерируемых вследствие пероксидазной активности комплекса цитохром С-кар-диолипин, активируется природными красителями, такими как кумарины. Ярким примером является сенсибилизатор С-525. Он устойчив к прямому окислению пероксидом водорода, поэтому не влияет на протекание липопероксидазных реакций и является физическим активатором. Использование C-525 и других подобных красителей позволяет с высокой точностью регистрировать кинетику образования липидных радикалов в этой системе и, следовательно, оценивать пероксидазную активность цитохрома С.
Последняя, как известно [4], является необходимым этапом в развитии апоптоза по митохондриальному пути. Помимо исследовательского интереса, этот аспект может представлять особую важность для терапии злокачественных заболеваний за счет направленной стимуляции апоптоза в злокачественных клетках с использованием комплекса цитохром С-кардиолипин [3].
Так как комплекс цитохрома С-кардиолипин отличается от нативного цитохрома С по нижеследующим свойствам: (а) имеет флуоресценцию тирозиновых и трипто-фановых остатков; (б) утрачивает поглощение в полосе Соре (405-410 нм, которая определяет наличие связи Fe(heme) ■■■ S(Met80)), следовательно, это сказывается на значении квантовых выходов, которые отражают усиление свечения активированной ХЛ , без влияния на кинетику процесса; (в) характеризует пероксидазную активность и, соответственно, катализирует образование липидных радикалов в мембране. Данные липидные радикалы запускают цепной процесс перекисного окисления липидов, который наблюдается по хемилюминесценции,
