АКТИВАЦИЯ СИГНАЛЬНОГО ПУТИ HEDGEHOG В ЭПИФИЗАРНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТКАХ УВЕЛИЧИВАЕТ РОСТ КОСТИ Текст научной статьи по специальности «Биологические науки»

132

МАТЕРИАЛЫ V НАЦИОНАЛЬНОГО КОНГРЕССА ПО РЕГЕНЕРАТИВНОЙ МЕДИЦИНЕ

крови (МКПК) человека (моноцитов, NK-клеток, В-клеток, Т-цитотоксических, Т-хелперных лимфоцитов) поглощать индуцированные микровезикулы, происходящие из ме-зенхимных стволовых клеток in vitro.

МКПК выделяли из периферической крови человека методом градиентного центрифугирования в Фиколле. МВ-ЦВ получали из мезенхимных стволовых клеток (МСК) жировой ткани человека путем обработки 10 мкг/мл цитохалазина В в течение 30 мин с последующим центрифугированием: 1) 100 g — 10 мин; 2) 300 g — 20 мин; 3) 2000 g — 25 мин. МВ-ЦВ МСК окрашивали мембранным красителем DiD 5 мкМ в течение 15 мин (37°C, 5% CO2) и дважды промывали полной средой. МКПК обрабатывали 10 мкг МВ-ЦВ в течение 24 ч и детектировали поглощающую способность с помощью моноклональных антител на проточном цитофлу-ориметре-сортере BD FACS Aria III.

Результаты иммуноокрашивания показали, что 99,5 ± 0,26% моноцитов (CD14+ клетки), 69,43 ± 9,52% В-клеток (CD3-CD20+); 35,6 ± 3,83% Т-цитотоксических лимфоцитов (CD3+CD8+); 29,6 ± 3,2% NK-клеток (CD3-CD56+) и 14,5 ± 4,42% Т-хелперных лимфоцитов (CD3+CD4+) — содержат DiD в своем составе, а значит слились с МВ-ЦВ МСК. Самый высокий процент слияния/поглощения наблюдали в популяции моноцитов и В-клеток (99% и 69% соответственно). Полученные результаты были подтверждены с помощью конфокальной микроскопии, где мы наблюдали мембранный компонент МВ-ЦВ (DiD+) как на клеточной поверхности, так и внутри МКПК.

Наши данные показывают, что моноциты и В-клетки преимущественно захватывают МВ-ЦВ МСК, в то время как NK-клетки, Т-цитотоксические лимфоциты и Т-хелперы проявляют меньшую способность захватывать индуцированные микровезикулы. Работа выполнена в рамках Программы стратегического академического лидерства Казанского федерального университета (ПРИ0РИТЕТ-2030) и за счет средств гранта Российского научного фонда № 21-75-10035.

АКТИВАЦИЯ СИГНАЛЬНОГО ПУТИ HEDGEHOG В ЭПИФИЗАРНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТКАХ УВЕЛИЧИВАЕТ РОСТ КОСТИ

А.Д. Куренкова1, D. Trompet2, 3, B. Zhou3, А.П. Усанова1, T.L. Chu3, A. Are4, M. Kasper4, А.С. Чагин1 2, 3

1 Институт регенеративной медицины, Первый МГМУ им. И.М. Сеченова (Сеченовский университет), Москва, Россия

2 Институт медицины, Гётеборгский университет, Гётеборг, Швеция

3 Кафедра физиологии и фармакологии, Каролинский институт, Стокгольм, Швеция

4 Кафедра клеточной и молекулярной биологии, Каролинский институт, Стокгольм, Швеция

e-mail: n_kurenkova@mail.ru

Ключевые слова: пластинка роста, стволовые клетки, Hedgehog.

Увеличение трубчатых костей в длину происходит благодаря наличию эпифизарных пластинок роста. Недавно в пластинках роста была описана популяция стволовых клеток [1, 2]. Чтобы определить роль этих стволовых клеток в регуляции роста костей, в данной работе мы генетически и фармакологически стимулировали пролиферацию

стволовых клеток через активацию сигнального пути Hedgehog (Hh) и смотрели приводит ли это к изменению длины кости.

Для того, чтобы специфически отметить и отслеживать стволовые клетки пластинки роста, мы использовали линию мышей PthrpCreER, скрещенную с репортерной линией R26R-tdTomato [2]. Десять последовательных в/б инъекций SAG (агонист Hh сигнального пути) 30дневным мышам приводили к увеличению количества делящихся tdTomato+ клеток через 8 дней: количество клонов, состоящих из двух и трёх клеток увеличивалось на 68,9%, с одновременным падением количества одиночных клеток на 29,6% а количество пролиферирующих Ki67+tdTomato+ стволовых клеток возрастало в 5 раз. Три внутрисуставные инъекции SAG оказывали аналогичный по направлению и силе эффект.

Чтобы проверить, что влияние активации Hh на про-лиферативную активность клеток опосредовано прямым воздействием на стволовые клетки, линию PthrpCreER;R26R-tdTomato скрестили с линией Patched 1Л/Л. Через 10 дней после активации Cre-рекомбиназы абляция Patchedi приводила к появлению в пластинке больших многоклеточных клонов tdTomato+ клеток, в то время как в контроле было больше одиночных клеток. Таким образом, и фармакологическая, и генетическая активация Hh сигнального пути приводит к увеличению пролиферации стволовых клеток пластинки роста.

Для того, чтобы проверить как фармакологическая активация Hh влияет на рост кости, SAG вводили 30-дневным крысам локально во вторичный центр окостенения над пластинкой роста в бедренной кости, поскольку при внутрисуставной инъекции активация Hh может вызывать остеоартрито-подобные изменения в суставном хряще. Для пролонгации действия и фиксации в кости SAG вводили вместе с агарозными бидсами. Эксперименты с использованием Gli1-LacZ мышей подтвердили, что высвобождение SAG происходит и через неделю после имплантации. Имплантация SAG крысам приводила к увеличению Ki67+ клеток в зоне покоя пластинки роста через 1 неделю, через 1 месяц наблюдали значимое увеличение длины бедренной кости на 3% (1 ,1 мм), через полгода разница составила 4% (1,4 мм).

Таким образом, мы показали, что активация сигнального пути Hh вызывает увеличение пролиферации стволовых клеток пластинки роста, что в дальнейшем ведёт к увеличению длины конечности. Данный принцип может быть использован для коррекции нарушений роста длинных костей.

Литература:

1. Newton, P. T., Li, L., Zhou, B. et al. Nature. 2019. V. 567(7747).

P. 234-238

2. Mizuhashi, K., Ono, W., Matsushita, Y., et al. Nature 2018. V.

563(7730). P. 254-258.

ФОРМИРОВАНИЕ ПАТТЕРНА ИЗ ГИДРОКСИАПАТИТА В МАТРИЦЕ БАКТЕРИАЛЬНОЙ ЦЕЛЛЮЛОЗЫ

М.А. Кутырев, Е.И. Шишацкая, Е.В. Скорб, С.А. Уласевич

Санкт-Петербургский университет информационных технологий, механики и оптики, Санкт-Петербург, Россия

e-mail: kutyrev@infochemistry.ru

Ключевые слова: бактериальная целлюлоза, гидроксиапа-тит, кольца Лизеганга, биосовместимость.

Гены & Клетки XVII, №3, 2022